明萌 何靜雯 盧丹 謝曉鴻

摘要[目的]研究“琉球紅”對低溫的耐受能力。[方法]試驗(yàn)采用盆栽方法，以“琉球紅”杜鵑為試驗(yàn)材料，研究了“琉球紅”杜鵑葉片中3種保護(hù)酶活性[過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）]、相對電導(dǎo)率、丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白含量等理化指標(biāo)，在0、-3和-6 ℃（T1、T2和T3）低溫條件下，處理1、2、3、4、5、6 d時(shí)的變化情況。[結(jié)果]在低溫脅迫下“琉球紅”杜鵑葉片中MDA含量，可溶性蛋白含量，及“琉球紅”杜鵑葉片保護(hù)酶CAT、POD和SOD活性先升高，且在低溫脅迫4 d時(shí)，MDA含量、可溶性蛋白含量和酶活性達(dá)到最高，隨著低溫脅迫時(shí)間的增加，MDA含量、可溶性蛋白含量和保護(hù)酶活性開始下降，在低溫脅迫6 d時(shí)達(dá)到最低，且杜鵑葉片出現(xiàn)輕微萎蔫情況與對照變化較為明顯。試驗(yàn)證明“琉球紅”杜鵑在-6 ℃低溫脅迫3 d內(nèi)保持著正常的生理指標(biāo)，在低溫脅迫3 d后，包括外部形態(tài)特征、保護(hù)酶活性均發(fā)生較明顯變化。在低溫脅迫下“琉球紅”杜鵑通過提高保護(hù)酶活性及可溶性蛋白含量等，減少了活性氧（ROS）的積累和膜脂過氧化產(chǎn)物的產(chǎn)生，增強(qiáng)了“琉球紅”杜鵑耐低溫脅迫的能力，但是隨著低溫脅迫時(shí)間的增加，植物細(xì)胞受到不可逆的破壞，導(dǎo)致抗氧化酶活性下降，試驗(yàn)表明，“琉球紅”杜鵑能耐受的較低溫度為-3 ℃。[結(jié)論]該研究可為寧波及周邊城市將“琉球紅”作為綠化植物提供參考。

關(guān)鍵詞低溫脅迫；杜鵑；生理指標(biāo)；抗氧化系統(tǒng)

中圖分類號S685.21文獻(xiàn)標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2017）23-0029-03

Effects of Low Temperature Stress on the Physiological Characteristics of Rhododendron hybridum “Liuqiuhong”

MING Meng1，2，HE Jingwen1，2，LU Dan2，WU Yueyan2* et al

（1 College of Fisheries and Life Sciences，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306；2 College of Biological and Environmental Sciences ，Zhejiang Wanli University，Ningbo， Zhejiang 315100）

Abstract[Objective] In order to study the tolerance of “Liuqiuhong” to low temperature.[Method]By pot experiment with Rhododendron hybridum “Liuqiuhong” as experimental material，studied the changes of 3 kinds of antioxidant enzymes in the leaves of Rhododendron hybridum “Liuqiuhong”（CAT，POD and SOD），relative conductivity，malondialdehyde （MDA） content，soluble protein content ，under 0 ℃，-3 ℃ and -6 ℃（T1，T2 and T3） low temperature conditions for 1 d，2 d，3 d，4 d，5 d，6 d.[Result] Under low temperature stress，Rhododendron hybridum “Liuqiuhong” in the leaves of （MDA） content，soluble protein content，and Rhododendron hybridum “Liuqiuhong” leaf antioxidant enzymes CAT，POD and SOD activity increased at first，and MDA content，soluble protein content and enzyme activity was the highest after low temperature stress for 4 days.With the increase of low temperature stress time，MDA content，the soluble protein content and enzyme activity declined firstly，reached the lowest point after cold stress 6d ，and slight wilting in Rhododendron hybridum and control more obvious changes.The results showed that the Rhododendron hybridum “Liuqiuhong” maintained normal physiological indexes in the -6 ℃ low temperature stress 3 d，and the changes of the external morphological characteristics，antioxidant enzyme activities were significantly changed after chilling stress in 3 d.Under low temperature stress Rhododendron hybridum “Liuqiuhong” by improving antioxidant enzyme activity，antioxidant content and soluble protein content，reduced the accumulation of reactive oxygen species （ROS） and lipid peroxidation products，enhanced the ability of resistance to low temperature stress，but with the increase of stress time，plant cells were irreversibly damaged，resulting in antioxidant enzyme activity concentration decreased.The experiment showed that the lower temperature of the “Liuqiuhong” Rhododendron hybridum can be tolerated was -3 ℃.[Conclusion]The research can give reference for using “Linqiuhong”as a green plant in Ningbo and surrounding cities.

Key wordsLow temperature stress；Rhododendron hybridum；Physiological index；Antioxidant system

杜鵑花（Rhododendron），是杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑花屬（Rhododendron L.），常綠或落葉灌木，是世界盆栽花卉生產(chǎn)的主要種類之一[1-2]。低溫脅迫是植物栽培中經(jīng)常遇到的一種災(zāi)害，低溫會影響植物生長代謝以及地理分布，并會給生產(chǎn)帶來嚴(yán)重?fù)p失 [3]，尤其杜鵑為浙江省寧波市重要的綠化植物，但能應(yīng)用于園林綠化的品種較單一，花色較為單調(diào)，“琉球紅”作為花色艷麗、花期較長的品種，對其進(jìn)行耐低溫的研究尤為重要。通過探討不同低溫下“琉球紅”杜鵑的脅迫反應(yīng)，對該品種的抗寒性進(jìn)行系統(tǒng)地評價(jià)，旨在為今后杜鵑優(yōu)良品種作為園藝和綠化材料在寧波及環(huán)境相似地區(qū)的篩選和推廣提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料來源于寧波市北侖區(qū)柴橋鎮(zhèn)萬景杜鵑園，為36株生長狀況相近、株高相似的成熟 “琉球紅” 杜鵑。

1.2試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2016年 9—11月在浙江萬里學(xué)院植物生理與分子改良實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，

每盆定植1株，設(shè)置3個(gè)溫度水平0 ℃（T1）、-3 ℃（T2）、-6 ℃（T3）進(jìn)行人工低溫脅迫，在以25 ℃（CK）為對照，對照和每個(gè)處理均選取3盆，重復(fù)3次，常規(guī)管理。將杜鵑放入低溫生化培養(yǎng)箱，對照各處理空氣相對濕度為70%～80%，光照/黑暗處理為12 h/12 h[4]，光強(qiáng)為216 μmol/（m2·s），共處理6 d，在處理期間適時(shí)補(bǔ)充水分，保持土壤濕潤，并在低溫處理的1、2、3、4、5、6 d時(shí)分別隨機(jī)取樣，采樣時(shí)各處理和對照隨機(jī)選取杜鵑的中部功能葉片，置于-80 ℃超低溫冰箱或液氮中保存，并觀察各處理與對照植株和葉片的形態(tài)特征，之后分別測定杜鵑葉片的丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白含量、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性，以上各指標(biāo)均隨機(jī)取樣，重復(fù)3次進(jìn)行測定。

1.3測定項(xiàng)目與方法

1.3.1葉片形態(tài)特征的觀測。

觀測各處理和對照的“琉球紅”杜鵑，每株隨機(jī)選擇5根枝條，統(tǒng)計(jì)每根枝條的葉片數(shù)，重復(fù)3次，記錄各處理的葉片數(shù)平均值。根據(jù)記錄的生長情況，進(jìn)行綜合評定。

1.3.2抗氧化酶活性測定。可溶性蛋白測定采用考馬斯亮藍(lán)法[5]；MDA采用硫代巴比妥酸法[6]；SOD測定采用NBT光化還原法[7]；POD活力測定采用愈創(chuàng)木酚法[7]；CAT測定采用紫外吸收法[8]，以上測定值，均取3次測定的平均值。

1.4統(tǒng)計(jì)分析方法試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用Excel和Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1低溫脅迫下“琉球紅”杜鵑葉片形態(tài)的變化

如表1和圖1所示，不同低溫脅迫時(shí)間下，杜鵑葉片形態(tài)發(fā)生變化。CK、T1、T2葉片基本都為綠色，葉片基本無卷曲萎蔫，無脫落現(xiàn)象。T3葉片在低溫脅迫1 d后仍保持綠色，無卷曲萎蔫，且無脫落，但在低溫脅迫2 d后葉片顏色開始變深，出現(xiàn)輕微的卷曲萎蔫，至第5、6天葉片出現(xiàn)脫落情況但不嚴(yán)重。

2.2低溫脅迫對“琉球紅”杜鵑理化特性的影響

2.2.1低溫脅迫對“琉球紅”杜鵑MDA的影響。

MDA含量隨著低溫脅迫程度的加強(qiáng)而升高，與細(xì)胞膜透性呈正相關(guān)，與植物的抗寒性呈負(fù)相關(guān)[9]。因此，MDA 積累越多說明植物受脅迫傷害越重，抗性越差。如圖2所示，T1、T2和T3“琉球紅”杜鵑葉片中丙二醛的含量在低溫脅迫下呈上升趨勢，且在第5、6天時(shí)達(dá)到最大值，T1與CK變化不顯著（P>005），T2和T3變化較顯著（P<0.05），這表明，隨著低溫脅迫程度的增強(qiáng)和脅迫時(shí)間的增加，丙二醛含量升高，杜鵑細(xì)胞遭到破壞，致使杜鵑葉片內(nèi)部結(jié)構(gòu)破損。

2.2.2可溶性蛋白含量的變化。

在一定的脅迫條件下，植物體內(nèi)蛋白質(zhì)含量的提高是植物對逆境脅迫適應(yīng)的一種表現(xiàn)，可作為植物相對抗性的一種指標(biāo)[10]。如圖3所示，CK體內(nèi)蛋白質(zhì)含量趨于穩(wěn)定，在低溫脅迫下T1體內(nèi)蛋白質(zhì)含量變化不顯著（P>0.05），T2和T3體內(nèi)蛋白質(zhì)含量開始上升，且在脅迫第3天達(dá)到最大值，之后杜鵑葉片中可溶性蛋白含量開始下降，T2變化不顯著（P>0.05），T3變化顯著（P<005）。這表明，在低溫脅迫下，杜鵑通過增加可溶性蛋白的含量來提高對低溫的抗性，T2和T3在低溫脅迫3 d后，可溶性蛋白含量開始降低，可能是長時(shí)間的低溫脅迫下，細(xì)胞內(nèi)

部遭到一系列不可逆的破壞，致使其細(xì)胞損壞，抑制了蛋白質(zhì)的合成。

2.2.3保護(hù)酶活性的變化。CAT、POD、SOD 是生物體內(nèi)重要的保護(hù)酶，在消除超氧化物自由基、減輕脂質(zhì)過氧化作用和膜傷害方面起重要作用[11]。由圖4可知，CK和T1的保護(hù)酶活性變化不顯著，T1基本呈平緩的先上升后下降的趨勢，T2和T3在低溫脅迫下保護(hù)酶活性總體趨勢先上升后下降，SOD變化不顯著（P>0.05），且CAT和POD變化較為明顯（P<0.05），保護(hù)酶活性在低溫脅迫第4天左右達(dá)到最高值。這表明，在低溫脅迫下，杜鵑通過增加保護(hù)酶的活性來抵抗外界低溫環(huán)境，而抗氧化酶的活性在5 d后呈下降趨勢，可能是因?yàn)殚L時(shí)間的低溫脅迫，杜鵑體內(nèi)細(xì)胞遭到破壞，保護(hù)酶的合成受到阻礙。

3結(jié)論與討論

早期研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，植物正常代謝失衡，MDA 含量提高，保護(hù)酶活性增大，可以通過保護(hù)酶活性的提升增強(qiáng)對低溫的抵御能力，同時(shí)葉片的滲透調(diào)節(jié)能力也失衡，可以靠提高可溶性物質(zhì)含量來增強(qiáng)抗寒性。溫度越低，保護(hù)酶活性和可溶性物質(zhì)的含量越高[12]。-6 ℃條件下進(jìn)行人工低溫脅迫，杜娟“琉球紅”新陳代謝嚴(yán)重失衡，植物細(xì)胞受到的傷害無法恢復(fù)。

在該試驗(yàn)研究中，杜鵑“琉球紅”品種，在低溫脅迫下，MDA 的含量呈不斷上升趨勢，其是細(xì)胞膜脂過氧化的重要產(chǎn)物，它會使植物細(xì)胞的生物膜受到損傷，這與前人研究的結(jié)果一致[13-14]。SOD活性的提高催化了超氧陰離子自由基的歧化作用，形成分子氧和過氧化氫，POD 和 CAT活性的提高能有效地清除植物體內(nèi)的過氧化氫。0、-3、-6 ℃人工低溫脅迫下，SOD、POD和CAT均呈先上升后下降趨勢，表明杜鵑是通過增加抗氧化酶的活性來抵抗外界低溫環(huán)境，但隨著低溫脅迫時(shí)間和程度的增加，杜鵑的新陳代謝嚴(yán)重失衡，其受到的傷害需要較長的時(shí)間恢復(fù)甚至無法恢復(fù)[15-16]?？扇苄缘鞍踪|(zhì)參與植物細(xì)胞內(nèi)滲透勢的調(diào)控，為細(xì)胞活動提供能量并傳遞相關(guān)信息，在植物抵抗逆境脅迫的過程中起到關(guān)鍵作用。試驗(yàn)結(jié)果表明，低溫脅迫開始時(shí)，可溶性蛋白含量逐漸升高，隨著低溫脅迫程度和時(shí)間的增加，其含量開始下降。開始可溶性蛋白含量的增加，可能是由于低溫促進(jìn)了相關(guān)保護(hù)酶的合成，保護(hù)酶的增加使得杜鵑對低溫的抗性增加。剛開始可溶性蛋白含量的增加也可能是某些大分子蛋白的分解所導(dǎo)致的，但是，由于低溫脅迫程度和時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)遭到破壞，并以氨基酸的形式而存在，在不斷低溫脅迫下，蛋白質(zhì)的相關(guān)合成酶系統(tǒng)受損，也可能會導(dǎo)致可溶性蛋白含量的下降，與前人研究的結(jié)果一致[17-19]。綜上所述，可溶性蛋白的含量與“琉環(huán)紅”杜鵑抗寒性之間有必然的聯(lián)系。

綜上所述，在該試驗(yàn)中，杜鵑在低溫脅迫下，其生理生化變化規(guī)律明顯：在長時(shí)間的低溫脅迫下，葉片會由綠色變?yōu)楹稚霈F(xiàn)落葉情況，枝干顏色加深。MDA含量、可溶性蛋白含量、POD、SOD和CAT酶的活性出現(xiàn)規(guī)律性變化。因此，綜合各項(xiàng)生理生化指標(biāo)的變化，“琉球紅”杜鵑是較為耐寒的，溫度在-3 ℃以上就可以維持正常的生理活性和生長，甚至在短時(shí)間的-6 ℃也能對低溫脅迫產(chǎn)生一定的抗性，但是在極低的溫度下，會導(dǎo)致其新陳代謝嚴(yán)重失衡，細(xì)胞受損，不能完成正常生理周期和生長。試驗(yàn)表明，“琉球紅”杜鵑能耐受的較低溫度為-3 ℃，其在南方大多數(shù)城市的冬季能夠正常生長和開花，可以作為良好的綠化候選品種。

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