吳淑敏　李娟玲

摘要綜述了植物解剖學(xué)的發(fā)展歷程，石蠟切片和冷凍切片2種方法在植物相關(guān)組織、主要器官的研究進展，以及2種切片方法的技術(shù)改進，并展望了國內(nèi)植物解剖學(xué)與計算機領(lǐng)域、分子生物學(xué)等其他學(xué)科相結(jié)合的研究前景。

關(guān)鍵詞石蠟切片法；冷凍切片法；植物解剖學(xué)

中圖分類號Q944.5文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）30-0003-04

AbstractWe reviewed the development of plant anatomy， the progress of paraffin sections and frozen sections in plantrelated tissues， major organs， and the technical improvements.Besides， we prospected the research of plant anatomy in combination with computer science， molecular biology and other disciplines in future.

Key wordsParaffin sectioning；Frozen section method；Plant anatomy

以植物不同器官的解剖結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)來研究植物生長發(fā)育規(guī)律的學(xué)科叫植物解剖學(xué)，植物解剖學(xué)實驗性很強，與細胞學(xué)、結(jié)構(gòu)學(xué)、組織學(xué)、發(fā)育學(xué)、形態(tài)學(xué)、系統(tǒng)學(xué)等學(xué)科有著緊密聯(lián)系。植物解剖學(xué)在闡述植物生長發(fā)育機理、劃分植物種屬類別、引領(lǐng)生命科學(xué)在微觀結(jié)構(gòu)層面的發(fā)展有著關(guān)鍵作用[1]。早在300多年前，Crew 和Malpighi就開始研究植物解剖結(jié)構(gòu)，不久之后Crew提出植物解剖學(xué)應(yīng)該結(jié)合植物發(fā)育的過程進行階段性的比較解剖結(jié)構(gòu)研究。而他的思想到19世紀末都很少被認同，因此這也成為植物解剖學(xué)停滯不前的主要原因，此后并一直處于單一的形態(tài)解剖研究上，很少人遵照他的思想把植物解剖學(xué)與其他學(xué)科相結(jié)合[2]。在經(jīng)歷了2～3個世紀的研究，逐漸有其他相關(guān)學(xué)科與植物解剖學(xué)相互滲透，并逐漸形成了和植物解剖學(xué)相關(guān)的邊緣學(xué)科，其中生理解剖和比較解剖的應(yīng)用尤為廣泛。

植物解剖學(xué)的研究方法主要有2種：石蠟切片法與冷凍切片法。石蠟切片是研究植物形態(tài)學(xué)的主要方法之一，最早關(guān)于石蠟切片研究的文獻報道是在1950年。該方法是我國諸多科研工作者研究植物形態(tài)學(xué)運用較多的方法。此后，冷凍切片在植物細胞領(lǐng)域的應(yīng)用也相繼被開發(fā)。隨著分子標記、系統(tǒng)學(xué)、植物環(huán)境適應(yīng)性分析、逆境脅迫、植物病理等結(jié)合解剖學(xué)的研究，植物解剖學(xué)逐漸走向新的領(lǐng)域，為瀕危植物保護、植物功能性開發(fā)、植物病蟲害的防治奠定了基礎(chǔ)[3-4]。筆者綜述了石蠟切片和冷凍切片2種方法在植物相關(guān)組織、主要器官的研究進展，以期為植物解剖學(xué)的進一步研究與應(yīng)用提供參考。

1石蠟切片法

早期的石蠟切片制作主要是用于細胞組織學(xué)、發(fā)育生物學(xué)的研究，同時在臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域也是作為觀察細胞病理變化的重要手段，并在這個領(lǐng)域迅速推廣、應(yīng)用。動植物組織的處理和石蠟切片的制作也是研究動植物細胞的形態(tài)學(xué)觀察和原位雜交、免疫組化的主要技術(shù)手段，隨著新儀器的出現(xiàn)和實驗方法的改良，石蠟切片與其他實驗方法（掃描電鏡、SSR分子標記等）相結(jié)合，擴大了植物解剖學(xué)研究的應(yīng)用范圍，擴增更多領(lǐng)域（分子領(lǐng)域、分子生態(tài)學(xué)），增加新的研究內(nèi)容；使植物解剖學(xué)的研究由單一的微觀結(jié)構(gòu)的觀察擴增到各種成分的定性分析，又從定性分析過渡到定量計測，將細胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)與植物功能及代謝相結(jié)合，更直接揭示植物生長特性，全面性反映植物生長發(fā)育的規(guī)律[5]。

1.1葉和根解剖學(xué)研究

1.1.1葉解剖學(xué)研究。

植物葉片有著較強的可塑性，植物的同科同屬之間、同科異屬之間、同科同屬不同品系之間的葉片解剖結(jié)構(gòu)均存在明顯差異，并隨著生長環(huán)境變化而改變。大量研究表明，植物葉片結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定的遺傳性一直以來都是植物解剖學(xué)研究的重要器官和切入點[6-10]。同時，植物葉片顯微結(jié)構(gòu)的觀察對植物種屬之間的分類有著重要的指導(dǎo)作用[11]。

植物對環(huán)境的適應(yīng)最直接表現(xiàn)出來的器官為葉片。為了分析不同生境下的藤本植物的適應(yīng)性，吳濤等[12]以哀牢山亞熱帶常綠闊葉林中12種常見的木質(zhì)藤本植物為試驗對象，分別對3種環(huán)境[光照強度和溫度分別為1 800 μmol/（m2·s）和28 ℃、600 μmol/（m2·s）和25 ℃、100 μmol/（m2·s）和22 ℃]下的藤本植物葉片進行石蠟切片制作和解剖結(jié)構(gòu)的觀察，通過比較不同生境下的藤本植物葉片解剖結(jié)構(gòu)特征，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)藤本植物葉片對強光環(huán)境適應(yīng)性最高，分布區(qū)域均比其他藤本植物廣。余如風等[13]采用石蠟切片和顯微拍照的方法觀察白骨壤和紅海欖的葉片結(jié)構(gòu)，探究了這2種植物對污水環(huán)境的適應(yīng)性，得出了這2種植物為了適應(yīng)污水環(huán)境，其葉片上下角質(zhì)層均加厚。迪利夏提·哈斯木等[14]以散布于新疆北部古爾班通古特沙漠南緣的12種短命植物為試驗材料，對12種短命植物的葉片進行常規(guī)石蠟切片制作，并觀察分析，通過比較發(fā)現(xiàn)12種短命植物葉片結(jié)構(gòu)均適應(yīng)沙漠環(huán)境，其中葉片具有花環(huán)狀結(jié)構(gòu)的植物有7種，葉肉柵欄組織表現(xiàn)出等面葉特征的植物有8種，最大的差異為12種植物葉肉和葉脈的晶體數(shù)量、大小，沒有特定規(guī)律表現(xiàn)。

葉片各個微觀結(jié)構(gòu)也會隨環(huán)境變化而改變，如氣孔、柵欄組織等。高偉等[15]為探究大豆屬（Glycine）Soja亞屬植物的系統(tǒng)演化規(guī)律，采用石蠟切片法對產(chǎn)自吉林省的大豆屬的葉片結(jié)構(gòu)進行顯微觀察，發(fā)現(xiàn)大豆屬的Soja亞屬4種植物為了適應(yīng)新環(huán)境，其維管束、CTR均增多。方敏彥等[16]以空氣鳳梨為研究對象，利用石蠟切片技術(shù)對其葉片解剖結(jié)構(gòu)進行了研究。結(jié)果表明，空氣鳳梨的解剖結(jié)構(gòu)較其他單子葉植物而言，角質(zhì)層和柵欄組織更厚，葉肉組織更發(fā)達，維管束更多，認為角質(zhì)層厚度是評價植物抗性的主要依據(jù)。

王虹等[17]應(yīng)用石蠟切片和掃描電鏡相結(jié)合方法對新疆天山一號冰川地區(qū)的12 種蘚類植物葉片結(jié)構(gòu)和葉表面微形態(tài)進行觀察。結(jié)果表明，苔蘚植物葉中肋、細胞表面、細胞壁等各項指標在不同種之間表現(xiàn)出明顯差異。劉丹丹等[18]采用石蠟切片技術(shù)和植紋鑒定技術(shù)結(jié)合，依據(jù)長白山地區(qū)野豌豆屬3種植物成熟葉片的解剖結(jié)構(gòu)及表觀結(jié)構(gòu)植紋特征的差異，探究野豌豆屬植物演化關(guān)系，為其屬下分類方法及演化趨勢提供科學(xué)參考。在后續(xù)的研究工作中，不同品系的植物親緣關(guān)系的評價也是以葉片石蠟切片的制作為前提來進行研究。

1.1.2根解剖學(xué)研究。

根系發(fā)展初期如同葉片一樣具有良好的可塑性，但是受環(huán)境各個因子的影響，尤其是土壤因素，影響根系養(yǎng)分吸收、分布情況，也造成根系形態(tài)建成有著很大的差異性，造成根系內(nèi)部輸導(dǎo)組織發(fā)生環(huán)境適應(yīng)性的改變[19-21]。

根系抗逆性的表現(xiàn)可以直觀地從不同環(huán)境的根系顯微結(jié)構(gòu)進行比較。高偉等[22]以2種不同生態(tài)環(huán)境下的野生大豆[2013-001-01（鹽生環(huán)境）和2013-001-02（中性環(huán)境）]為材料，運用光學(xué)顯微技術(shù)和石蠟切片相結(jié)合，對2種不同生境的大豆根系進行解剖結(jié)構(gòu)觀察，證明了大豆在頡頏鹽逆境下，演化出相應(yīng)的結(jié)構(gòu)。朱天琦等[23]采用石蠟切片技術(shù)和根系掃描系統(tǒng)對北方主要牧草苜蓿的根系輸導(dǎo)組織解剖結(jié)構(gòu)進行研究，發(fā)現(xiàn)在各氮形態(tài)水平處理下，根系生物量等各項指標顯著高于對照組，處理水平201 mg/L NH4+-N能有效促進其根系外部形態(tài)建成和改善其內(nèi)部輸導(dǎo)組織結(jié)構(gòu)。王寧等[24]以常規(guī)石蠟切片為基礎(chǔ)，在研究“豐香”和“土特拉”2種草莓側(cè)根發(fā)育形成過程中發(fā)現(xiàn)發(fā)育約72 h的草莓側(cè)根，初生根部的中柱鞘細胞開始分裂，經(jīng)過24 h生長，中柱鞘細胞沖破間隙通道細胞進入皮層最后形成側(cè)根原基；48 h后，側(cè)根原基伸長依次穿過皮層和表皮細胞；72 h后，側(cè)根原基頂端細胞迅速分裂、數(shù)量增多，最后由分生組織形成草莓的側(cè)根。

根系解剖結(jié)構(gòu)特征也是植物種間分類的一個重要依據(jù)，侯曉強等[25]以20種石斛屬作為材料，運用石蠟切片法對20種石斛屬植物根系進行顯微解剖結(jié)構(gòu)觀察，比較種間根系結(jié)構(gòu)差異，該分類方法準確、具體，也突破了根據(jù)地表以上的器官進行分類的傳統(tǒng)。

根系的解剖學(xué)研究對于植物的生長發(fā)育、營養(yǎng)吸收、生長調(diào)控等都具有重要意義，也為植物的抗逆性、系統(tǒng)分類的研究奠定了基礎(chǔ)。

1.2石蠟切片方法改良

石蠟切片制作的各個環(huán)節(jié)都會直接影響石蠟切片的質(zhì)量，不同種或?qū)僦g的植物組織差異較大。在切片制作的過程中，應(yīng)根據(jù)不同材料的特性設(shè)置每個步驟相應(yīng)的處理時間和試劑用量，確保制作出結(jié)構(gòu)完整、清晰的石蠟切片。因此，優(yōu)化和改良石蠟切片的試驗方法非常重要。

吳華等[26]對蕨類植物石蠟切片制作時，在固定液中放入銅網(wǎng)后抽真空，材料完整性保持良好，有利于藥劑滲透，并有利于材料脫水完全。周廣奇等[27]對于葉片肉質(zhì)化、不易脫水的植物，采用戊二醛作為固定液，固定24 h后進行清洗和脫水；脫水時間為每一級1 h，包埋時溫度控制在100 ℃，用固綠作為主要染色劑，制作的切片效果較好。李鳳英等[28]為了避免二甲苯的毒性危害，利用有機溶劑松節(jié)油代替二甲苯與脫蠟劑。

由于石蠟切片染色時間較長，而染色時間的長短直接影響其制片效率，所以對于染色方法的改進，均采用雙重染色法。何承坤等[29]和徐青[30]采用雙重整體染色法將制片的木質(zhì)部導(dǎo)管、厚壁組織、厚角組織染成紅色；表皮細胞、薄壁細胞等可均勻染成綠色； 角質(zhì)層等染成淡紅色，且各組織著色均勻一致，簡化了操作步驟，既省時又避免了番紅染料褪色（尤其是厚角組織等表皮內(nèi)方的機械組織）。趙俊等[31]和張寶華[32]對常規(guī)實驗方法進行了改進，如精煉石蠟、取材避免機械損傷、適當調(diào)整乙醇的濃度梯度和適宜的脫水時間等，在整個石蠟切片制作過程中，細致操作，認真完成每一個環(huán)節(jié)。

2冷凍切片法

冰凍切片技術(shù)起初應(yīng)用于動物細胞及臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，并且在動物細胞領(lǐng)域的技術(shù)研究已經(jīng)很成熟[33-34]。冰凍切片處理時間較短、操作相對簡單，更加便于進行細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究。因為冷凍切片的處理步驟較為簡便，所以可以有效地減少樣品在處理過程中造成的機械損傷，更有利于保存生物分子的活性。由于植物細胞結(jié)構(gòu)的特殊性，導(dǎo)致冷凍切片技術(shù)在植物細胞領(lǐng)域的研究難度較大，起步相對較晚，因此植物花器官及組織的研究報道相對較少[35-36]。并且植物細胞的細胞壁和大液泡增加了細胞含水量，使植物細胞含水量遠大于相同體積的動物細胞。因此，在低溫速凍的過程中，植物細胞會迅速形成冰晶，很大程度上損傷植物細胞的細微結(jié)構(gòu)。并且植物細胞形成冰晶的硬度較大，增加了切片難度和難以保全植物細胞結(jié)構(gòu)的完整性。然而，劉雄飛等[37]以西安市不同空氣環(huán)境下4種綠化樹種植物大葉女貞、小葉女貞、大葉黃楊和紫葉李為研究對象，運用冷顯微成像技術(shù)和冷凍切片相結(jié)合的方法，對葉片的解剖結(jié)構(gòu)進行觀察。其結(jié)果均表明了葉片結(jié)構(gòu)對環(huán)境適應(yīng)性作出了相應(yīng)改變，也說明冷凍切片技術(shù)在植物細胞形態(tài)學(xué)方面應(yīng)用效果良好，具有發(fā)展?jié)摿Α?/p>

由于冷凍切片技術(shù)在植物形態(tài)學(xué)方面的研究起步較晚，切片難度較大，諸多實驗參數(shù)均需要優(yōu)化，大多數(shù)學(xué)者還在不斷開展實驗操作步驟的改良和藥劑的篩選研究。

陳丹等[38]以4種植物花器官為試驗對象，進行冰凍切片制作，并優(yōu)化了制片各個環(huán)節(jié)及相關(guān)參數(shù)，探究最適于植物花器官冷凍切片制作的方法。具體試驗步驟：原料經(jīng)過固定和蔗糖冷凍保護后，迅速進行液氮速凍包埋，包埋完成后再進行冰凍切片，將切好的薄片烘干并進行染色，最終可觀察顯微結(jié)構(gòu)并拍照，也證明了冷凍切片在植物花器官領(lǐng)域應(yīng)用的可靠性。李建霞等[39]優(yōu)化了冷凍切片制作方法，并對艾納香成熟葉的顯微結(jié)構(gòu)進行了觀察，其具體優(yōu)化步驟為：取新鮮葉片，不經(jīng)過預(yù)處理，每片剪取4 mm×4 mm葉塊，置入冷凝膠進行包埋樣品，冷凝箱和樣品夾溫度均控制在-18 ℃，冷凝時間為10 min，冷凝結(jié)束后進行修片，并取出樣品置于20 ℃室溫下回溫30 s，移回樣品夾后進行切片，在30 s內(nèi)切片完成，其切片的厚度為20 μm，將清洗干凈的載玻片吸片置于光鏡下進行觀察。結(jié)果表明，成熟的艾香葉片厚度為110 μm且葉面為異葉面，柵欄組織的細胞排列方式異于海綿組織，僅有1層緊密排列的柱狀細胞，而海綿組織細胞間隙較寬，兩者厚度比值為0.82～1.22；葉片中脈最發(fā)達，散生主葉脈，外韌維管束6～10個，維管束鞘由厚壁細胞組成，螺紋導(dǎo)管；非腺毛和腺毛數(shù)量居多，均分布于葉片上、下表皮，均為雙列多細胞組成的頭狀腺毛。該方法證實了冰凍切片用于研究艾納香葉顯微結(jié)構(gòu)的可行性，為艾納香屬植物的分類、品種整理等提供了理論依據(jù)，并且為研究艾納香的結(jié)構(gòu)和發(fā)育提供了技術(shù)指導(dǎo)。寧代鋒等[40]運用不同的冷凍切片方法進行切片制作，通過比較不同制片方法對植物超顯微結(jié)構(gòu)的影響，最終建立了一種

直接包埋冷凍和適當回溫相結(jié)合的方法， 制作的組織切片可以保存完整的植物細胞結(jié)構(gòu)，并且可進行多種方法染色和組織細胞化學(xué)測定，該方法操作簡單，推廣價值高。

上述研究均說明了冷凍切片技術(shù)用于植物細胞形態(tài)學(xué)的研究具有良好的效果，在方法上加以改良，可以縮短制片時間，減少制片步驟，有著巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

3石蠟切片法與掃描電鏡、徒手切片法等多種方法結(jié)合研究

對于植物系統(tǒng)學(xué)的研究，單一使用石蠟切片法或冷凍切片法進行解剖結(jié)構(gòu)分析，不能系統(tǒng)地反映植物的種間關(guān)系及分類依據(jù)，需要結(jié)合多種方法進行分析。梁莉[41]采用徒手切片、電鏡掃描和石蠟切片法等，對植物根、莖、葉及其他器官進行綜合的形態(tài)學(xué)觀察，并進行比較、微觀分類等遺傳多樣性的分析。該方法填補了單一研究分類的不足，完善了東北唇形科植物的形態(tài)學(xué)分析研究，進一步體現(xiàn)了解剖學(xué)在植物分類學(xué)中的重要地位，為唇形科的經(jīng)典分類提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)，并為分子系統(tǒng)學(xué)研究提供了重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)。洪文君等[42]應(yīng)用葉片離析法和石蠟切片技術(shù)，比較了3種（含變種）檵木屬植物根莖葉的結(jié)構(gòu)解剖特征，并對其環(huán)境適應(yīng)性進行排序，為檵木屬植物的推廣種植提供了依據(jù)。史傳奇[43]以東北豆科植物為研究對象，采用石蠟切片、半薄切片及SEM相結(jié)合的方法，對東北豆科植物葉片、果實、種子及種苗的形態(tài)及解剖結(jié)構(gòu)進行觀察，并建立了系統(tǒng)發(fā)育樹，更加全面、系統(tǒng)性地揭示了東北豆科植物的形態(tài)特征，完善了東北豆科植物解剖學(xué)的研究，為豆科類群的劃分提供了參考。申仕康等[44]通過掃描電鏡對其種子表面紋飾、氣孔以及葉毛被特征進行了觀察，結(jié)合石蠟切片顯微觀察，發(fā)現(xiàn)大樹杜鵑根的次生結(jié)構(gòu)的周皮和維管柱，大樹杜鵑的莖由表皮、皮層、韌皮部、木質(zhì)部和髓組成；大樹杜鵑的葉為異面葉，上下邊皮差異較大，上表皮有角質(zhì)層，沒有氣孔，下表皮反之，氣孔無規(guī)則，葉脈有發(fā)達的維管束鞘延伸區(qū)；由2層不同類型的毛組成葉片毛被，上層為海綿狀絨毛，下層為短的薄片狀絨毛；種子具翅，腹面和背面可明顯區(qū)分，背腹面縱紋明顯。該研究結(jié)果為進一步闡明大樹杜鵑的生物學(xué)特征、確定其系統(tǒng)分類地位和探究其環(huán)境適應(yīng)性提供了依據(jù)。

楊燕梅等[45]采用徒手切片法對主根的上、中、下3個部位分別做橫切片，比較龍膽科龍膽屬秦艽組的6種藥用植物（秦艽、粗莖秦艽、麻花秦艽、小秦艽、黃管秦艽和管花秦艽）的藥用形態(tài)及顯微鑒別特征，為中藥秦艽真?zhèn)舞b別提供依據(jù)。王姍[46]通過原植物形態(tài)觀察和石蠟切片法相結(jié)合，以湖北恩施產(chǎn)蛇足石杉、皺邊石杉、四川石杉作為研究對象，通過比較發(fā)現(xiàn)石杉屬植物在原植物形態(tài)上較其他不同科屬的植物簡單，葉片形態(tài)差異較大，可用于作為鑒別的主要方法，葉片在大小、葉邊緣和葉柄長度上均有較大區(qū)別；其葉、根、莖的顯微解剖結(jié)構(gòu)有著共同結(jié)構(gòu)，也有細微的差異，根的維管束數(shù)目和篩胞排列方式與莖和葉片的差異較大，莖維管束面積等其他組織排列方式也差異較大。多種植物解剖學(xué)研究方法的結(jié)合更能系統(tǒng)地分析植物種間親緣關(guān)系，為植物系統(tǒng)的分類提供更細的劃分標準和依據(jù)。

4關(guān)于植物解剖學(xué)的展望

盡管光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡在眾多顯微結(jié)構(gòu)的觀察方面得到廣泛應(yīng)用，并能直觀地呈現(xiàn)二維成像效果，但顯微結(jié)構(gòu)信息的采集量存在局限性。隨著計算機成像技術(shù)的發(fā)展，植物形態(tài)學(xué)的研究依托普通的照片成像，結(jié)合顯微鏡，通過CCD視頻采集，對植物微觀結(jié)構(gòu)進行信息采集，大大提升了植物微觀結(jié)構(gòu)信息的采集效率，有利于后期的交流、擴大信息共享等[47]。熒光成像技術(shù)與植物解剖學(xué)的結(jié)合對植物病害的檢測及防治有著高效、準確的作用，可及時發(fā)現(xiàn)最佳治理病害的時間，防止錯過

植物病害最佳防治時期[48]。三維成像技術(shù)的發(fā)展對植物形態(tài)學(xué)的研究也具有推動作用。傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)對植物根、莖、葉、花、果實等器官進行觀察之后，最終以圖像加文字的形式將其結(jié)果呈現(xiàn)出來，這對植物器官結(jié)構(gòu)的表達具有片面性。利用三維成像技術(shù)，可以充分表達其植物形態(tài)結(jié)構(gòu)的各個參數(shù)等，還可表達各個器官功能的發(fā)生機理[49-50]。

形態(tài)學(xué)和解剖學(xué)相結(jié)合，能夠看到作物在外貌和結(jié)構(gòu)上的表現(xiàn)，結(jié)合形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)的研究能有效地彌補形態(tài)學(xué)的短板，依托普通的照片成像，結(jié)合顯微鏡，通過CCD視頻采集，為系統(tǒng)地評價植物發(fā)生、鑒定、親緣關(guān)系及遺傳多樣性的研究提供理論依據(jù)[51-52]，也是今后植物形態(tài)學(xué)研究的發(fā)展趨勢。

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