路娟娟　陳嫻　孔峰　程潔紅

摘 要：為篩選出能夠降解纖維素的纖維分解菌，為生物質(zhì)的高效利用提供生物預(yù)處理的微生物資源基礎(chǔ)。采集土壤樣品進(jìn)行混合并制成一定濃度的菌懸液，經(jīng)過初篩、純化和復(fù)篩，獲得了6株纖維素分解菌，并對(duì)這6株菌用英文字母進(jìn)行編號(hào)，分別為菌A、菌B、菌C、菌D、菌E、菌F；同時(shí)進(jìn)行了每種菌的不同溫度、不同pH值對(duì)纖維素菌酶活力的影響實(shí)驗(yàn)，并獲得了每種菌的最適溫度、最適pH值參數(shù)。菌株的最適溫度和最適pH值可以為纖維素分解菌用于生產(chǎn)、工程實(shí)踐方面提供合理的工藝參數(shù)依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 纖維素分解菌；篩選；酶活力

中圖分類號(hào)：Q819.0 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-7394（2017）06-0020-05

木質(zhì)纖維素生物質(zhì)（所有的植物和植物原料） 是地球上最豐富的且具有巨大的生物能源和大宗化學(xué)品生產(chǎn)潛力的可再生有機(jī)物質(zhì)。[1]木質(zhì)纖維素物質(zhì)主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成，三者所占的比例分別是40%、20%～30%和20%～30%。[2]由于纖維素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，又與木質(zhì)素結(jié)合形成難以被高效利用的“木質(zhì)纖維素”，這一直是限制木質(zhì)纖維素生物質(zhì)高效利用的瓶頸。因此，破壞纖維素、木質(zhì)素的牢固結(jié)構(gòu)，使纖維素、木質(zhì)素及包裹在其中的有機(jī)質(zhì)成分充分裸露而被利用，是生物質(zhì)高效利用的前提。目前，用生物方法對(duì)生物質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理是既經(jīng)濟(jì)又高效的方法。篩選出能夠降解纖維素的纖維分解菌，為生物質(zhì)的高效利用提供生物預(yù)處理的微生物資源基礎(chǔ)。同時(shí)對(duì)所篩選出的微生物進(jìn)行了溫適宜度、適宜pH值等生長條件的實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料及方法

1.1 菌種來源

采集江蘇理工學(xué)院校園灌木叢下、小樹林下腐爛葉子下面的土壤樣品，進(jìn)行混合后制成一定濃度的菌懸液備用。

1.2 培養(yǎng)基準(zhǔn)備

（1）赫奇遜噬纖維素基礎(chǔ)培養(yǎng)基：KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，F(xiàn)eCl3 0.01g，CaCl2·6H2O 0.1g，NaCl 0.1g，NaNO3 2.5g，瓊脂25g，水1 000mL[3]。

（2）羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基：KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g，CaCl2·6H2O 0.1g，NaCl 0.1g，NaNO3 2.5g，羧甲基纖維素鈉10g，瓊脂25g ，水1 000mL[4]。

（3）液體發(fā)酵培養(yǎng)基：KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，F(xiàn)eCl3 0.01g，CaCl2·6H2O 0.1g，NaCl 0.1g，NaNO3 2.5g，稻草20g，水1 000mL[5]。

1.3 羧甲基纖維素酶活性測(cè)定

羧甲基纖維素酶活力代表纖維素酶類酶活力的考察指標(biāo)，其中羧甲基纖維素酶活性測(cè)定參照文獻(xiàn)[6]中的測(cè)定方法。

2 結(jié)果及分析

2.1 菌株的選育

2.1.1菌株的初篩

將已經(jīng)融化的赫奇遜瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷凝成平板，用無菌鑷子取直徑9cm的沾過赫奇遜培養(yǎng)液的無菌濾紙一張，放在平板上，貼緊；將制作好的土壤菌懸液吸取0.1ml均勻滴加在濾紙上，放在培養(yǎng)箱中28～30℃培養(yǎng)5～7天。

2.1.2菌株的純化

將初篩濾紙上長出的特征不同的菌落分別接種到羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板上，經(jīng)過多次分離純化，共獲得了6株纖維素分解菌，將這6株菌進(jìn)行顯微鏡觀察，達(dá)到純菌株要求后，再進(jìn)行纖維素分解菌的復(fù)篩。

2.1.3菌株的復(fù)篩

將純化后的6株菌重新接種在鋪有無菌濾紙的赫奇遜瓊脂培養(yǎng)基上，進(jìn)行復(fù)篩驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，復(fù)篩后獲得6株純菌株。

2.3 適宜生長條件的確定

2.3.1 適宜溫度的確定

向每個(gè)250ml三角瓶中分別裝入200ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基，每個(gè)溫度每種菌設(shè)三個(gè)平行樣，分別接種A菌、B菌、C菌、D菌、E菌、F菌，接種后分別放在28℃、37℃、50℃的搖床上，180轉(zhuǎn)/分進(jìn)行培養(yǎng)，每天定時(shí)取樣測(cè)定羧甲基纖維素酶活性，共培養(yǎng)6天。

由圖1可知，溫度為28℃時(shí)，菌A的酶活力較低，生長緩慢，在第二天和第五天酶活力達(dá)到此溫度下相對(duì)較高的值，第六天進(jìn)入衰亡期；溫度為37℃時(shí)，菌A在第二天和第五天和第四天酶活力達(dá)到相對(duì)較高的值，并且都高于28℃下的酶活力，第六天進(jìn)入衰亡期；溫度為50℃時(shí)，菌A在第一天到第二天期間加速生長，酶活力增強(qiáng)，第二天達(dá)到最大值0.1864（mg/（ml·h））。隨后進(jìn)入衰亡階段，停止生長。第五天以后菌A酶活性又迅速增大。因此菌A最適宜的生長溫度為50℃。

由圖2可知，溫度為28℃時(shí)，菌B在第一天開始迅速生長，第二天酶活力達(dá)到最大值0.110 4（mg/（ml·h）），第二天以后進(jìn)入衰亡期，到第四天基本停止生長。溫度為37℃時(shí)，酶活力基本不會(huì)增長；50℃下酶活力在第一天到第二天迅速增長，第二天到第三天迅速下降，第三天以后呈現(xiàn)增長趨勢(shì)。在生長期內(nèi)28℃下的酶活性最大，因此菌B最適宜的生長溫度為28℃。

由圖3可知，在菌C培養(yǎng)的第二天酶活性達(dá)到最大值，不同溫度下酶活性比較，溫度為28℃時(shí)酶活力達(dá)到最大值0.116 1（mg/（ml·h）），第二天以后進(jìn)入衰亡期，酶活性隨之下降，第四天后又開始生長，酶活性增強(qiáng)。因此，菌C生長最適宜的溫度為28℃。

圖4 菌D在不同溫度下酶活力隨時(shí)間的變化情況

由圖4可知，溫度為28℃時(shí)，菌D的酶活性比較平穩(wěn)，基本不產(chǎn)生酶；溫度為37℃，第一天到第三天酶活性增加但是比較小，第三天后處于基本穩(wěn)定的狀態(tài)，比28℃下的酶活性強(qiáng)一點(diǎn)；溫度為50℃時(shí)，第一天到第三天，酶活性小幅度增加，第三天到第四天酶活力迅速增強(qiáng)，達(dá)到最大值0.2148（mg/（ml·h）），第四天后迅速下降，到第六天基本停止生長。因此菌D生長最適宜的溫度為50℃。

由圖5可知，菌E在第一天到第二天迅速生長，在第二天達(dá)到酶活力的峰值，第二天以后產(chǎn)酶能力下降，到第四天基本停止生長，進(jìn)入衰亡期。在生長階段28℃下菌E的酶活力與其他溫度下的酶活力比相對(duì)較高，因此菌E的生長最適合的溫度是28℃。

由圖6可知，菌F在28℃下，第二天產(chǎn)酶達(dá)到峰值為0.122 6mg/（ml·h），之后酶活力下降到第三天后進(jìn)入衰亡階段，酶活力不再變；在37℃下酶活力較低且基本不產(chǎn)酶；在50℃下，菌F在第二天以后迅速生長，產(chǎn)酶能力增強(qiáng)，到第四天達(dá)到峰值0.3062mg/（ml·h），第四天后產(chǎn)酶能力下降，直到第六天酶活力降至最低不再生長。不同溫度下比較達(dá)到的峰值，在50℃下，菌F的酶活力更強(qiáng)，因此菌F最適宜生長的溫度是50℃。

2.3.2 適宜pH值的確定

向每個(gè)250ml三角瓶中分別裝入200ml液體發(fā)酵培養(yǎng)基，設(shè)置三個(gè)pH值：pH4.2、pH6.0、pH7.2；每個(gè)溫度每種菌設(shè)三個(gè)平行樣，分別接種A菌、B菌、C菌、D菌、E菌、F菌，接種后分別放在28℃的搖床上，180轉(zhuǎn)/分進(jìn)行培養(yǎng)，每天定時(shí)取樣測(cè)定羧甲基纖維素酶活性，共培養(yǎng)6天。

由圖7可知，菌A 在不同pH下的酶活力大小不同。pH為4.2時(shí)，菌A在第二天酶活力達(dá)到最大值為0.182 8mg/（ml·h），之后一直迅速下降，到第四天酶活力降至最低；pH為6時(shí)，酶活力在第三天達(dá)到最大值，之后迅速下降；pH為7.2時(shí)，菌A在第四天達(dá)到最大值，之后迅速下降直至最低。不同pH下酶活力的峰值比較，在pH為4.2時(shí)，菌A的酶活力最強(qiáng)，因此菌株A生長最適pH是4.2。

由圖8可知，菌B 在不同pH下的酶活力大小不同。pH為4.2時(shí)，菌A在第二天和第三天酶活力較高；pH為6時(shí)，酶活力在第三天時(shí)較高；pH為7.2時(shí)，菌B在第四天較高。不同pH下酶活力的峰值比較，在pH為4.2時(shí)，菌B的酶活力最強(qiáng)，因此菌B適合生長的pH為4.2。

由圖9可知，菌C 在不同pH下的酶活力大小不同。pH為4.2時(shí)，菌C酶活力在第三天時(shí)較高；pH為6時(shí)，酶活力在第三天時(shí)較高，為0.076 8mg/（ml·h）；pH為7.2時(shí)，菌C在第四天酶活力較高。不同pH酶活力大小比較下，菌C在pH為6時(shí)酶活力最大，因此菌C生長最適pH為6。

由圖10可知，菌D 在不同pH下的酶活力大小不同。菌D在第三天時(shí)酶活力較高，不同pH下比較，當(dāng)pH為4.2時(shí)，菌D的酶活力最大為0.204 4mg/（ml·h），因此菌D生長最適宜的pH 為4.2。

由圖11可知，菌E 在不同pH下的酶活力大小不同。當(dāng)pH為4.2時(shí)，酶活力變化不大且較低；當(dāng)pH為6時(shí)酶活力在第四天達(dá)到最大值；當(dāng)pH為7.2時(shí)，酶活力在第三天達(dá)到最大值0.1169mg/（ml·h）。因此，菌E生長最適宜的pH 為7.2。

由圖12可知，菌F在不同pH下的酶活力大小不同。當(dāng)pH為4.2時(shí)，酶活力在第二天達(dá)到最大值0.128 2mg/（ml·h）；當(dāng)pH為6時(shí)，相比其他pH下酶活力較低且變化不大；當(dāng)pH為7.2時(shí)，菌F在第四天的酶活力達(dá)到最大值且小于pH為4.2時(shí)的最大酶活力。因此，菌F生長最適宜的pH為4.2。

3 結(jié) 論

（1）通過初篩、純化和復(fù)篩獲得了的6株纖維素分解能力較強(qiáng)的纖維素分解菌。

（2）不同的菌株其生長條件不一，菌A的最適生長溫度為50℃，最適pH值為4.2；菌B的最適生長溫度為28℃，最適pH值為4.2；菌C的最適生長溫度為28℃，最適pH值為4.2；菌D的最適生長溫度為50℃，最適pH值為4.2；菌E的最適生長溫度為28℃，最適pH值為7.2；菌F的最適生長溫度為50℃，最適pH值為4.2。菌株的最適溫度和最適pH值可以為纖維素分解菌用于生產(chǎn)、工程實(shí)踐方面提供合理的工藝參數(shù)依據(jù)。

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Screening of Cellulose-decomposing Microorganisms and Their Growth Factors

LU Juan-juan， CHEN Xian， KONG Feng， CHENG Jie-hong

（School of Chemical and Environmental Engineering， Jiangsu University of Technology， Changzhou， 213001， China）

Abstract： We collected the soil samples， mixed these samples and dispensed the certain concentration of microorganism suspension. By the first screening， purification and the second screening， six strains of cellulose-decomposing have been obtained. The six strains were named strain A， strain B， strain C， strain D， strain E， strain F in accordance with English letters. The experiment had been done about the influence of the different temperature and the different pH value to each strain. The optimum temperature and the optimum pH value of the six strains have been obtained.

Key words： cellulose-decomposing microorganisms； screening； enzyme activity

責(zé)任編輯 趙文清