安翠英 周賢軒

摘要[目的]分析益生菌EcN的莢膜多糖合成基因簇，尋找致病性大腸桿菌K5菌株的肝素前體多糖替代來(lái)源。[方法]通過(guò)基因敲除、基因回補(bǔ)、1H核磁共振（NMR）檢測(cè)等技術(shù)手段，研究了kfiA基因在EcN莢膜多糖合成過(guò)程中的功能。[結(jié)果]利用λ-red重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了kfiA突變株，利用NMR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)kfiA缺失突變株的莢膜多糖特征峰消失，又通過(guò)染色體重組技術(shù)，把kfiA基因插入了EcN突變株的基因組中，核磁共振檢測(cè)重新發(fā)現(xiàn)了莢膜多糖特征峰。[結(jié)論]kfiA基因是EcN菌株莢膜多糖合成途徑的一個(gè)關(guān)鍵基因，參與了莢膜多糖合成。λ-red重組系統(tǒng)與染色體重組技術(shù)同樣適用于EcN菌株，可為后續(xù)的菌株改造提供參考。

關(guān)鍵詞莢膜多糖；肝素前體；大腸桿菌Nissle 1917；核磁共振

中圖分類號(hào)Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）23-0119-04

The Key Role of kfiA Gene in Synthesis of Capsular Polysaccharide of Escherichia coli Strain Nissle 1917

AN Cuiying，ZHOU Xianxuan*

（School of Food Science and Engineering， Hefei University of Technology， Hefei， Anhui 230009）

Abstract[Objective] The aim was to analyze genes in heparosan synthesis of EcN heparosan， and find out alternative sources of heparin precursor polysaccharide for E. coli K5 strain. [Method] We studied the key role of kfiA gene in heparosan synthesis by using the techniques， such as gene knockout， gene knockin， NMR， and so on. [Result] The kfiA was knock out with the λred recombination system. The NMR analysis showed that disappeared the specific signal of heparosan from the kfiA mutant. Furthermore， the complementary strain with a kfiA gene inserted into the EcN chromosome was constructed with a phage helped recombination system. The insertion of kfiA restored the synthesis of heparosan and the specific signal of heparosan in the NMR spectrum. [Conclusion] The kfiA plays a critical role in the synthesis of EcN heparosan. Furthermore， both the λred recombination system and the phage helped recombination system are useful as a tool for strain engineering in EcN.

Key wordsCapsular polysaccharide；Heparosan；E. coli Nissle 1917；NMR

肝素是一種應(yīng)用廣泛的抗凝血藥物。目前，藥物類肝素主要從豬小腸黏膜等動(dòng)物組織中提取純化。動(dòng)物源的肝素生產(chǎn)具有一些缺點(diǎn)，如病原污染[1]、貨源不穩(wěn)定、環(huán)境污染等。新的非動(dòng)物源肝素是一個(gè)很有前景的替代品，如化學(xué)及酶法合成肝素[2]。受到成本和產(chǎn)量等因素的影響，很有必要對(duì)非動(dòng)物源生物工程肝素及其衍生物的合成進(jìn)行深入研究。

生物工程肝素的合成以肝素前體多糖為碳鏈骨架，需要對(duì)該糖鏈上的羥基進(jìn)行磺基化修飾，使其具有抗凝血活性。肝素前體多糖主要提取自大腸桿菌K5菌株的莢膜，又可稱為莢膜多糖。大腸桿菌K5菌株的肝素前體多糖的二糖骨架與肝素結(jié)構(gòu)相似，但沒(méi)有被硫酸化，其中的葡糖醛酸也沒(méi)有被異構(gòu)化為艾杜糖醛酸[3]。在E.coli K5基因組中，控制莢膜多糖合成的基因簇由3個(gè)不同的區(qū)域組成，即Region 1、Region 2和Region 3。其中，Region 1和Region 3的基因主要負(fù)責(zé)將多糖鏈從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外；而Region 2 包括kfiA、kfiB、kfiC和kfiD基因，它們編碼的蛋白質(zhì)通常被認(rèn)為參與了控制多糖鏈的合成。Region 1由6個(gè)基因（kpsFEDUCS）組成，是一個(gè)單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄單元。在kpsF上游處有一個(gè)δ70啟動(dòng)子（PR1）。Region 3的kpsM、KpsT基因負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)多糖鏈跨過(guò)細(xì)胞膜。Region 3的啟動(dòng)子從kpsM基因上游741 bp處開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，控制Region 3及Region 2的基因表達(dá)。肝素前體多糖結(jié)構(gòu)為[-GlcUA-β（1，4）-GlcNAc-ɑ（1，4）-]n，GlcUA表示葡萄糖醛酸，GlcNAc表示N-乙酰氨基葡萄糖，n的平均值約為70）[4]。

大腸桿菌K5菌株是一種病原菌，能夠感染人的泌尿系統(tǒng)，形成生物被膜，難以治愈。因此，以大腸桿菌K5菌株的莢膜多糖作為肝素前體多糖的來(lái)源，存在安全風(fēng)險(xiǎn)。大腸桿菌Nissle 1917（EcN）菌株與大腸桿菌K5菌株的莢膜多糖合成基因簇具有相似性。EcN是腸道益生菌，有益生菌的諸多特性。它能夠合成3種不同類型的菌毛粘附于腸上皮細(xì)胞，可有效地在腸道中定殖，形成較強(qiáng)的生物被膜以抵御病原菌的入侵。在腸道中，EcN形成生物被膜的能力要強(qiáng)于致病性大腸桿菌[5]。EcN分泌小菌素H47和小菌素M能夠?qū)ζ渌≡a(chǎn)生拮抗作用[6]。EcN菌體表面的O6抗原具有特殊的脂多糖結(jié)構(gòu)，EcN的這種特殊的多糖結(jié)構(gòu)使其具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以增強(qiáng)宿主體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)能力[7]。EcN的H1型鞭毛使菌體具備較強(qiáng)的遷移能力，有利于菌體廣泛分布。此外，這種益生菌還具有6種不同的攝鐵系統(tǒng)，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)Fe3+來(lái)抑制鼠傷寒沙門氏菌等致病菌在腸道中的定殖[5]。為了找到致病性大腸桿菌K5菌株的肝素前體多糖替代來(lái)源，筆者分析了益生菌EcN的莢膜多糖合成基因簇，通過(guò)基因敲除、基因回補(bǔ)、NMR檢測(cè)等技術(shù)手段，研究了kfiA基因在EcN莢膜多糖合成過(guò)程中的功能。

1材料與方法

1.1材料

克隆載體pKD4、pKD46、pCP20、pAH123、pAH162，大腸桿菌菌株EcN、BW25142，均由合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院保存。高保真PrimeStar DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶Kpn Ⅰ、Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ、DNA 連接試劑盒DNA Ligation Kit Ver 2.1購(gòu)于TaKaRa公司；Taq DNA聚合酶購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司；SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司；其余試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。引物（表1）設(shè)計(jì)采用Vector NTI 8.0軟件，由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。大腸桿菌培養(yǎng)所用的抗生素為氨芐青霉素（Ap，100 μg/mL）、卡那霉素（Kan，50 μg/mL）、四環(huán)素（Tet，2 μg/mL）。

1.2方法

1.2.1EcN菌株中kfiA基因敲除。

EcN菌株中kfiA基因敲除采用已發(fā)表的大腸桿菌K12菌株基因敲除方法，并作少量修改[8]。根據(jù)EcN中kfiA基因編碼區(qū)的序列（GenBank登陸號(hào)：AJ586888.1）上下游39 bp為同源臂設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物P0227/P0228。聚合物鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）以pDK4為模板擴(kuò)增基因敲除片段FRT-Kan-FRT，反應(yīng)條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化后直接轉(zhuǎn)化EcN/pKD46電擊感受態(tài)細(xì)胞。卡那抗性平板用于kfiA突變株的篩選。

抗性平板上的單菌落重懸于超純水中，作為PCR模板。PCR體系中加入4條引物，分別為抗性基因Kan上的通用檢測(cè)引物P0019/P0020及EcN基因組kfiA基因上下游200 bp處的檢測(cè)引物P0229/P0230。反應(yīng)條件：98 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，51 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。

1.2.2抗性基因的去除。

將溫敏型質(zhì)粒pCP20轉(zhuǎn)化EcNΔkfiA：：Kan中，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基（Ap 100 μg/mL），30 ℃過(guò)夜培養(yǎng)。取菌液劃線于LB平板，42 ℃培養(yǎng)過(guò)夜（高溫誘導(dǎo)質(zhì)粒丟失）。將單菌落分別依次劃線于Ap100板、Kan50板、LB板，37 ℃培養(yǎng)。選擇只能在LB板上正常生長(zhǎng)的菌落進(jìn)行PCR檢驗(yàn)。PCR檢測(cè)得到的陽(yáng)性菌送至通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司進(jìn)行測(cè)序檢驗(yàn)。利用Vector NTI 8.0軟件將測(cè)序結(jié)果與預(yù)測(cè)序列進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3莢膜多糖的檢測(cè)。將過(guò)夜菌液稀釋至OD600=0.2，接至30 mL 新鮮培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。以12 000 r/min離心5 min，收集上清液各10 mL，去離子水透析。冷凍離心干燥后的樣品用500 μL D2O重懸，加入5 μL對(duì)苯二甲酸二鈉作為內(nèi)標(biāo)，混勻后加入核磁管送樣進(jìn)行NMR分析[9]。

1.2.4pAH162-kfiA載體構(gòu)建。

按照kfiA 基因序列設(shè)計(jì)引物：P0262/P0265，兩端分別引入Pst Ⅰ、EcoR Ⅰ，KpsMP擴(kuò)增引物：P0011/P0012，兩端分別引入Kpn Ⅰ、Pst Ⅰ，兩段DNA序列通過(guò)Pst Ⅰ 位點(diǎn)酶切連接成片段KpsMP-kfiA，連接體系通過(guò)膠回收得到目的條帶。為了保證啟動(dòng)子KpsMP能夠正常啟動(dòng)kfiA基因的轉(zhuǎn)錄，設(shè)計(jì)引物拼接P0291/P0292。將KpsMP-kfiA片段通過(guò)Kpn Ⅰ、EcoR Ⅰ 酶切連接構(gòu)建到載體pAH162中，重組載體命名為pAH162-kfiA，重組載體通過(guò)測(cè)序鑒定。

1.2.5kfiA基因的回補(bǔ)。

將pAH162和重組載體pAH162-kfiA分別電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)電擊感受態(tài)EcNΔkfiA/pAH123中，通過(guò)四環(huán)素抗性平板篩選得到的單克隆用PCR進(jìn)行鑒定[10]。PCR體系中加入4條引物，分別為抗性基因上的通用檢測(cè)引物P0028/P0029及EcN基因組IntΦ80位點(diǎn)的上下游檢測(cè)引物P0078/P0079。反應(yīng)條件：98 ℃ 3 min，95 ℃ 5 s，46 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。獲得的陽(yáng)性克隆分別命名為EcNΔkfiA IntΦ80：： pAH162和EcNΔkfiA IntΦ80：： pAH162-kfiA。

2結(jié)果與分析

2.1EcN菌株中kfiA基因敲除高保真酶擴(kuò)增質(zhì)粒pKD4中的FRT-Kan-FRT片段，用于基因敲除。PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)1 574 bp（圖1a），電泳結(jié)果與目的片段大小一致。

利用λ-Red重組系統(tǒng)進(jìn)行kfiA基因在EcN菌株中的敲除[8]。在EcN/pKD46菌株誘導(dǎo)表達(dá)的重組酶作用下，F(xiàn)RT-Kan-FRT片段中同源臂序列可以和基因組上的同源序列發(fā)生同源重組。利用PCR反應(yīng)檢測(cè)kfiA基因突變陽(yáng)性克隆。菌落PCR體系中加入4條引物，條帶大小分別為1 175、761 bp（圖1b），電泳檢測(cè)結(jié)果與預(yù)期相符，9個(gè)菌落全為陽(yáng)性菌。

45卷23期安翠英等大腸桿菌Nissle 1917菌株莢膜多糖合成基因kfiA的功能研究

2.2kfiA突變株的莢膜多糖檢測(cè)

利用1H核磁共振鑒定突變株是否能夠合成莢膜多糖。首先提取EcN和EcNΔkfiA的莢膜多糖，將水溶性的穩(wěn)定且不與樣品反應(yīng)的對(duì)苯二甲酸二鈉添加到樣品中作為內(nèi)標(biāo)，用1H核磁共振進(jìn)行鑒定。得到譜圖如圖2a所示，可以看出在1H NMR譜約為2 ppm處存在特征峰，是莢膜多糖的N-乙?；系臍浞澹℅lcNAc，-CH3）。核磁波譜用MestReNova軟件進(jìn)行分析，利用峰面積對(duì)莢膜多糖的含量進(jìn)行測(cè)定，如圖2b所示，野生型能夠正常合成莢膜多糖，而kfiA突變株完全不能合成莢膜多糖，說(shuō)明EcN菌株的kfiA基因?qū)υ摼昵v膜多糖合成的重要性。

提取菌落PCR檢測(cè)的陽(yáng)性菌株的質(zhì)粒，利用限制性酶切反應(yīng)進(jìn)行檢驗(yàn)。電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3b所示，質(zhì)粒被限制酶切成2個(gè)片段，條帶分別為2 883和1 776 kb，條帶大小與預(yù)期相符。為了排除PCR擴(kuò)增的DNA片段出現(xiàn)堿基突變和移碼突變的可能性，試驗(yàn)中還對(duì)拼接的DNA片段進(jìn)行了序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果與預(yù)期相符，沒(méi)有堿基突變和移碼突變。

2.4kfiA基因的回補(bǔ)

從菌落PCR檢驗(yàn)、質(zhì)粒酶切檢驗(yàn)，以及測(cè)序檢驗(yàn)都符合預(yù)期的菌株BW25142/pAH162-KpsMP-kfiA中提取質(zhì)粒，并通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)EcNΔkfiA/pAH123感受態(tài)中，菌落PCR檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，泳道1和4以EcNΔkfiA為模板作為對(duì)照，泳道2和5、3和6分別是同一單克隆，在泳道1～3的PCR體系中加入4條引物：P0028、P0029、P0078、P0079，用來(lái)檢測(cè)重組質(zhì)粒是否插入IntΦ80位點(diǎn)，在泳道4～6的PCR體系中加入引物P0230/P0263用來(lái)檢測(cè)原來(lái)的kfiA基因是否被敲除。

在泳道2、3中可以擴(kuò)出2個(gè)DNA條帶，且與預(yù)期大小相符，說(shuō)明重組質(zhì)粒已經(jīng)成功插入到EcN基因組的IntΦ80位點(diǎn)。泳道5、6條帶大小與泳道4（EcNΔkfiA）一致，說(shuō)明所挑選的2個(gè)單克隆均為陽(yáng)性克?。‥cN ΔkfiA IntΦ80：：pAH162-KpsMP-kfiA）。

2.5kfiA突變株及回補(bǔ)菌株的莢膜多糖檢測(cè)

提取4株的莢膜多糖并通過(guò)1H核磁共振檢測(cè)，核磁波譜用MestReNova軟件進(jìn)行分析。如圖5a所示，EcN野生型和kfiA回補(bǔ)菌株能夠正常合成莢膜多糖，而kfiA突變株和回補(bǔ)對(duì)照菌株不能合成莢膜多糖。將波譜中對(duì)二苯二甲酸二鈉的峰面積（化學(xué)位移為7.9 ppm）作為標(biāo)準(zhǔn)，分別對(duì)4株菌的莢膜多糖的N-乙?；姆迕娣e進(jìn)行積分，結(jié)果如圖5b所示，野生型和回補(bǔ)菌株能夠正常合成莢膜多糖，而kfiA突變株和EcNΔkfiA IntΦ80：：pAH162完全不能合成莢膜多糖，說(shuō)明kfiA基因是EcN莢膜多糖合成所必需的基因。

3結(jié)論與討論

大腸桿菌可以表達(dá)超過(guò)80種莢膜多糖，這些莢膜多糖

被定義為K抗原。細(xì)菌的莢膜多糖通常對(duì)菌體的生長(zhǎng)和繁殖有著重要影響，還對(duì)病毒的侵染具有較強(qiáng)的抵御作用[11]。大腸桿菌K5的莢膜多糖屬于糖胺聚糖類多聚物。其中，K5莢膜多糖又被稱為脫硫肝素，或N-乙酰肝素，由[（→4）β-D-GlcA（1→4）N-acetlyαDGlcNAc（1→）]n重復(fù)二糖單元組成。細(xì)菌的莢膜多糖未被硫酸化，也沒(méi)有差向異構(gòu)化形成艾杜糖醛酸，這與哺乳動(dòng)物源的硫酸肝素在結(jié)構(gòu)與活性上都有所差別。以K5莢膜多糖為起始碳鏈骨架，可通過(guò)酶法合成非動(dòng)物源肝素，使其具有抗凝血活性。但是大腸桿菌K5菌株對(duì)人體具有致病性，可引起尿道感染。若從大腸桿菌K5的莢膜中提取肝素前體多糖用來(lái)合成肝素，必須非常小心，需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的多步純化過(guò)程以排除致病因子污染。

據(jù)目前的報(bào)道，大腸桿菌EcN菌株是益生菌，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何致病因子，被認(rèn)為是一種安全菌株。在大腸桿菌EcN菌株中具有相似的莢膜多糖合成基因簇，但還缺乏相應(yīng)的研究，證明這些基因的確切功能及相應(yīng)的肝素前體多糖合成能力。該研究通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)kfiA基因的功能進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)kfiA基因編碼產(chǎn)物是該菌株的莢膜多糖合成所必需的蛋白質(zhì)。kfiA基因的敲除使EcN失去了莢膜多糖合成能力；同時(shí)，

該基因的回復(fù)突變，又重新恢復(fù)了該菌的莢膜多糖合成能力。

目前，關(guān)于益生菌EcN肝素前體多糖合成的相應(yīng)研究較少，該菌的肝素前體多糖合成機(jī)制還有更進(jìn)一步的

研究?jī)r(jià)值。此外，對(duì)益生菌EcN肝素前體多糖生物合成的調(diào)控機(jī)制研究也將有助于研究宿主對(duì)病原菌的抵抗。該研究還表明了λ-red重組系統(tǒng)與染色體重組技術(shù)除了可應(yīng)用于常見(jiàn)的無(wú)莢膜菌株之外，同樣適用于具有莢膜覆蓋的大腸桿菌EcN菌株，為后續(xù)的菌株改造奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

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