劉小青 李日升 黃靜敏 陳晶 蘭全學(xué)

摘要[目的]對(duì)toxR進(jìn)行副溶血性弧菌特異性檢測(cè)，探討toxR靶基因能否準(zhǔn)確檢測(cè)副溶血性弧菌，從而消除其他研究者對(duì)該基因特異性的疑慮。[方法]采用SN/T1870—2016中副溶血性弧菌toxR的引物探針對(duì)副溶血性弧菌和其親緣關(guān)系接近的弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行檢測(cè)。[結(jié)果]采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法證實(shí)該引物探針只能擴(kuò)增出副溶血性弧菌，其他弧菌諸如溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌等未得到擴(kuò)增。[結(jié)論] 證實(shí)SN/T1870—2016中toxR的引物探針特異性高。該研究可為各檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供數(shù)據(jù)支持，為副溶血性弧菌的檢測(cè)與研究奠定更為堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞副溶血性弧菌;SN/T1870—2016;toxR;弧菌

中圖分類號(hào)TS201.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）32-0079-02

Detection Research of Vibrio parahaemolyticus

LIU Xiaoqing，LI Risheng，HUANG Jingmin，LAN Quanxue* et al（Shenzhen Institute of Measurement Quality Inspection，Shenzhen，Guangdong 518131）

Abstract[Objective]The specific detection of toxR in Vibrio parahaemolyticus was used to investigate whether the toxR target gene can detect Vibrio parahaemolyticus accurately，thus it eliminates doubts among other researchers about the specificity of the gene.[Method] The primer and probe of toxR in SN/T 1870—2016 was used to detect Vibrio parahaemolyticus and its Vibrio related standard strain.[Result] The realtime fluorescent PCR method proved that the primer and probe could only amplify Vibrio parahaemolyticus，and other Vibrio species such as Vibrio vulnificus，Vibrio vulnificus and Vibrio cholerae were not amplified.[Conclusion] The specificity of toxR primers and probe in SN/T1870—2016 was confirmed high.This study can provide data support for the testing organization，and lay a more solid foundation for the detection and research of V.Parahaemolyticus.

Key wordsVibrio parahaemolyticus;SN/T1870-2016;toxR;Vibrio spp

作者簡(jiǎn)介劉小青（1983—），女，江西萬(wàn)載人，工程師，碩士，從事微生物研究。*通訊作者，高級(jí)工程師，碩士，從事食品微生物學(xué)研究。

收稿日期2017-08-28

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一種革蘭陰性細(xì)菌[1]，具有嗜鹽性，屬于弧菌科弧菌屬的食源性致病菌，主要分布在海水和魚、貝類、蝦、海蜇等海產(chǎn)品中，其次為鹽腌漬品中，另外畜禽肉、咸蛋、淡水魚等也會(huì)由于交叉污染而傳播該菌。由副溶血性弧菌引起的食品安全事故逐年增加，已成為導(dǎo)致食源性疾病的主要致病菌，其對(duì)人類的危害已經(jīng)超過(guò)沙門氏菌，因此檢測(cè)副溶血性弧菌極為重要[2]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，研究人員和學(xué)者們逐漸意識(shí)到，對(duì)病原微生物的鑒定不能僅局限于對(duì)它的外部形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理特征等一般檢驗(yàn)上，而要從分子生物學(xué)水平上研究其核酸結(jié)構(gòu)和組成成分。為此，國(guó)內(nèi)外眾多的研究人員開始建立起多種以分子生物學(xué)技術(shù)為手段的食源性致病菌檢測(cè)技術(shù)，這些技術(shù)包括常規(guī)PCR技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)、基因芯片技術(shù)和以環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）為代表的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。在我國(guó)，一些從實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)上對(duì)致病菌進(jìn)行快速檢測(cè)的方法也逐漸被研究應(yīng)用，其中《出口食品中食源性致病菌檢測(cè)方法 實(shí)時(shí)熒光PCR法》SN/T1870—2016是各檢測(cè)機(jī)構(gòu)最為常用的一個(gè)檢測(cè)方法[3]，該標(biāo)準(zhǔn)涵蓋了副溶血性弧菌等12種致病菌的檢測(cè)。由于副溶血性弧菌與弧菌屬其他弧菌的親緣關(guān)系近，有研究者質(zhì)疑副溶血性靶基因的選擇，筆者以SN/T1870—2016為基礎(chǔ)，就SN/T1870—2016中副溶血性弧菌的引物探針的特異性進(jìn)行鑒別，深入研究探討該標(biāo)準(zhǔn)在副溶血性弧菌的實(shí)際應(yīng)用中的檢測(cè)效果，以期為各檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供數(shù)據(jù)支撐。

1材料與方法

1.1材料標(biāo)準(zhǔn)菌株購(gòu)自各菌種保藏中心等;培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Promega公司;實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)試劑Premix酶等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;引物、探針由上海生物工程有限公司合成;Mx3005P實(shí)時(shí)熒光PCR儀，美國(guó)安捷倫公司;試驗(yàn)中所用引物見表1[3]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2方法

1.2.1細(xì)菌的培養(yǎng)。副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在3%氯化鈉堿性蛋白胨水37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h復(fù)活，其他弧菌在營(yíng)養(yǎng)肉湯中37 ℃振蕩培養(yǎng)18 h復(fù)活。

1.2.2菌株DNA模板的制備。

取1.0 mL菌液于1.5 mL離心管中，12 000 r/min離心10 min，去除上清液，收集菌體。加入100 μL滅菌超純水懸浮，100 ℃沸水中水浴10 min。12 000 r/min離心2 min，取上清液作為PCR反應(yīng)DNA模板。

1.2.3樣品DNA模板的制備。取1.0 mL菌液于1.5 mL離心管中，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。

1.2.4特異性試驗(yàn)。

將副溶血性弧菌和其他弧菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株采用增菌液增菌后，按“1.2.3”方法制備DNA模板，采用25 μL 體系進(jìn)行特異性試驗(yàn)，體系為2× premix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，探針0.5 μL， ddH2O 8.0 μL， DNA模板2.0 μL。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃ 3 min;95 ℃ 5 s， 60 ℃ 40 s 并收集FAM熒光，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

2結(jié)果與分析

擴(kuò)增結(jié)果見圖1和表2。SN/T1870—2016中的副溶血性弧菌PCR體系特異地檢出了副溶血性弧菌，而其他與其親緣關(guān)系鄰近種屬的弧菌未見到非特異擴(kuò)增現(xiàn)象，這表明該引物探針的特異性高。

采用分子方法尤其是SN/T1870—2016對(duì)其進(jìn)行快速檢測(cè)已是常規(guī)檢測(cè)手段。但由于副溶血性弧菌與弧菌屬其他

弧菌的親緣關(guān)系極為相近，有研究者質(zhì)疑副溶血性toxR靶基因的選擇，認(rèn)為toxR基因無(wú)法區(qū)分副溶血性弧菌與非副溶血性弧菌，而該研究所選用菌株均為與副溶血性弧菌親緣關(guān)系極為相近的菌株，結(jié)果證實(shí)SN/T1870—2016中toxR的引物探針特異性高，從而使上述質(zhì)疑得到釋疑。

3討論

該研究結(jié)果證實(shí)，SN/T1870—2016中toxR的引物探針特異性高，可以有效地將副溶血性弧菌從親緣關(guān)系相近弧菌中區(qū)別開。然而，近些年以來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，研究人員逐漸采用熒光PCR等分子生物學(xué)手段對(duì)副溶血性弧菌進(jìn)行快速檢測(cè)，SN/T1870—2016采用toxR基因作為副溶血性弧菌的靶基因，它是弧菌中廣泛分布的基因，為霍亂毒素的調(diào)控子及其他基因的調(diào)控子，該基因主要與toxS構(gòu)成兩成分系統(tǒng)（toxRS）對(duì)毒力基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控，已有很多文獻(xiàn)報(bào)道利用toxR鑒定副溶血性弧菌，并表現(xiàn)出很高的特異性和靈敏度[4-6]，但依然也有很多外國(guó)學(xué)者對(duì)該靶基因提出了質(zhì)疑。Kim 對(duì)373株副溶血性弧菌和290株非副溶血弧菌屬采用toxR基因進(jìn)行了菌落PCR，發(fā)現(xiàn)373株副溶血性弧菌全部陽(yáng)性，但是弧菌屬的其他4個(gè)種（溶藻弧菌、坎氏弧菌、鯊魚弧菌、哈氏弧菌）有弱陽(yáng)性出現(xiàn)。由于副溶血性弧菌與弧菌屬的其他弧菌如霍亂弧菌、溶藻弧菌、創(chuàng)傷弧菌等親緣關(guān)系極為密切，16sRNAR分析發(fā)現(xiàn)，其與溶藻弧菌的的同源性高達(dá)99%[7]。也有文獻(xiàn)報(bào)道，副溶血性弧菌與氣單胞菌屬和發(fā)光桿菌屬毒素基因也有交叉反應(yīng)[8]。因此在該研究中，筆者選取了2株副溶血性弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、9株弧菌屬的其他弧菌、氣單胞菌屬和發(fā)光桿菌共12株菌作為非副溶血性弧菌的代表，對(duì)所選引物探針進(jìn)行特異性試驗(yàn)，著重探討其對(duì)臨近種屬的特異性。結(jié)果表明，SN/T1870—2016中副溶血性弧菌的特異性很高，僅擴(kuò)增副溶血性弧菌，其他臨近種屬的菌未得到擴(kuò)增。通過(guò)NCBI將引物和探針序列進(jìn)行blast發(fā)現(xiàn)，比對(duì)結(jié)果中只有副溶血性弧菌出現(xiàn)，進(jìn)一步證實(shí)該引物探針特異性高，與筆者的試驗(yàn)結(jié)果一致。該研究解除了利用SN/T1870—2016中的副溶血性弧菌引物探針特異性不高的疑慮，可為各檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供數(shù)據(jù)支持，為副溶血性弧菌的檢測(cè)與研究奠定更為堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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