何宗均 梁海恬 李峰

摘要[目的]研究單菌株和復(fù)合菌的腐熟性能。[方法]測(cè)定了單菌株和復(fù)合菌的拮抗效果、除臭能力、纖維素酶和蛋白酶活性，以及復(fù)合菌對(duì)有機(jī)物料的除臭和腐熟效果。[結(jié)果]由TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS這5種菌株組成的復(fù)合菌具有較強(qiáng)的纖維素、蛋白質(zhì)分解能力及除臭能力，綜合性能高于任何單一菌株。復(fù)合菌作為腐熟劑進(jìn)行應(yīng)用后，從菌數(shù)、速效養(yǎng)分、C/N、氣味和發(fā)酵周期效果來(lái)看，對(duì)有機(jī)物料的腐熟和除臭都起到了顯著的促進(jìn)作用。[結(jié)論]復(fù)合菌在促進(jìn)有機(jī)物料腐熟及除臭方面效果優(yōu)于單菌株。

關(guān)鍵詞復(fù)合菌；有機(jī)物料；腐熟

中圖分類(lèi)號(hào)S144文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）05-0045-02

Abstract[Objective]To study the maturity performance of single strain and compound bacteria. [Method]The antagonistic effect， deodorization ability， cellulose and protease activity of single strain and compound bacteria， and deodorization and effect of decomposition of compound bacteria on organic materials were determined. [Result] The test result showed that compound bacterium maked up by TARE1013KC， TARE1003DY， TARE2012SR， TARE2009MQ and TARE2008LS had strong comprehensive ability of cellulose， protein decomposition and deodorization ability than any single strain. After compound bacterium as rotten agent was applied in composting， it has played a significant role in promoting the effect of the rotten and deodorization on organic material by indicators of bacterial count， available nutrients， C/N ratio， smell and fermentation cycle.[Conclusion] The compound bacteria in promoting the decomposition of organic materials and deodorization effect was better than that of single strain.

Key wordsCompound bacterium；Organic material；Rotten

基金項(xiàng)目天津市農(nóng)業(yè)科技成果與推廣項(xiàng)目（201202090）。

作者簡(jiǎn)介何宗均（1976—），男，江西寧都人，副研究員，從事農(nóng)業(yè)微生物與廢棄物資源化處理技術(shù)研究。

收稿日期2016-12-23

我國(guó)是世界上農(nóng)業(yè)廢棄物產(chǎn)出量最大的國(guó)家，每年產(chǎn)生的農(nóng)業(yè)廢棄物約40.0億t，其中畜禽糞便 26.0億 t，農(nóng)作物秸稈7.0億 t，蔬菜廢棄物1.0億～1.5億 t[1]。隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，菇渣、中藥渣、園林剪切物廢棄物的產(chǎn)生量也迅猛增加，這些廢棄物由于大部分得不到很好的處理和應(yīng)用，已對(duì)水體、大氣、土壤、人體健康及生態(tài)系統(tǒng)造成了嚴(yán)重危害。應(yīng)用有機(jī)物料腐熟菌劑快速分解處理有機(jī)廢棄物生產(chǎn)有機(jī)肥料，是國(guó)內(nèi)外解決以上問(wèn)題的主要措施，這項(xiàng)技術(shù)在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，我國(guó)在這方面已進(jìn)行了大量研究[2-21]。筆者研究了單菌株與復(fù)合菌的纖維素酶活性、蛋白酶活性和除臭性能，旨在為有機(jī)物料腐熟菌劑的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

細(xì)菌菌株TARE1013KC、TARE1003DY，真菌菌株TARE2012SR、TARE2009MQ、TARE2008LS。

營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂：由蛋白胨5 g、氯化鈉5 g、牛肉膏3 g和蒸餾水1.0 L組成，pH 7.0。

馬鈴薯、葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：取去皮的馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1.0 L煮沸30 min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至1.0 L，加葡萄糖20 g，溶化后分裝，滅菌30 min，pH自然。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌株的培養(yǎng)。

TARE1013KC和TARE1003DY培養(yǎng)基均為液體營(yíng)養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基，經(jīng)121 ℃實(shí)罐滅菌30 min后，28～30 ℃培養(yǎng)36～48 h。

TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS采用馬鈴薯、葡萄糖培養(yǎng)基，把液體培養(yǎng)基分裝于0.5 L三角瓶中，經(jīng)滅菌后接入各真菌斜面菌種，于180 r/min 28～30 ℃培養(yǎng)48 h，當(dāng)搖瓶?jī)?nèi)出現(xiàn)菌絲密度大，菌絲球明顯不渾濁即可。

1.2.2菌株間的相互拮抗試驗(yàn)。

采用鋼圈法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。取其中1種菌（A）的發(fā)酵液0.10 mL涂于平板上，然后在每個(gè)平板的固體培養(yǎng)基上擺放2個(gè)已滅菌的鋼圈，再在每個(gè)鋼圈中加入0.25 mL的A菌之外的任何1種菌（B）的發(fā)酵液，每個(gè)處理重復(fù)3次，以只接A菌的平皿為對(duì)照（CK）。28 ℃培養(yǎng)并定期觀察抑菌情況。

1.2.3

除臭能力的測(cè)定。

采用氨氣檢測(cè)、硫化氫檢測(cè)和感官檢測(cè)對(duì)微生物菌劑的除臭能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。將活化后的TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS分別用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，得到各個(gè)菌株的菌液。將各個(gè)菌株的菌液和復(fù)合菌劑分別進(jìn)行如下試驗(yàn)：將菌液接在發(fā)酵除臭基質(zhì)內(nèi)，于500 mL燒杯中混勻（每份發(fā)酵除臭基質(zhì)接種10 mL菌液），作為試驗(yàn)樣本，設(shè)置發(fā)酵除臭基質(zhì)作為對(duì)照樣本，各樣本用牛皮紙及1層塑料紙封口。每個(gè)樣本（6種試驗(yàn)樣本和1種對(duì)照樣本）設(shè)置3個(gè)平行處理，每個(gè)平行處理設(shè)置3次重復(fù)。在第1個(gè)平行中放置內(nèi)盛20 mL 2%硼酸溶液的小燒杯，用以吸收發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的氨氣，第7天用酸滴定法測(cè)定；在第2個(gè)平行中放置內(nèi)盛20 mL 0.05 kg/L乙酸鋅溶液，用以吸收發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的硫化氫，第7天用碘量法測(cè)定；第3個(gè)平行，第7天進(jìn)行感官測(cè)定。

1.2.4蛋白酶和纖維素酶活性的測(cè)定。

蛋白酶活性測(cè)定方法參照中華人民共和國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 1803—1993《工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法》中附錄A3蛋白酶的測(cè)定方法。

纖維素酶活性的測(cè)定方法：稱(chēng)取樣品用蒸餾水稀釋10倍，充分振蕩，靜置30 min，過(guò)濾，其濾液即為原樣酶液。取3支帶有20 mL刻度的試管，1支作為空白對(duì)照，其余2支作為平行樣品管。樣品管中加1 mL原樣酶液，然后3支試管中分別加入4 mL已預(yù)熱至60 ℃的底物溶液，在60 ℃水浴鍋中反應(yīng)20 min取出，每管立即加入1 mL 2.0 mol/L氫氧化鈉溶液和2 mL DNS顯色液，搖勻后在對(duì)照管中再加入1 mL原樣酶液。將3支試管放入沸水浴中，顯色5 min后立即取出，流水冷卻，定容至20 mL，用分光光度計(jì)于490 nm處測(cè)定OD值。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成葡萄糖量

式中，U為樣品的酶活力（μg/min）；M0為對(duì)照葡萄糖量（μg）；

M1為分解后樣品質(zhì)量（μg）；20為酶與底物反應(yīng)時(shí)間（min）。

1 mL原樣酶液1 min產(chǎn)生1 μg葡萄糖定義為1個(gè)酶活力單位（U）。

1.2.5復(fù)合菌在有機(jī)物料的除臭和腐熟上的應(yīng)用試驗(yàn)。

堆肥原料：雞糞、牛糞、玉米秸稈、可堆腐生活垃圾和蘑菇渣，質(zhì)量比為5〖DK〗∶5∶3∶2∶2。設(shè)2個(gè)處理，即加復(fù)合菌處理和未加菌劑的空白對(duì)照（CK），每個(gè)處理2 t原料，3次重復(fù)，垛型堆制發(fā)酵。發(fā)酵周期以發(fā)酵溫度降至室溫為止計(jì)算所得，發(fā)酵第15天對(duì)2個(gè)處理進(jìn)行取樣分析，包括速效氮、速效磷、速效鉀總量、C/N、菌數(shù)和大腸桿菌，并觀察發(fā)酵的物理狀態(tài)。

2結(jié)果與分析

2.1復(fù)合菌

將TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS單菌種質(zhì)量比為3∶2∶2∶1∶2混合拌勻后制得復(fù)合菌，復(fù)合菌有效活菌數(shù)達(dá)2×108 個(gè)/g。

2.2拮抗試驗(yàn)

由表1可知，TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS 5種菌之間無(wú)抑制作用，拮抗反應(yīng)均為陰性。

2.3除臭能力

結(jié)合感官、氨氣和硫化氫含量的檢測(cè)結(jié)果可知，由TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS組成的復(fù)合菌與TARE1013KC單個(gè)菌株的除臭效果不存在顯著差異，但顯著好于TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ、TARE2008LS和CK（表2）。

2.4纖維素酶和蛋白酶活性

由表3可知，由TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS菌株組成的復(fù)合菌具有很強(qiáng)的纖維素和蛋白質(zhì)分解能力，綜合性能高于任何單一菌株，也高于有機(jī)物料腐熟劑國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的纖維素酶活性（30.00 U/mL）和蛋白酶活性（15.00 U/mL）的要求，復(fù)合菌可以作為有機(jī)物料腐熟劑進(jìn)行使用。

2.5復(fù)合菌對(duì)有機(jī)物料的除臭能力和腐熟效果

由表4可知，從各項(xiàng)指標(biāo)來(lái)看，復(fù)合菌的發(fā)酵效果好于CK，其中復(fù)合菌的發(fā)酵溫度在2 d內(nèi)能夠達(dá)55 ℃，CK需要4 d；發(fā)酵的結(jié)果表現(xiàn)為復(fù)合菌微生物數(shù)量生長(zhǎng)繁殖活躍，菌數(shù)和速效N、P、K含量均高于CK，發(fā)酵周期也大大縮短，其中復(fù)合菌為15 d，CK 32 d，復(fù)合菌發(fā)酵顏色黑褐色，無(wú)臭味，而CK為淺色，有臭味。發(fā)酵15 d后復(fù)合菌和CK的C/N分別為153、22.3，C/N愈低，表示微生物對(duì)堆肥有機(jī)物料中纖維素降解作用越好。從菌數(shù)、速效養(yǎng)分、C/N、氣味和發(fā)酵周期效果來(lái)看，加入復(fù)合菌對(duì)有機(jī)物料的腐熟和除臭都有促進(jìn)作用。

3結(jié)論與討論

（1）該研究表明，由TARE1013KC、TARE1003DY、TARE2012SR、TARE2009MQ和TARE2008LS菌株組成的復(fù)合菌具有較強(qiáng)的纖維素、蛋白質(zhì)分解能力及除臭能力，綜合性能高于任何單一菌株，作為有機(jī)物料腐熟劑進(jìn)行應(yīng)用后，從菌數(shù)、速效養(yǎng)分、C/N、氣味和發(fā)酵周期效果來(lái)看，對(duì)有機(jī)物料的腐熟和除臭都起到了顯著的促進(jìn)作用。柳玲玲等[2]對(duì)不同腐熟菌劑對(duì)雞糞堆肥效果的影響研究表明，雞糞堆肥通過(guò)接種微生物菌劑，可以明顯提高堆肥初期的發(fā)酵溫度，加快堆肥物料的水分揮發(fā)，縮短堆肥發(fā)酵周期，促進(jìn)堆肥快速腐熟。趙曉鋒等[8]分離篩選出細(xì)菌KB217、放線菌KA46和真菌KF21這3個(gè)菌株，使雞糞堆肥的氨氣釋放量分別降低了59.40%、55.05%和56.38%。3種菌株之間無(wú)拮抗作用，三者混合制劑能使氨氣釋放量降低67.33%，且縮短氨氣釋放時(shí)間，這與該研究結(jié)果相似。

（2）微生物菌株是一種容易變異的生物，生長(zhǎng)繁殖受環(huán)境影響也非常大，因此，微生物腐熟劑或除臭劑的特性易變異，性能不穩(wěn)定，對(duì)有機(jī)物料的腐熟和除臭效果也會(huì)造成不同程度的影響，今后應(yīng)該在這方面加大研究力度。

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