何天友 沈少炎 瞿印權(quán) 陳凌艷 劉穎嘉 榮俊冬 鄭郁善

摘要 [目的]研究20種荷花材料遺傳多樣性和親緣關(guān)系。[方法]利用ISSR-PCR體系篩選出16條多態(tài)性引物，并利用16條ISSR引物對20種荷花材料進行PCR擴增。[結(jié)果]16條引物擴增出225個位點，多態(tài)性位點占75.56%。通過Popgene32軟件計算出20個荷花品種間的相似性系數(shù)為0.577 8～0.951 1，平均值為0.779 6。通過聚類分析將20個荷花品種分為兩大類，白洋淀紅蓮和冬瓜蓮可歸為一類，其他18個品種劃分為第二類。[結(jié)論]ISSR標記技術(shù)可有效應用于不同荷花品種的遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系的鑒定。

關(guān)鍵詞 荷花；ISSR；聚類分析；遺傳多樣性

中圖分類號 S188+.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）06-0128-05

Genetic Diversity of 20 Nelumbo nucifera Gaertn.Varieties Revealed by ISSR Analysis

HE Tian-you1，SHEN Shao-yan1，QU Yin-quan2，ZHENG Yu-shan1，2* et al （1.College of Landscape，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002；2.College of Forestry，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002）

Abstract [Objective]To study the genetic diversity of 20 species of plant samples in Nelumbo nucifera Gaertn..[Method]16 primers were screened by using ISSR amplification system，and the DNA was used to amplify of 20 species of plant samples with 16 primers.[Result]16 primers produced 225 loci， the percentage of polymorphic loci was up to 75.56%.The genetic similarity coefficient of 20 species in squash ranged from 0.577 8 to 0.951 1，which was calculated by Popgene32.20 varieties by UPMGA analysis could be clustered into two groups，the first group included Baiyangdianhonglian and Donggualian； the rest of varieties was included in second group.[Conclusion]ISSR molecular markers could be effectively used in genetic diversity and fingerprint analysis for 20 species of plant samples in Nelumbo nucifera Gaertn..

Key words Nelumbo nucifera Gaertn.；ISSR；Cluster analysis；Genetic diversity

荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.）是睡蓮科蓮屬多年生大型水生草本[1]，近年來對荷花藥理[2-4]、園林應用[5]、分子遺傳標記[6-8]等方面已有不少研究。荷花是起源較早的被子植物之一，現(xiàn)有中國蓮種系、中國蓮亞種蓮種系和中美雜種蓮種系3個種系[9]，種質(zhì)資源十分豐富且栽培歷史悠久[10]。最原始的荷花品種是野生紅蓮，之后逐漸演化出眾多花型、花色、株型各不相同的荷花品種，目前，我國培育出的具有觀賞價值的優(yōu)良品種荷花已達300種[10]。張行言等[9]按照觀賞植物的“二元分類法”原則，編制了新的荷花品種分類系統(tǒng)，將種源作為1級品種分類標準，按株型、花型、花色的順序，共分為3系、6群、16類、48型，現(xiàn)今暫包括608個品種，新的分類系統(tǒng)符合荷花品種的演化趨勢，便于實際觀賞應用。隨著現(xiàn)代植物分子生物學的快速發(fā)展，分子標記技術(shù)被廣泛應用于遺傳多樣性以及指紋圖譜構(gòu)建的研究，目前應用較為廣泛的分子標記技術(shù)有RFLP、RAPD、AFLP、ISSR、SRAP[11-15]等。盡管DNA分子標記技術(shù)種類多，但是各有優(yōu)缺點，如 RFLP 需要放射性同位素，AFLP 需要特定的酶切與連接，RAPD 和 AP-PCR 的穩(wěn)定性及重復性不好等[16]?，F(xiàn)階段用

于荷花遺傳多樣性和親本鑒定研究的技術(shù)主要有RAPD和ISSR分子標記技術(shù)[9-10，17]。

ISSR（Inter Simper Sequence Repeat，簡單重復序列標記）是由加拿大的Zietkiewicz等提出來的，是以SSR來設(shè)計引物，對引物3′或5′端錨定，通過引物對基因組進行擴增的標記系統(tǒng)。ISSR具有穩(wěn)定、高效、重復性高、DNA用量少等特點[16，18-20]。ISSR相較于RAPD穩(wěn)定性更好，能夠檢測出更多種質(zhì)資源間的遺傳多態(tài)性及差異性[21-22]。因此，ISSR標記技術(shù)被廣泛用于生物的遺傳多態(tài)性研究[23-25]、優(yōu)良品種鑒定[26]、構(gòu)建遺傳圖及系統(tǒng)分類學研究等諸多領(lǐng)域，且對于構(gòu)建背景種質(zhì)狹窄的指紋圖譜具有很大潛力[27]。針對20個不同地域的荷花品種，進行ISSR分子標記和遺傳多樣性分析，為荷花品種及種質(zhì)資源的鑒定提供試驗基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的20種荷花材料來源于福建省建寧縣蓮子科學研究所，荷花品種及來源見表1。每個品種采樣3片以上，放在自封袋中，加入硅膠干燥，盡快轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱，以備DNA提取。

1.2 方法

1.2.1 總DNA的提取與檢測。

采用天根公司植物基因組總DNA提取試劑盒（北京，DP305-02）提取荷花基因組總DNA，在此基礎(chǔ)上，增加了GP1、GP2緩沖液及三氯甲烷的用量。用微量紫外分光光度計檢測提取的DNA濃度，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和Sensi Ansys凝膠分析軟件檢測提取的DNA質(zhì)量及完整性[28-30]，后將總DNA樣品置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物篩選。

用已經(jīng)優(yōu)化好的ISSR-PCR體系，對哥倫比亞大學（University of British Columbia Biotechnology，UBC）提供的100條通用引物序列進行篩選，最終篩選出重復性、多態(tài)性和穩(wěn)定性都較好引物16條，引物序列如表2所示。

1.2.3 ISSR 反應體系及程序。

參照黃宇等[31]優(yōu)化的荷花ISSR反應體系并稍作修改，具體擴增反應體系如下：20 μL PCR反應體系中，包含2 μL的10×PCR Buffer，0.4 mmol/L dNTPs，3.5 mmol/L Mg2+，1.5 U Taq DNA聚合酶，0.4 μmol/L 引物，3 ng模板DNA；PCR的擴增程序為94 ℃ 2 min預變性；94 ℃ 30 s變性，54.5 ℃ 30 s退火，72 ℃ 1 min延伸，45個循環(huán)；72 ℃ 7 min延伸，4 ℃下保存。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理。

經(jīng)過電泳分離后，凝膠同一位置上出現(xiàn)的條帶具有同源性，且屬于同一位點，對所得的擴增結(jié)果進行記錄，以1代表有條帶，0代表沒有條帶，建立一個二元0-1矩陣，輸入到Excel表格中。借助Popgene32軟件[32]得出20個荷花品種遺傳多樣性參數(shù)，進行遺傳多樣性分析，再使用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理，根據(jù)遺傳距離采用UPGMA進行聚類分析，繪制成ISSR樹狀聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果 用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測試劑盒提取的各品種荷花DNA，結(jié)果顯示DNA條帶清晰明亮，沒有發(fā)生明顯的拖尾現(xiàn)象，點樣孔附近也較為干凈，表明雜質(zhì)基本去除干凈（圖1），符合ISSR擴增的試驗要求，經(jīng)紫外分光光度計檢測各荷花品種DNA濃度均為20～50 ng/μL。

2.2 引物篩選擴增結(jié)果

利用最終篩選出的18條引物對20個荷花品種DNA進行多態(tài)性擴增，結(jié)果如表2所示，共擴增出225個ISSR位點，多態(tài)性位點有170個，多態(tài)性位點百分率為75.56%，擴增片段大小為300～3 000 bp，每個引物擴增的位點數(shù)為9～23個，平均每個引物擴增出14.1個位點，UBC836擴增的位點最多為23個，擴增出最少的位點為9個，多態(tài)性位點是UBC857（圖2、3）。用來衡量種群間遺傳變異情況的重要指標就是多態(tài)性百分比。多態(tài)性百分比越高，一個種群適應能力強，反之則弱。試驗表明20個荷花品種的多態(tài)性都較高，遺傳基礎(chǔ)范圍廣，適應性強，遺傳多樣性比較豐富。

2.3 荷花品種的遺傳多樣性水平分析

遺傳距離越小則遺傳相似系數(shù)越大，親緣關(guān)系越近，荷花品種間的差異程度越小。利用Popgene32軟件分析，獲得了20個荷花品種間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，各荷花品種間的遺傳相似系數(shù)為0.577 8～0.951 1，平均值為0.779 6。說明20個荷花品種間有一定的遺傳差異，這種差異不大，它們之間存在著一定的親緣關(guān)系。十里荷和白洋淀紅蓮之間的親緣關(guān)系最遠，遺傳相似系數(shù)為0.577 8，遺傳距離為0.548 6；紅花建蓮和白花建蓮之間的遺傳相似系數(shù)為0.951 1，遺傳距離為0.050 1。利用Popgene32軟件進行計算分析，結(jié)果表明20個荷花品種的觀測等位基因數(shù)為1.155 6個，平均有效等位基因數(shù)為1.336 3，平均Neis基因多樣性指數(shù)為0.209 4，平均Shannon多樣性指數(shù)為0.328 4，說明20個荷花品種間存在著豐富的遺傳多樣性。

2.4 荷花品種的ISSR聚類分析

利用SPSS 18.0軟件對20個荷花品種進行遺傳距離和遺傳相似度的聚類分析。利用UPGMA法對20個荷花品種進行聚類分析得到樹狀聚類圖。從圖4可以看出，在遺傳距離閾值0.378 5處將20個品種分為兩類，第一類為白洋淀紅蓮和冬瓜蓮，剩余品種為第二類。由于白洋淀紅蓮和冬瓜蓮同采于一個種源地，所以兩者的遺傳距離較近。在遺傳距離閾值0.488 8處可把20個荷花品種分為4個小組，第1組為白洋淀紅蓮和冬瓜蓮，第2組為太空3號和太空4號，第3組有建選21號，第4組為剩余品種?？煽闯龊苫ㄆ贩N間的親緣關(guān)系與地域分布沒有顯著關(guān)系，可能與荷花的后期培育有關(guān)。

3 討論與結(jié)論

ISSR標記具有多態(tài)性內(nèi)容豐富、信息量大、受外界環(huán)境影響較小、研究結(jié)果較穩(wěn)定等優(yōu)點[33]。然而關(guān)于ISSR分子標記技術(shù)在荷花遺傳多樣性分析上的研究報道不多。該試驗采用ISSR分子標記技術(shù)對20個荷花品種進行遺傳多樣性分析，通過16條引物共在20個荷花品種中擴增出225個位點，其中多態(tài)性位點170個，多態(tài)性位點百分率為75.56%。此外，進一步分析了6個地域種群的遺傳多樣性，結(jié)果表明湖南湘潭種群的遺傳多樣性最大，浙江杭州及浙江金華種群最小，說明湖南湘潭種群內(nèi)的遺傳分化程度最大，浙江杭州及金華種群的遺傳分化程度最低。種群間的遺傳分化系數(shù)能劃分群體間及群體內(nèi)遺傳變異的相對大小，是闡述群體遺傳變異的主要來源[33]。

該試驗利用ISSR分子標記技術(shù)揭示了荷花20個品種間的遺傳多樣性。20個荷花品種間的Neis基因多樣性指數(shù)為0.209 4，遺傳相似系數(shù)介于0.577 8～0.951 1。聚類分析將20個荷花品種分為兩大類四小組，該研究可為荷花種質(zhì)資源的收集和品種間親緣關(guān)系鑒定提供一定科學依據(jù)。

參考文獻

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志：第27卷[M].北京：科學出版社，1996：3-4.

[2] ONO Y，HATTORI E，F(xiàn)UKAYA Y，et al.Anti-obesity effect of Nelumbo nucifera leaves extract in mice and rats[J].Journal of ethnopharmacology，2006，106（2）：238-244.

[3] RAI S，WAHILE A，MUKHERJEE K，et al.Antioxidant activity of Nelumbo nucifera（sacred lotus） seeds[J].Journal of ethnopharmacology，2006，104（3）：322-327.

[4] 石書紅，張輝，莊英幟，等.甲基蓮心堿對長春新堿抑制人胃癌細胞增殖作用的影響[J].臨床腫瘤學雜志，2008，13（5）：427-431.

[5] 張玉環(huán).荷花的花文化及園林應用[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（4）：64-65.

[6] 魏英輝，黃新忠，羅銀華，等.子蓮新品種：“建選17號”親本分子鑒定[J].江西農(nóng)業(yè)學報，2007，19（2）：43-45.

[7] 汪嵐，韓延闖，彭欲率，等.ISSR標記技術(shù)在蓮藕遺傳研究中的運用[J].氨基酸和生物資源，2004，26（3）：20-22.

[8] 鄭寶東，鄭金貴，曾紹校.中國蓮子種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析[J].中國食品學報，2006，6（1）：138-143.

[9] 張行言，王其超.熱帶型荷花的發(fā)現(xiàn)與荷花品種分類系統(tǒng)[J].中國園林，2006，22（7）：82-85.

[10] 中國科學院武漢植物研究所.中國蓮[M].北京：科學出版社，1987.

[11] 馬小軍，汪小全，肖培根，等.人參農(nóng)家類型的AFLP指紋研究[J].中國中藥雜志，2000，25（12）：707.

[12] ZHANG K Y B，LEUNG H W，YEUNG H W，et al.Differentiation of Lyciun barbarum from its related lycum species using random amplified polymorphic DNA [J].Planta Med，2001，67（4）：379-381.

[13] MRCHEN M，CUGUEN J，MICHAELIS G，et al.Abundance and length polymorphism of microsatellite repeats in Beta vulgaris L.[J].Theoretical and applied genetics，1996，92（3）：326-333.

[14] BROUN P，TANKSLEY S D.Characterization and genetic mapping of simple repeat sequences in the tomato genome[J].Molecular & general genetics mgg，1996，250（1）：39-49.

[15] WILLIAM J G K，KUBELIK A R，LIVAK K J，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers[J].Nucl Acid Res，1990，18（22）：6531-6535.

[16] 盧家仕，卜朝陽，呂維莉，等.不同產(chǎn)地石斛屬種質(zhì)資源的 ISSR 遺傳多樣性分析[J].中草藥，2013，44（1）：96-100.

[17] 鄭連群，張慶寶，符秀玉.荷花品種分類研究現(xiàn)狀及建議[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（15）：221-222.

[18] KASTURE A，KRISHNAMURTHY R，RAJKUMAR K.Genetic variation in the endangered Indian sweet flag （Acorus calamus L.） estimated using ISSR and RAPD markers[J].Journal of applied research on medicinal & aromatic plants，2016，3（3）：112-119.

[19] 林立，王志龍，付濤，等.39個櫻花品種親緣關(guān)系的ISSR分析[J].植物研究，2016，36（2）：297-304.

[20] 曾兵.鴨茅種質(zhì)資源遺傳多樣性的分子標記及優(yōu)異種質(zhì)評價[D].雅安：四川農(nóng)業(yè)大學，2007.

[21] 張杰.蒙古櫟地理種源遺傳多樣性的研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學，2005.

[22] 王國霞.古銀杏雄株遺傳多樣性的ISSR分析及花粉用優(yōu)良單株初步選育研究[D].南京：南京林業(yè)大學，2007.

[23] 姚明哲.利用ISSR和EST-SSR標記研究中國茶樹資源的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)[D].杭州：浙江大學，2009.

[24] 張黨權(quán)，田華，謝耀堅，等.桉樹4個種遺傳多樣性的ISSR分析[J].中南林業(yè)科技大學學報，2010，30（1）：12-17.

[25] 李昕珈，吳明根，潘剛.8個青花菜栽培品種的ISSR和SSR的遺傳多樣性分析[J].長江大學學報（自然科學版），2010，7（1）：53-55.

[26] FANG D Q，ROOSE M L.Identification of closely related citrus cultivars with inter-simple sequence repeat markers[J].Theor Appl Genet，1997，95（3）：408-471.

[27] 劉威，馮晨靜，楊建民，等.杏ISSR反應體系的優(yōu)化和指紋圖譜的構(gòu)建[J].果樹學報，2005，22（6）：626-629.

[28] 繆恒彬，陳發(fā)棣，趙宏波，等.應用ISSR對25個小菊品種進行遺傳多樣性分析及指紋圖譜構(gòu)建[J].中國農(nóng)業(yè)科學，2008，41（11）：3735-3740.

[29] 張敏，黃蘇珍.鳶尾屬種質(zhì)資源的ISSR分析[J].南京農(nóng)業(yè)大學學報，2008，31（4）：43-48.

[30] 隋春，魏建和，陳士林，等.柴胡ISSR-PCR反應體系的建立與優(yōu)化[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19（8）：1837-1839.

[31] 黃宇，何天友，榮俊冬，等.荷花ISSR-PCR反應體系的建立及優(yōu)化[J].亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2009，5（4）：284-288.

[32] YEH F C，YANG R，BOYLE T J，et al.POPGENE 32，Microsoft Windows-based freeware for population genetic analysis[M].Version 1.32.Edmonton，Canada：University of Alberta，2000.

[33] NEI M.Estimation of average heterozygosity and genetic distance from a small number of individuals[J].Genetics，1978，89（3）：583-590.