吳萍 郭俊霞 李青苗 夏燕莉 張美 肖特 方清茂

摘要 [目的] 建立適用于白芷種子的SDS-PAGE蛋白質(zhì)樣品提取方法。[方法]比較5種提取方法所獲得白芷種子總蛋白質(zhì)產(chǎn)量以及SDS-PAGE電泳的譜帶數(shù)目、強(qiáng)度和電泳分辨率等方面的差異。[結(jié)果] 方法a所提蛋白質(zhì)含量高，雜質(zhì)少，電泳譜帶清晰；方法b所提蛋白質(zhì)溶液電泳譜帶清晰，分辨率較高，但提取含量較低；方法c和d所提蛋白質(zhì)雜質(zhì)較多，純度不高，分辨率較低；方法e所提蛋白質(zhì)純度較高，但蛋白條帶缺失較多。[結(jié)論]方法a提取白芷種子蛋白質(zhì)的效果最好，所提蛋白效率較高，雜質(zhì)少，電泳譜帶清晰，分辨率高，譜帶數(shù)多，優(yōu)于其他提取法。

關(guān)鍵詞 白芷種子；蛋白質(zhì)提取；聚丙烯酰氨凝膠電泳

中圖分類(lèi)號(hào) S567.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）06-0118-03

Comparison of Protein Extraction Methods for Angelica dahurica Seeds

WU Ping， GUO Jun-xia， LI Qing-miao et al （Sichuan Academy of Traditional Chinese Medicine Sciences， Chengdu， Sichuan 610041）

Abstract [Objective] To establish a suitable protein extraction protocol for total proteins extraction from Angelica dahurica seeds. [Method] We compared the total protein yield and SDS-PAGE electrophoretic band number and strength， lectrophoresis resolution by five different methods. [Result] Method a had higher protein content， less impurity and clearer electrophoresis band. Method b had clearer electrophoresis band， higher resolution， but lower protein content. Methods c and d had more impurity， lower purity and resolution. Method e had higher protein purity， but more lack of protein bands. [Conclusion] Method a has the best extraction effects of protein from A. dahurica seeds， which has higher protein extraction efficiency， less impurity， clearer band， higher resolution， more band number. Thus， method a is superior to other four methods.

Key words Angelica dahurica seed；Protein extraction；Polyacrylamide gel electrophoresis

種子是遺傳因素的載體之一。受遺傳基因控制的蛋白質(zhì)分子普遍存在于種子內(nèi)，并在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用[1]。種子蛋白是基因表達(dá)的產(chǎn)物，能在種子內(nèi)積累到很大量而不降解，其電泳譜帶具有高度穩(wěn)定性、專(zhuān)一性和疊加性，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用[2]。種子蛋白作為一種遺傳標(biāo)記被越來(lái)越多地應(yīng)用于種、屬關(guān)系，種間或種內(nèi)遺傳多樣性分析，品種鑒定、物種起源及植物種質(zhì)資源的研究[3]。1991年，國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)將蛋白質(zhì)電泳方法正式定為標(biāo)準(zhǔn)的品種鑒定方法，并納入種子檢驗(yàn)規(guī)程[4]。目前，蛋白質(zhì)電泳技術(shù)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物、蔬菜、牧草等種子的品種鑒定[5]、純度測(cè)定[6]、親緣關(guān)系分析[7]。但藥用植物種子的蛋白質(zhì)電泳研究報(bào)道甚少，而關(guān)于白芷種子蛋白質(zhì)電泳的研究鮮有報(bào)道。

白芷為傘形科植物白芷[Angelica dahurica （Fisch. ex Hoffm.） Benth. et Hook.f]或杭白芷[Angelica dahurica（Fisch. ex Hoffm.） Benth. et Hook. f. var. formosana （Boiss.） Shan et Yuan]的干燥根，因初生根桿為芷，色白，故名白芷，以根入藥，其性溫，氣芳香，味辛、微苦，歸胃、結(jié)腸、肺經(jīng)，具有散風(fēng)除濕、通竅鎮(zhèn)痛、消腫排膿等功效[8]，可藥食兩用。白芷以種子繁殖為主，多采用育苗移栽，在常規(guī)保存手段下，隔年陳種子發(fā)芽率不高，而制約種子發(fā)芽率的原因尚不清楚。細(xì)胞或組織中受體分子、信號(hào)分子等參與基因表達(dá)調(diào)控，即基因調(diào)控均需要蛋白質(zhì)的參與[9]，陳年白芷種子發(fā)芽率降低也是基因表達(dá)調(diào)控的結(jié)果。蛋白質(zhì)提取是電泳

的第1步，蛋白質(zhì)樣品制備的好壞直接決定結(jié)果的成敗。筆者以白芷種子為材料，采用5種蛋白質(zhì)提取方法進(jìn)行比較分析，以期優(yōu)化出一套適于白芷種子的蛋白質(zhì)提取方法，為探索白芷種子衰老等理論機(jī)制的研究提供技術(shù)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試白芷（Angelica dahurica）種子來(lái)源于遂寧市永興鎮(zhèn)中脊村，2015年采收。

1.2 主要儀器與試劑

Mini-PROTEAN Tetra小型垂直電泳槽、PowerPacTM HC高電流電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-rad伯樂(lè)公司；Heraeus Multifuge X3低溫離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸鈉（SDS）、尿素、硫脲、3-[3-（膽酰胺丙基）二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽（CHAPS）、三氯乙酸（TCA）、β-巰基乙醇（2-ME）、TEMED、過(guò)硫酸銨均購(gòu)自Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 蛋白質(zhì)提取。

方法a：取種子粉碎，過(guò)40目篩，稱(chēng)0.1 g 于離心管中，加入2 mL預(yù)冷的提取液A （7 mol/L尿素，2 mol/L 硫脲，4% CHAPS，40 mmol/L Tris-base， 2% 2-ME），混懸后冰上靜置3～4 h，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，上清液置于-80 ℃冰箱中備用。

方法b：取種子粉碎，過(guò)40目篩，稱(chēng)0.1 g于離心管中，加入預(yù)冷的提取液B（100 mmol/L HEPES， pH 7.5， 5 mmol/L EDTA， 5 mmol/L EGTA， 10 mmol/L Na3VO4， 10 mmol/L NaF， 5% 甘油， 2% 2-ME） 2 mL，混懸后冰上靜置3～4 h，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，上清液置于-80 ℃冰箱中備用。

方法c：取種子粉碎，過(guò)40目篩，稱(chēng)0.1 g于離心管中，加入2 mL預(yù)冷的提取液C（150 mmol/L Tris-HCl， pH 8.0， 25% 甘油，2% 2-ME），混懸后冰上靜置3～4 h，4 ℃、12 000 r/min 離心20 min，上清液置于-80 ℃冰箱中備用。

方法d：取種子粉碎，過(guò)40目篩，稱(chēng)0.1 g于離心管中，加入稀釋8倍的濃縮膠緩沖液2 mL [含4.95%丙烯酰胺混合液（29∶1），12.5% 0.5 mol/L Tris-HCl，pH 6.8，0.1% SDS，0.1% 過(guò)硫酸銨，1% TEMED]，冰浴30 min后，60 ℃水浴40 min，冷卻，10 000 r/min離心15 min取上清，-80 ℃冰箱中備用。

方法e：每份材料取研磨后過(guò)40目篩的種子粉末0.1 g于離心管中，加入2 mL樣品提取液E （50 mmol/L Tris-HCl， pH 6.8，2%SDS，5% 2-ME，10%甘油，0.1%溴酚蘭），混勻，室溫放置1～2 h。10 000 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行電泳，-80 ℃冰箱中備用。上樣時(shí)100 ℃沸水加熱4 min 后進(jìn)行。

1.3.2 紫外分析儀定量測(cè)定蛋白質(zhì)含量。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用紫外分析儀定量測(cè)定上述樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.3.3 聚丙烯酰氨凝膠電泳。

采用SDS-PAGE法，分離膠12%，濃縮膠5%，垂直平板電泳，加樣量為10 μL。電泳緩沖液為T(mén)ris-Gly（pH 8.3）系統(tǒng)，起始電壓75 V，在指示劑進(jìn)入分離膠后改為150 V，恒壓電泳，待指示劑至膠板下沿1 cm左右停止電泳。

1.3.4 染色與脫色。

膠剝離后放入加有R250染色液的染色皿中，染液漫過(guò)膠即可，置于搖床上，轉(zhuǎn)速約為45 r/min，時(shí)間約1 h，完成后染液倒去并用水洗去染液。取出染色過(guò)的膠放于加有脫色液的染缸里，脫色液漫過(guò)膠即可，置于搖床上，轉(zhuǎn)速約為45 r/min，本底色脫凈，條帶清晰可見(jiàn)即可，完成后倒掉脫色液。

1.3.5 圖譜分析。用Quantity one軟件進(jìn)行拍照并做圖像分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)產(chǎn)量的比較

蛋白質(zhì)產(chǎn)量和純度是評(píng)價(jià)提取方法的重要指標(biāo)。產(chǎn)量越高，蛋白質(zhì)提取越完全。蛋白質(zhì)純度不同，對(duì)電泳的影響也不同，較多的雜質(zhì)將嚴(yán)重影響電泳結(jié)果。因此，蛋白質(zhì)產(chǎn)量越高，純度越好，提取方法越好。

由圖1可知，提取方法a、b、c、d、e的蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果分別為93.2，52.5，66.4，90.3，40.6 mg/g。其中，方法a所提的蛋白質(zhì)含量最高，為93.2 mg/g，方法e所提的蛋白質(zhì)含量最低，為40.5 mg/g，極差為52.7 mg/g。

2.2 電泳結(jié)果比較

圖2為5種白芷種子蛋白質(zhì)提取方法的SDS-PAGE電泳圖譜。結(jié)果顯示，不同的提取方法所得的PAGE圖譜各異，存在條帶數(shù)目、強(qiáng)度、清晰度等方面的差異。泳道A譜帶較全且清晰；泳道B譜帶高分子量蛋白質(zhì)有缺失，條帶較弱；泳道C、D、E譜帶缺失較多，其中泳道C出現(xiàn)紋理狀，樣品中雜質(zhì)較多；泳道D條帶模糊且背景較深，拖尾嚴(yán)重，可能是由于樣品中雜質(zhì)和不溶性蛋白質(zhì)較多；泳道E條帶較弱，蛋白質(zhì)缺失嚴(yán)重。

由表1可知，白芷種子的SDS-PAGE電泳圖譜共有15條譜帶，均為中、低分子量蛋白質(zhì)，主要集中在14.4～66.2 kD。方法a譜帶數(shù)目最多為14條，其次是方法b有11條，方法c有6條，而方法d和e均僅有4條。不同泳道譜帶的分子量見(jiàn)圖3。結(jié)果顯示，方法a提取的蛋白質(zhì)（泳道A）種類(lèi)較多，提取效率較高，這與蛋白質(zhì)產(chǎn)量的分析結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

種子保存的核心問(wèn)題是如何控制種子的生命力[10]。蛋白質(zhì)在種子抗衰老過(guò)程中作用很大，貯藏過(guò)程中蛋白質(zhì)分解是種子老化乃至活力喪失的明顯特征及原因[11]。種子活力在基因水平上的差異也是通過(guò)基因表達(dá)的產(chǎn)物蛋白體現(xiàn)出來(lái)的。聚丙烯酰胺凝膠電泳是常用研究蛋白質(zhì)表達(dá)的方法之一，具有設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方便和分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。蛋白質(zhì)樣品的提取是電泳的第一步，直接決定結(jié)果的成敗。該研究針對(duì)白芷種子蛋白質(zhì)樣品制備設(shè)計(jì)5種方法，通過(guò)蛋白質(zhì)產(chǎn)量及電泳結(jié)果的分析，得出方法a更適合于白芷種子蛋白質(zhì)的制備，可能是因?yàn)榉椒╝中蛋白質(zhì)提取液含有尿素和硫脲，兩者發(fā)揮協(xié)同作用增強(qiáng)了蛋白質(zhì)的溶解，甚至可以溶解一些非水溶的貯藏蛋白質(zhì)。

蛋白質(zhì)產(chǎn)量和純度是評(píng)價(jià)提取方法的重要指標(biāo)[1]。該研究以白芷種子為材料，選取5種不同的蛋白質(zhì)提取方法進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，方法a和d所提蛋白質(zhì)含量明顯高于其他3種提取方法。其中，方法d提取的蛋白質(zhì)溶液，電泳譜帶背景較深，雜質(zhì)較多，分辨率較低；而方法a和b所提蛋白質(zhì)溶液，電泳譜帶清晰，分辨率較高；雖然方法a所提蛋白質(zhì)溶液的電泳譜帶在部分條帶出現(xiàn)高豐度蛋白質(zhì)，致使譜帶展寬，但對(duì)電泳的分辨率影響不大。方法c雖然所提蛋白質(zhì)含量高于方法b和e，但雜質(zhì)較多，提取純度較低，影響電泳的分辨率。方法e雖然所提蛋白質(zhì)純度較高，但蛋白質(zhì)損失嚴(yán)重，蛋白質(zhì)條帶缺失較多。因此，綜合各方面情況，方法a提取白芷種子蛋白質(zhì)的效果最好，其提取效率高，雜質(zhì)少，電泳譜帶清晰，分辨率高，譜帶數(shù)多。

參考文獻(xiàn)

[1] 李曉琳，邵愛(ài)娟，陳敏，等.酸漿種子蛋白提取方法的比較研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16（1）：14-17.

[2] 馬瑞君，王欽，孫坤，等.云南沙棘種子蛋白譜帶多樣性分析[J].蘭州大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，38（3）：78-81.

[3] 胡志昂，王洪新.蛋白質(zhì)多樣性和品種鑒定[J].植物學(xué)報(bào)，1991，33（7）：556-564.

[4] 國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)（ISTA）.國(guó)際種子檢驗(yàn)規(guī)程[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996：196.

[5] 蘭海燕，李立會(huì).蛋白質(zhì)凝膠電泳技術(shù)在作物品種鑒定中的應(yīng)用[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，35（8）：916-920.

[6] 王文宏，朱旭輝.應(yīng)用蛋白質(zhì)凝膠電泳法鑒定玉米種子純度的探討[J].雜糧作物，2002，22（1）：57-58.

[7] 吳浩，彭昕，張煜炯，等.蛋白質(zhì)電泳指紋圖譜在各產(chǎn)地貝母親緣關(guān)系研究中的應(yīng)用[J]. 中成藥，2015，37（8）：1757-1761.

[8] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：第1部[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010.

[9] GRG A，WEISS W，DUNN M J. Current two-dimensional eletrophoresis technology for proteomics[J].Proteomics，2004，4：3665-3685.

[10] 王文軍，景新明.種子蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組的研究[J].植物學(xué)通報(bào)，2005，22（3）：257-266.

[11] ABDUL-BAKI A A.Biochemical aspects of seed vigor[J].Hortscience，1980，15：765-771.