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傅里葉變換紅外光譜技術(shù)在植物學(xué)中的應(yīng)用

2017-05-30 10:48:04左云劉暢方炎明
安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2017年23期

左云 劉暢 方炎明

摘要綜述了傅里葉紅外光譜技術(shù)的工作原理及其在生物大分子、親緣地理學(xué)和生理學(xué)上的應(yīng)用,指出了傅里葉紅外光譜技術(shù)今后的發(fā)展方向,為傅里葉紅外光譜技術(shù)在植物學(xué)領(lǐng)域的研究提供借鑒。

關(guān)鍵詞傅里葉紅外光譜技術(shù);生物大分子;親緣地理學(xué);植物生理

中圖分類號(hào)Q94文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611(2017)23-0006-03

Application of FTIR Technology in Botany Research

ZU Yun, LIU Chang, FANG Yanming*

(College of Biology and the Environment, Nanjing Forestry University, Nanjing, Jiangsu 210037)

AbstractWe reviewed the working principle of Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and its applications in biological macromolecules, affinity geography and physiology, and pointed out the future development direction in order to provide reference for FTIR application in the study of botany in the future researches.

Key wordsFourier transform infrared spectroscopy;Biological macromolecules;Affinity geography;Plant physiology

作者簡(jiǎn)介左云(1990—),女,江蘇宿遷人,碩士研究生,研究方向:植物學(xué)。*通訊作者,教授,博士生導(dǎo)師,從事植物學(xué)研究。

收稿日期2017-05-24

傅里葉紅外光譜技術(shù)(FTIR)應(yīng)用十分廣泛,幾乎涉及到自然科學(xué)的每個(gè)領(lǐng)域,如化工、食品、醫(yī)藥、環(huán)境、氣象、文物鑒定、質(zhì)量監(jiān)控、地質(zhì)等[1]。近年來(lái),F(xiàn)TIR也越來(lái)越多地被應(yīng)用到植物學(xué)領(lǐng)域。不同的化學(xué)成分具有不同的紅外光譜,傅里葉變換紅外光譜根據(jù)這個(gè)特性,能夠進(jìn)行快速準(zhǔn)確的辨別鑒定[2]。筆者綜述了FTIR的工作原理及其在生物大分子、親緣地理學(xué)和生理學(xué)上的應(yīng)用,并探討了FTIR在植物學(xué)研究中遇到的一些問(wèn)題,旨在為FTIR在植物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用提供借鑒。

1FTIR的工作原理

FTIR是利用傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)量樣品寬帶紅外光譜,對(duì)樣品進(jìn)行定性定量分析的一門(mén)技術(shù)。FTIR具有的“指紋”特征性,使得人們利用傅里葉變換紅外光譜儀檢測(cè)化合物中官能團(tuán)和極性鍵振動(dòng)的分子振動(dòng)光譜,不同化合物具有不同的分子特征振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)頻率,從而鑒定出其化學(xué)成分[1]。

傅里葉變換紅外光譜儀屬于干渉性光譜儀,由紅外光源、干涉儀、樣品室、檢測(cè)器、激光器、紅外反射鏡、控制電路和電板組成。光源發(fā)出一束光,通過(guò)干涉儀,被干涉儀分成2束光,一束透射到達(dá)動(dòng)鏡,一束反射到達(dá)定鏡。透射到達(dá)動(dòng)鏡的紅外光被反射到分束器后,有一部分被透射返回光源,另一部分經(jīng)反射到達(dá)樣品;反射到定鏡的光再經(jīng)過(guò)定鏡的反射作用到達(dá)分束器后,一部分經(jīng)過(guò)分束器的反射作用返回光源,另一部分透過(guò)分束器到達(dá)樣品。用紅外光照射樣品,在特定波長(zhǎng)范圍的能量與分子的振動(dòng)能量相當(dāng),就被分子吸收。分子由低能態(tài)過(guò)渡到高能態(tài),產(chǎn)生能級(jí)躍遷,出現(xiàn)紅外分子吸收光譜,其中吸收譜帶的強(qiáng)度取決于偶極矩的變化大小[3-4]。

FTIR具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、化工、氣象、文物鑒定等研究領(lǐng)域[5]。隨著FTIR的不斷成熟,在植物學(xué)中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛,如研究探測(cè)生物大分子結(jié)構(gòu),包括蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定、核酸和脂質(zhì)的研究、植物親緣地理關(guān)系的研究、植物生理指標(biāo)的測(cè)定等。

2FTIR在生物領(lǐng)域的應(yīng)用

FTIR作為一種現(xiàn)代結(jié)構(gòu)常用的分析技術(shù),摒棄了傳統(tǒng)的化學(xué)分析方法,是生物大分子研究領(lǐng)域的一大突破。FTIR現(xiàn)已被用來(lái)觀測(cè)分析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化,檢測(cè)脂質(zhì)和糖類的含量及種類。

2.1FTIR在生物大分子上的應(yīng)用

2.1.1FTIR在蛋白質(zhì)上的應(yīng)用。

蛋白質(zhì)是一類極為重要的生物大分子,幾乎各種生命活動(dòng)都與蛋白質(zhì)有關(guān),蛋白質(zhì)的構(gòu)象影響蛋白質(zhì)的功能。FTIR可觀測(cè)到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的微小變化,定量分析蛋白質(zhì)的各二級(jí)結(jié)構(gòu),逐漸發(fā)展成為定量分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)常用的手段[6-7]。

蛋白質(zhì)受到物理或者化學(xué)因素的影響,二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,蛋白質(zhì)變性后二級(jí)結(jié)構(gòu)中的α-螺旋向β結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化,但是一級(jí)結(jié)構(gòu)沒(méi)有改變。紅外光譜分析蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的步驟[6]:首先對(duì)蛋白質(zhì)在酰胺 Ⅰ 帶的紅外特征吸收峰進(jìn)行分辨率增強(qiáng)處理,得到蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組分的個(gè)數(shù)和位置;其次對(duì)酰胺 Ⅰ 帶進(jìn)行光譜分峰擬合得到不同蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。Glassford等[8]介紹了衰減全反射-傅里葉紅外光譜技術(shù)(ATR-FTIR)作為無(wú)標(biāo)記、非破壞性的分析技術(shù),應(yīng)用在蛋白質(zhì)呈像上的最新研究結(jié)果。Sarroukh等[9]利用ATR-FTIR研究類淀粉蛋白的結(jié)構(gòu)和生物功能,認(rèn)為該技術(shù)在研究結(jié)構(gòu)蛋白聚集轉(zhuǎn)化到多肽過(guò)程中的持續(xù)觀測(cè)優(yōu)勢(shì)。沈子威等[10]利用FTIR研究在不同頻率和不同功率的強(qiáng)聲波作用下花粉細(xì)胞的細(xì)胞壁蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化,結(jié)果顯示400 Hz的強(qiáng)聲波對(duì)細(xì)胞壁膜的相行為及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)具有明顯的影響。劉鷺等[11]為了探討鉻對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響,使用FTIR分析鉻作用前后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化,結(jié)果顯示,鉻與蛋白的鍵合導(dǎo)致大分子蛋白中的α-螺旋結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)被破壞,導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性。

2.1.2FTIR在糖上的應(yīng)用。

廣泛分布在植物體各種組織中的糖是植物碳水化合物的重要運(yùn)轉(zhuǎn)和存儲(chǔ)物質(zhì)。植物生理上,糖的測(cè)定常使用蒽酮比色法,可是這種方法不僅繁瑣,更具有危險(xiǎn)性。FTIR的使用能夠大大降低試驗(yàn)過(guò)程中的安全隱患。

常靜等[12]利用傅里葉變換紅外光譜測(cè)定不同等級(jí)靈芝的多糖含量,結(jié)果表明,不同等級(jí)靈芝的吸光度變量與靈芝多糖含量之間顯著相關(guān) 。Wang[13]采用FTIR對(duì)來(lái)自14個(gè)地區(qū)的白英細(xì)胞壁中半纖維素、多糖、木質(zhì)素3個(gè)指標(biāo)進(jìn)行快速鑒定對(duì)比,發(fā)現(xiàn)這3個(gè)指標(biāo)可以作為特征值,來(lái)鑒別不同地區(qū)的白英。李倫[1]研究了木蘭科14種植物不同葉齡的紅外光譜,發(fā)現(xiàn)盡管紅外光譜吸收峰的位置基本一致,然而特征峰不同,通過(guò)數(shù)據(jù)擬合以及子峰峰高比分析,可以計(jì)算多糖的相對(duì)含量。孫元琳等[14]建立了一套對(duì)果膠多糖酯化度快速鑒定的方法,與過(guò)去的化學(xué)滴定法相比,F(xiàn)TIR大大提高了工作效率,是一種可行的方法。

2.1.3FTIR在脂質(zhì)上的應(yīng)用。

FTIR在脂質(zhì)上應(yīng)用也越來(lái)越常見(jiàn)。由脂肪酸和醇反應(yīng)生成的酯及其衍生物統(tǒng)稱為脂類,包括油脂、類脂、類固醇等。通常情況下脂質(zhì)的測(cè)定采用索氏提取法,然而這種方法存在很多弊端,F(xiàn)TIR的使用可以彌補(bǔ)這些不足。

Wang等[15]研究表明,F(xiàn)TIR能夠有效測(cè)定南美油藤種子不飽和脂肪酸和亞麻酸的含量,并且能夠表明種子發(fā)育過(guò)程中基因表達(dá)和脂質(zhì)/不飽和脂肪酸積累之間的關(guān)系。Dean等[16]通過(guò)控制淡水中N含量,利用FTIR檢測(cè)衣藻和淡水藻中脂質(zhì)的含量,衣藻和淡水藻的快速代謝反應(yīng)能夠改變其營(yíng)養(yǎng)的可利用性,F(xiàn)TIR可作為一種有效的方法用于高通量脂質(zhì)誘導(dǎo)的測(cè)定。范璐等[17]分析大豆、棕櫚、芝麻、菜籽、花生、棉籽、米糠、油8種植物的成分,通過(guò)植物的紅外吸收光譜,可以對(duì)8種植物的油脂進(jìn)行鑒定。

目前,F(xiàn)TIR在生物大分子上應(yīng)用主要集中在對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定,對(duì)核酸、脂質(zhì)和糖類的研究相對(duì)較少,需進(jìn)一步研究。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年

2.2FTIR在親緣地理學(xué)上應(yīng)用

目前,研究植物親緣地理關(guān)系的主要方法是分子生物學(xué)方法和生物化學(xué)方法,但是這些方法的應(yīng)用存在以下幾個(gè)弊端:方法技術(shù)復(fù)雜;需要大量的化學(xué)試劑;樣品處理耗時(shí)且耗資[18]。FTIR在親緣地理學(xué)上的應(yīng)用很大程度上解決了上述問(wèn)題。FTIR主要運(yùn)用不同種群的植物具有不同的化學(xué)成分,不同的化學(xué)成分產(chǎn)生紅外光譜特征吸收峰的強(qiáng)度和位置峰形不同,這些特性是人們鑒別植物類群及其親緣關(guān)系的主要依據(jù),也就是FTIR的“指紋”特征。

近年來(lái),F(xiàn)TIR在系統(tǒng)分類方面取得了很多進(jìn)展,涉及苔蘚植物、蕨類植物、被子植物等高等植物。田蘭婷等[19]鑒定9種來(lái)自于陜西省的大戟屬葉片紅外光譜,分析比較這些圖譜的差異,劃分地錦草、大戟、華北大戟、湖北大戟、南大戟、乳漿大戟和澤漆為一類,甘遂和續(xù)隨子各自單獨(dú)為一類。Gao等[20]研究了長(zhǎng)序榆的親緣地理關(guān)系,F(xiàn)TIR結(jié)果表明浙江開(kāi)化、浙江遂呂和江西武寧是一個(gè)類群,浙江松陽(yáng)和福建南平是一個(gè)類群,安徽歙縣和浙江臨安是另一個(gè)類群。Jungandreas等[21]研究表明,F(xiàn)TIR對(duì)硅藻細(xì)胞應(yīng)對(duì)各種非生物因素的生理和生化反應(yīng)的研究是有效的技術(shù)支撐。有學(xué)者采用FTIR測(cè)定研究草豆蔻、紅豆蔻、云南草蔻和長(zhǎng)柄山姜4種姜科植物,得出云南草蔻和草豆蔻的親緣關(guān)系最近[22]。羅庇榮等[23]對(duì)杜鵑4個(gè)亞屬的花瓣進(jìn)行FTIR測(cè)試,結(jié)果顯示同種花瓣峰形相似,不同種花瓣峰形有差異,證明了FTIR能夠應(yīng)用于準(zhǔn)確鑒別4個(gè)杜鵑亞屬。FTIR也被應(yīng)用于苔蘚的分類??桌璐旱萚24]利用該技術(shù)測(cè)定齒邊縮葉蘚、多枝縮葉蘚和中華縮葉蘚3種縮葉蘚屬植物的紅外譜圖,分類結(jié)果顯示水平衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜法具有較好的可行性。

有研究表明,F(xiàn)TIR在親緣地理學(xué)上的應(yīng)用存在缺陷,在有些情況下FTIR不能測(cè)定同屬不同種間的植物。陳國(guó)奇等[25]使用OMNI采樣器-傅里葉變換紅外光譜對(duì)8科80種草本被子植物種子進(jìn)行檢測(cè),聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),其中有8組植物與親緣關(guān)系不同的其他屬植物混合在一起,在7組同種不同亞種或品種植物中,僅有1組植物被聚合在一起,也說(shuō)明FTIR在對(duì)植物親緣關(guān)系研究或者分類上具有一定的局限性。但是隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,F(xiàn)TIR與其他技術(shù)的聯(lián)用為解決這個(gè)弊端提供了可能。

2.3FTIR在生理學(xué)上應(yīng)用

植物生理學(xué)上常見(jiàn)的有機(jī)物測(cè)定往往是在植物樣品進(jìn)行提取、分離、蒸餾等多種方式之后對(duì)提取液進(jìn)行分析測(cè)定。這種方法存在很多局限性,不僅樣品的提取需要消耗人力、物力和財(cái)力,而且因?yàn)榉治龅慕Y(jié)果不是原有活體狀態(tài)下進(jìn)行的檢測(cè),所以其結(jié)果往往存在多重誤差。另外,植物樣品中的成分多且復(fù)雜,會(huì)導(dǎo)致樣品中各種分光譜之間相互疊加或者是特征峰的重疊。FTIR在生理學(xué)上的應(yīng)用大大解決了這些問(wèn)題,傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)植物樣品進(jìn)行檢測(cè)時(shí),不用化學(xué)處理,大大縮短了人資物力消耗。其次,在原有活體狀態(tài)下對(duì)植物樣品中的有機(jī)物進(jìn)行檢測(cè),沒(méi)有破壞原有植物樣品的組織和結(jié)構(gòu),相對(duì)避免了結(jié)果誤差。再者,F(xiàn)TIR應(yīng)用簡(jiǎn)單、方便、易于操作??傊?,F(xiàn)TIR具備這些優(yōu)點(diǎn),使其在植物生理上的應(yīng)用被越來(lái)越多的人接受[26]。

付川等[27]利用FTIR研究紫花苜蓿對(duì)銅脅迫的耐性機(jī)理,用不同濃度銅處理紫花苜蓿的根莖葉后,采用FTIR測(cè)其化學(xué)成分的變化,結(jié)果顯示銅對(duì)紫花苜蓿的化學(xué)成分影響不大。然而薛生國(guó)等[28]采用FTIR測(cè)定錳脅迫處理后的酸模葉蓼,發(fā)現(xiàn)錳濃度較低時(shí),莖組織里的糖類和氨基酸等有機(jī)物增加,葉組織中的氨基酸、多肽和蛋白質(zhì)類物質(zhì)含量增大,當(dāng)錳濃度升高時(shí),植物耐錳性增強(qiáng),但是有機(jī)物含量下降。吳秀文等[29]研究鉀硼脅迫對(duì)棉花葉片物質(zhì)成分的影響,F(xiàn)TIR結(jié)果表明缺少鉀處理時(shí)有4個(gè)特征峰消失,其他特征峰的吸光值低于對(duì)照處理,說(shuō)明蛋白質(zhì)、核糖、可溶性糖、纖維素的含量降低并且結(jié)構(gòu)發(fā)生改變;缺硼處理時(shí),特征峰的吸光值高于對(duì)照組,說(shuō)明缺硼阻礙蛋白質(zhì)、可溶性糖等碳水化合物的運(yùn)輸導(dǎo)致含量增加;在硼鐵同時(shí)缺少時(shí),吸收強(qiáng)度和特征峰的位置與對(duì)照處理有很大的差別,發(fā)現(xiàn)多糖和核酸含量降低,而可溶性糖和蛋白質(zhì)的含量增加。Xie等[30]比較現(xiàn)代楠木和古代埋葬楠木的化學(xué)成分、化學(xué)結(jié)構(gòu)和精油成分,F(xiàn)TIR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)古代楠木的木質(zhì)素高于現(xiàn)在楠木,但是現(xiàn)在楠木的半纖維素含量高于古代楠木。

3展望

近年來(lái),計(jì)算機(jī)技術(shù)飛速前進(jìn)推動(dòng)了FTIR的發(fā)展,許多行業(yè)利用其來(lái)鑒別物質(zhì)的真?zhèn)魏秃康亩嗌?,但是FTIR也存在一些缺陷,需要人們對(duì)FTIR進(jìn)行不斷的完善和補(bǔ)充。

未來(lái)FTIR的發(fā)展主要趨向于建立各種標(biāo)準(zhǔn)光譜特征數(shù)據(jù)庫(kù),方便快速準(zhǔn)確地鑒別物質(zhì)屬性,如完善建立蛋白質(zhì)或者核酸的特征數(shù)據(jù)庫(kù),便于精準(zhǔn)地實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)或核酸的鑒定。其次,F(xiàn)TIR向儀器的專門(mén)化、微型化和普及化的方向發(fā)展[31]。例如,在大氣監(jiān)測(cè)領(lǐng)域出現(xiàn)了遙感FTIR,這種大氣監(jiān)測(cè)技術(shù)是根據(jù)實(shí)際情況發(fā)展而成,不僅能夠同時(shí)檢測(cè)多種大氣中存在的化合物,而且能夠提供遠(yuǎn)距離的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[32]。20世紀(jì)80年代初將顯微技術(shù)應(yīng)用到傅里葉變換紅外光譜儀,誕生了衰減全反射-傅里葉變換紅外光譜,使微區(qū)成分的分析變得方便而快捷,主要應(yīng)用于塑料、橡膠、紡織等領(lǐng)域的檢測(cè),近年來(lái)在物質(zhì)的化學(xué)行為或者物理方面也開(kāi)始使用[33]。紅外發(fā)展的方向主要是紅外連用技術(shù),相繼出現(xiàn)了變溫紅外、高壓紅外、紅外光聲光譜、偏振紅外、紅外遙感技術(shù)和色散光譜[34]。傅立葉變換紅外光譜儀與色譜的聯(lián)用可進(jìn)行多組分樣品的分離與定性,傅立葉變換紅外光譜儀與熱重聯(lián)用可進(jìn)行樣品的熱穩(wěn)定性研究,與拉曼光譜聯(lián)用可得到紅外光譜弱吸收的信息[35]。

FTIR具有傳統(tǒng)化學(xué)分析法所不可比擬的優(yōu)越性,這種方法能夠快速而準(zhǔn)確地鑒定植物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和成分,對(duì)植物生理生化有深遠(yuǎn)的影響。目前,傅里葉紅外光譜與其他技術(shù)的聯(lián)用為精準(zhǔn)有效地鑒定植物親緣地理關(guān)系提供了可能,未來(lái)FTIR在植物學(xué)上的應(yīng)用將在生物大分子和測(cè)定植物生理生化2個(gè)方面得到更廣泛的推廣。

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