江楠 李瀟彬 顧曼琦 廖莉玲

摘要[目的]建立頭花蓼中多酚含量的比色測(cè)定方法。[方法]以沒(méi)食子酸為對(duì)照品，對(duì)測(cè)定頭花蓼中多酚含量的比色條件（包括檢測(cè)波長(zhǎng)、Na2CO3用量、Folin-Ciocalteu 試劑用量、反應(yīng)溫度及時(shí)間對(duì)吸光值的影響）進(jìn)行了研究。[結(jié)果]當(dāng)FC試劑用量為2.5 mL，12% Na2CO3用量為7 mL時(shí)，在35 ℃下反應(yīng)40 min為最佳反應(yīng)條件；多酚的含量與760 nm 處吸光度呈良好的線性關(guān)系；測(cè)定方法的平均回收率為98.66%，RSD為0.380%。[結(jié)論]該方法不僅操作簡(jiǎn)單，而且穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、精密度好，能夠用于頭花蓼提取液多酚含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞頭花蓼；多酚；Folin-Ciocaheu 比色法；檢測(cè)條件

中圖分類號(hào)S567文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）23-0114-02

Determination of Polyphenols in Polygonum capitatum by FolinCiocalteu Colorimetry

JIANG Nan1，LI Xiaobin2，GU Manqi2，LIAO Liling2*

（1.Guizhou Institute of Light Industry，Guiyang，Guizhou 550025；2.School of Chemistry and Material Science，Guizhou Normal University，Guiyang，Guizhou 550001）

Abstract[Objective] The research aimed to establish a colorimetric method for the determination of polyphenols in Polygonum capitatum. [Method]To gallic acid as a reference substance，the colorimetric conditions （the effects of detection wavelength，Na2CO3 dosage，F(xiàn)olinCiocalteu reagent dosage，reaction temperature and time on the absorbance value） were studied.[Result]When FolinCiocalteu reagent was 2.5 mL and 12% sodium carbonate solution was 7 mL， reaction 40 min at 35 ℃，there was a good linearity between the absorbance and gallic acid concentration in 760 nm，the average recovery was 98.66%and RSD was 0.380%.[Conclusion]This method is simple，accurate，repeatable and stable.It can be used for the determination of polyphenol content in Polygonum capitatum.

Key wordsPolygonum capitatum；Polyphenol；FolinCiocaileu colorimetry；Detecting condition

基金項(xiàng)目貴州省科技廳_2014 年度貴州省科技廳與貴州師范大學(xué)聯(lián)合基金計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合LH字[2014]7064號(hào)）。

作者簡(jiǎn)介江楠（1962—），女，貴州遵義人，副教授，從事食品化學(xué)、藥物化學(xué)方向研究。*通訊作者，教授，碩士，碩士生導(dǎo)師，從事天然產(chǎn)物研究。

收稿日期2017-05-31

頭花蓼（Polygonum capitatum）為蓼科 （Polygonaceae） 蓼屬（Polygonum L.）多年生植物，又名小紅要、小紅藤等，主要分布在貴州、云南等地，現(xiàn)廣泛用于治療泌尿系統(tǒng)疾病[1] 。目前從頭花蓼中分離和鑒定的主要化合物為黃酮類、酚酸類、有機(jī)酸、醇、酯、醛類等[2-3]。方煒等[4]用高速逆流色譜法同時(shí)分離制備得到頭花蓼中沒(méi)食子酸和原兒茶酸；劉躍等[5]建立了頭花蓼藥材中沒(méi)食子酸、 原兒茶酸、 陸地棉苷、 槲皮苷、 兒茶素、槲皮素- 3- O- （2″- 沒(méi)食子?；? 鼠李糖苷及槲皮素的 UPLC- MRM- MS 檢測(cè)方法；李占彬等[6]利用HPLC - MS/MS 同時(shí)測(cè)定頭花蓼中6種酚酸類有效成分。這些檢測(cè)方法雖然結(jié)果精確，但所需要的儀器價(jià)格高昂，操作也復(fù)雜。Folin-Ciocalteu 比色法由于操作簡(jiǎn)單、成本低， 已廣泛用于測(cè)定植物中多酚的含量[7-10]。筆者探討了Folin-Ciocalteu 比色法測(cè)定頭花蓼總多酚的條件。

1材料與方法

1.1儀器101-1A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司），A200S型電子天平（Made in Germany），循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），KDM型控溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司），UV2300分光光度計(jì)（上海天美科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)Z102型微型植物粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）[7]。

1.2試材頭花蓼（施秉三元威門公司），沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（貴州迪大生物科技有限公司），F(xiàn)olin-Ciocalteu （分析純）。

1.3方法

1.3.1對(duì)照品溶液的制備。

精密稱取沒(méi)食子酸0.025 0 g，精確配制成0.025 0 mg/L的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2頭花蓼樣液制備。

在70 ℃下將2.0 g頭花蓼粉末用100 mL水回流提取2次，每次1 h。將提取液稀釋于500 mL即得到待測(cè)試樣。

1.3.3Folin-Ciocalteu 法檢測(cè)條件。

1.3.3.1比色波長(zhǎng)的測(cè)定。

分別移取2.0 mL標(biāo)準(zhǔn)液和樣品液，加入2.0 mL FC試劑及6.0 mL 12% 的Na2CO3 后稀釋至25 mL，30 ℃顯色1 h后，在 400～ 900 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，確定最佳檢測(cè)波長(zhǎng)。

1.3.3.2FC試劑用量的研究。

取1 mL樣品液、6 mL 12% Na2CO3 溶液，然后分別加入 0.5、1.0、1.5、2.0、 2.5、3.0 mL的 FC試劑，均定容到25 mL棕色容量瓶中，30 ℃ 下 顯色 1 h后以試劑空白作參比， 在760 nm 下測(cè)定吸光度 。

1.3.3.3Na2CO3用量的研究。

取1 mL樣品液、2.5 mL FC試劑，12% Na2CO3溶液的用量分別為3、4、5、6、7、8 mL，均定容到25 mL棕色容量瓶中，30 ℃ 下 顯色 1 h后以試劑空白作參比， 在760 nm 下測(cè)定吸光度。

1.3.3.4顯色時(shí)間和溫度的確定。

取1 mL 樣品液、2.5 mL FC試劑、7 mL Na2CO3溶液，均定容至 25 mL棕色容量瓶中。分別在 20、25、30、35、40 ℃下顯色10、20、30、40、 50、60 min 后以試劑空白作參比，在 760 nm 下測(cè)定吸光度。

1.3.4方法評(píng)價(jià)

1.3.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

分別取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液10、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于25 mL棕色容量瓶中，用最適宜的條件顯色后測(cè)吸光度。以沒(méi)食子酸濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4.2穩(wěn)定性試驗(yàn)。

分別測(cè)定頭花蓼樣液顯色反應(yīng)完全（40 min） 后 0、20、 40、 60、80、100 min 的吸光度，該比色法的穩(wěn)定性根據(jù)吸光度的變化來(lái)評(píng)價(jià)。

1.3.4.3精密度試驗(yàn)。

精密量取頭花蓼樣液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定5次，以吸光度分析結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）評(píng)價(jià)該儀器精密度。

1.3.4.4重現(xiàn)性試驗(yàn)。

同一批頭花蓼樣品取5份提取樣液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法進(jìn)行檢測(cè)，以吸光度分析結(jié)果的RSD評(píng)價(jià)該比色法的重現(xiàn)性。

1.3.4.5加標(biāo)回收試驗(yàn)。

分別測(cè)定提取液中加入不同量的沒(méi)食子酸后的多酚含量，并計(jì)算其回收率和RSD，以此評(píng)價(jià)該比色方法的準(zhǔn)確度和可靠性。

2結(jié)果與分析

2.1比色條件的測(cè)定

2.1.1最佳吸收波長(zhǎng)。

從圖1可以看出，樣品液和標(biāo)準(zhǔn)液在760 nm處有最大吸光度，因此確定最佳吸收波長(zhǎng)為760 nm。

2.1.2最佳FC試劑用量。

當(dāng)FC試劑用量為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL時(shí)，吸光度分別為0.346、0.384、0.401、0429、0.461、0.460。由此可見(jiàn)，F(xiàn)C試劑用量在0.5～2.0 mL隨著用量的增加吸光度也在增加，在2.5 mL時(shí)達(dá)到最大值，之后吸光度開(kāi)始穩(wěn)定，因此選擇2.5 mL為最佳用量。

2.1.3最佳Na2CO3用量。

當(dāng)Na2CO3用量為3、4、5、6、7、8 mL時(shí)，吸光度分別為0.414、0.434、0.457、0.461、0.464、0464。由此可見(jiàn)，從7 mL開(kāi)始吸光度隨著Na2CO3用量的增加而穩(wěn)定開(kāi)始趨于平緩，因此選擇7 mL為最佳用量。

2.1.4最佳顯色溫度和時(shí)間。

從表1 可以看出，溫度較低時(shí)，顯色反應(yīng)緩慢且吸光度較??；當(dāng)溫度升高時(shí)，顯色反應(yīng)加快且吸光度增大；但溫度升至40 ℃吸光度反而降低，表明顯色溫度不能太高。因此選擇最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間為35 ℃、40 min。

2.2比色方法評(píng)價(jià)

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線。以沒(méi)食子酸溶液濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，

得出線性回歸方程y=0.131 3x+0.005 3（R2=0.999 3），線性關(guān)系良好，該方程可用于頭花蓼多酚的定量測(cè)定。

2.2.2穩(wěn)定性試驗(yàn)。在完全反應(yīng)后0、20、40、60、80、100 min時(shí)的吸光度分別為0466、0.465、0.466、0.464、0.463、0.463，RSD為0.297%。由此可見(jiàn)，溶液在100 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3精密度試驗(yàn)。溶液重復(fù)測(cè)定5次的吸光度分別為0464、0.464、0.465、0.464、0.463，RSD為0.152%。表明儀器精密度良好。

2.2.4重復(fù)性試驗(yàn)。

同一批頭花蓼分別提取5次。5份溶液的吸光度分別為0.466、0.466、0.464、0.464、0.465，RSD為0.215%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.5加標(biāo)回收試驗(yàn)。由表2可知，4次加標(biāo)回收率在98.33%～98.98%，平均回收率為98.66%，RSD為0.380%。表明該研究所建立的 Folin-Ciocaheu 檢測(cè)法準(zhǔn)確可靠，完全可用于頭花蓼多酚含量的測(cè)定。

3結(jié)論

（1）該研究采用 Folin-Ciocalteu比色法測(cè)頭花蓼多酚含量，確定最佳的顯色條件為：2.5 mL Folin-Ciocalteu 試劑、7 mL 12% Na2CO3、顯色溫度35 ℃、顯色時(shí)間40 min、測(cè)定波長(zhǎng)760 nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為y=0.131 3x+0.005 3（R2= 0.999 3）。

（2）該方法的穩(wěn)定性試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)、重現(xiàn)性試驗(yàn)、回收率試驗(yàn)的RSD分別0.297%、 0.152%、0.215%、 0.380%，表明該研究建立起的 Folin-Ciocalteu 法測(cè)定頭花蓼多酚含量可信、可靠。

參考文獻(xiàn)

[1]

貴州省藥品監(jiān)督管理局.貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[S].貴陽(yáng)：貴州科技出版社，2003：147.

[2] 謝宇，張麗麗，徐亮，等.HPLC 特征圖譜對(duì) GAP 基地產(chǎn)頭花蓼藥材品質(zhì)控制研究[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2014，21（8）：70-72.

[3] 王洪平，曹芳，楊秀偉.頭花蓼地上部分的化學(xué)成分研究[J].中草藥，2013，44（1）：24-30.

[4] 方煒，萬(wàn)金志，張麗艷.高速逆流色譜法同時(shí)分離制備頭花蓼中沒(méi)食子酸和原兒茶酸[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2011，23（2）：299-303.

[5] 劉躍，胡杰，謝玉敏，等.UPLC-MRM-MS 法測(cè)定頭花蓼藥材中 7 個(gè)指標(biāo)成分[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2015，27（1）：73-76，88.

[6] 李占彬，楊鴻波，譚紅，等.貴州特色中藥頭花蓼中六種酚酸類有效成分的 HPLC - MS/MS 同時(shí)測(cè)定[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2015，26（4）：850-852.

[7] 崔紫姣，張彩云，劉彬彬，等.Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定甜茶總多酚含量[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（3）：158-160.

[8] 劉麗香，TANGUY LAURA，梁興飛，等.Folin-Ciocalteu 比色法測(cè)定苦丁茶中多酚含量[J].茶葉科學(xué)，2008，28（2）：101-106.

[9] 牛廣財(cái)，閆公昕，朱丹，等.Folin-Ciocalteu比色法測(cè)定沙棘酒中總多酚含量的工藝優(yōu)化[J].食品與機(jī)械，2016，32（4）：80-83，142.

[10] 楊磊，隋小宇，祖元?jiǎng)?，?Folin-Ciocalteu法測(cè)定迷迭香中總酚酸含量[J].中成藥，2009，31（2）：272-275.