李靜　王仁才　楊耀東　吳翼　范海闊　弓淑芳

摘要：【目的】探討椰子萌芽過程中吸器內(nèi)含物的變化規(guī)律，為提高椰子種果發(fā)芽率及促進椰子產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供參考依據(jù)?！痉椒ā拷y(tǒng)計新鮮成熟的本地高種和紅矮椰子吸器發(fā)育過程中椰果的果實重量、縱橫徑、水含量、椰肉厚度及吸器重量和縱橫徑，使用紫外分光光度計測定，并分析本地高種椰子吸器萌發(fā)過程中的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）活性及可溶性蛋白和多酚含量等各組變化情況。【結(jié)果】椰果內(nèi)的液態(tài)胚乳隨著椰子吸器發(fā)育過程中體積與重量的增大逐漸減少直至完全被吸收，白色硬質(zhì)狀椰肉逐漸被吸收軟化且變褐色；多酚和可溶性蛋白含量逐漸減少，SOD和POD活性呈先上升后下降的變化趨勢；內(nèi)含物間具有密切的相關(guān)性，其中，多酚含量與SOD活性呈顯著負相關(guān)（P<0.05，下同），與可溶性蛋白含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；POD活性與可溶性蛋白含量呈顯著負相關(guān)，與SOD活性呈顯著正相關(guān)?！窘Y(jié)論】新鮮成熟椰果的吸器在發(fā)育過程中具有較高的SOD、POD活性及多酚和可溶性蛋白含量，用作繁殖材料可獲得較佳的育苗效果。

關(guān)鍵詞：椰子；吸器；萌發(fā)；SOD活性；POD活性；多酚含量

中圖分類號：S667.4 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）12-2163-06

0引言

【研究意義】椰子（Cocos nucifera L.）是棕櫚科椰子屬多年生喬木，其果實是營養(yǎng)豐富的天然有機食品，具有極高的經(jīng)濟價值（Xu et al.，2007；Marinaet al.，2009），培育優(yōu)良椰子品種和優(yōu)良種苗，是發(fā)展椰子種植業(yè)的重要前提和保證。我國椰子產(chǎn)業(yè)發(fā)展目前存在品種單一、產(chǎn)量較低、病蟲害較多和樹體老化（Cordova et al.，2003）及颶風(fēng)和海嘯等逆境危害的問題（Samosir and Adkins，2014），導(dǎo)致椰子供需矛盾突出。椰子主要以種子進行繁殖，商業(yè)化制種程序繁瑣、種子萌發(fā)周期長且萌芽率低（僅40%）、生產(chǎn)成本較高。椰子吸器（Haustorium）是其種子萌發(fā)的特殊產(chǎn)物，是椰果逐漸膨大過程中充滿整個椰腔的海綿狀吸收器官，可分泌脂肪酶、纖維素酶和蛋白酶等將椰子果實的脂肪和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為可溶性養(yǎng)分，通過維管系統(tǒng)供給椰子苗生長，對椰子種子萌發(fā)起著重要作用（陳良秋和萬玲，2007），但目前有關(guān)椰子吸器的形成機理及其對椰子種子萌發(fā)所起作用了解甚少。因此，探討椰子萌芽過程中吸器發(fā)育及內(nèi)含物的變化規(guī)律，對培育優(yōu)質(zhì)椰子種苗及促進椰子產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】植物胚性細胞發(fā)育過程中各種生理生化反應(yīng)均有大量特異性酶如過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）合成并參與代謝。詹園鳳等（2006）研究發(fā)現(xiàn)，大蒜體細胞胚胎發(fā)生過程的SOD和POD活性變化與胚性愈傷組織誘導(dǎo)及體胚發(fā)育密切相關(guān)，POD對體胚的誘導(dǎo)起主導(dǎo)作用，SOD在體胚發(fā)育和成熟中起主導(dǎo)作用。林玉玲和賴鐘雄（2007）對紅核子龍眼胚胎發(fā)育過程中的SOD活性進行測定，結(jié)果表明，在龍眼子葉形胚發(fā)育早期，SOD活性迅速升高，之后上升較平緩。董姝娟和郭修武（2008）研究發(fā)現(xiàn)，金星葡萄胚胎發(fā)育過程中SOD、POD活性呈增高趨勢，可能與其無核敗育有關(guān)。陳義挺等（2009）研究發(fā)現(xiàn)，隨著龍眼胚性細胞的分化，POD活性總體呈下降趨勢。除酶活性變化外，組織內(nèi)含物的變化也是體胚發(fā)育的重要指標?？扇苄缘鞍资欠N子中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)，對細胞的生命物質(zhì)及生物膜起保護作用。植物在逆境條件下可通過增加可溶性蛋白的合成，直接參與其適應(yīng)逆境過程（張明生等，2003）。多酚類物質(zhì)是植物種子中重要的內(nèi)含物，普遍具有抗菌、抗氧化及抗癌等生物活性，且已被證實有利于植物生長（Randhk and Shetty，2003），多酚的存在是導(dǎo)致植物組培褐變的主要因素（張振霞和洪萍，2010），研究其在種子中含量的變化規(guī)律有助于有效減少胚培養(yǎng)過程中的褐變現(xiàn)象。Manivannana等（2016）研究表明，干燥椰子吸器的主要成分為可溶性糖、淀粉、不溶性膳食纖維、可溶性膳食纖維、蛋白質(zhì)、脂肪、灰分和微量酚類。Konan等（2017）對室溫存儲1個月后的馬來西亞黃矮（MYD）椰子在苗圃催芽，并對萌芽2和4個月的椰子吸器進行生化分析，結(jié)果表明，其油含量從12.90%）2升N37.30%，而可溶性糖主要為蔗糖、果糖和葡萄糖?！颈狙芯壳腥朦c】吸器是椰子種苗繁育的重要組織，其發(fā)育過程中內(nèi)含物的變化直接影響發(fā)芽率，但目前針對椰子吸器萌發(fā)過程中SOD和POD活性及可溶性蛋白和多酚含量等內(nèi)含物變化的研究鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】在統(tǒng)計不同椰子品種不同季節(jié)種果發(fā)芽率的基礎(chǔ)上，探討本地高種椰子吸器萌發(fā)過程中SOD、POD活性及多酚和可溶性蛋白含量的變化規(guī)律，找出提高其種果發(fā)芽率的突破口，為椰子產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試椰子品種為本地高種和紅矮，以未發(fā)育（T0）及發(fā)育到椰腔1/8（T1）、1/4（T2）、1/2（T3）、充滿整個椰腔但椰苗較?。ǜ叨刃∮?0 cm）（T4）和充滿整個椰腔且椰苗發(fā)育粗壯（苗高達1 m）（T5）椰苗的椰子吸器為試驗材料（圖1）。椰子果實于2016年在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所育苗基地進行沙培。

主要試劑：福林酚（>99.0%）購自阿拉丁上海晶純生化科技股份有限公司；沒食子酸（>99.0%）購自麥克林上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、無水碳酸鈉、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉均購自廣州化學(xué)試劑廠；SOD、POD活性和可溶性蛋白含量測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。主要儀器設(shè)備：KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、離心機（Eppendorf 5801R型，德國艾本德公司）、紫外可見分光光度計（日本島津公司）。

1.2椰子發(fā)芽試驗及不同發(fā)育時期基礎(chǔ)數(shù)據(jù)統(tǒng)計

選取成熟的本地高種和紅矮椰果分批進行沙培，定期澆水，統(tǒng)計椰子出芽率。對不同發(fā)育期本地高種椰果（因每個發(fā)育期采樣均需3次重復(fù)，而紅矮發(fā)芽后椰子總數(shù)偏少，故后續(xù)研究均以本地高種椰子為試材）測定其果實重量和縱橫徑后剖開果實分別測定水含量、椰肉厚度、吸器重量及縱橫徑。

1.3多酚含量測定

1.3.1多酚提取 準確稱取各發(fā)育期本地高種椰子吸器2.0 g，加/k5.0 mL 80%乙醇用研缽研磨，充分勻漿，小心轉(zhuǎn)移至15.0 mL離心管中，殘渣用5.0mL提取液再研磨一遍充分洗滌后合并至15.0 mL離心管中；密封后40℃水浴，超聲波提取50 min（期間可振蕩混勻2～3次），室溫條件下4000 r/min離心10min；取0.5 mL上清液置于10.0 mL離心管中，依次加入2.5 mL 10%福林酚反應(yīng)5 min后加入2.0 mL 7.5%Na₂CO₃，室溫下暗處反應(yīng)40 min，用紫外可見分光光度計在波長765 nm處測定吸光值。

1.3.2標準曲線制備 取沒食子酸（100μg/mL）0、50、100、200、300和500μL分別用蒸餾水補足體積N500 μL，然后依次加入2.5 mL 10%福林酚反應(yīng)5min后，再加入2.0 mL 7.5%Na₂CO₃，室溫下暗反應(yīng)40 min，用紫外可見分光光度計在波長765 nm處測定吸光值，得到標準曲線y=0.0102x+0.03（R²=0.9979）。

1.3.3多酚含量計算 按照等量沒食子酸計算本地高種吸器的多酚含量。

1.4 SOD和POD活性測定

分別稱取各發(fā)育期本地高種吸器1.0 g用0.1mol/L磷酸緩沖液（pH 7.1）按重量（g）：體積（mL）=1：9提取SOD和POD，冰浴條件下制成10%組織勻漿液，3500 r/min離心10 min后取20μL上清液按照操作說明測定SOD活性，取100 μL上清液按照操作說明測定POD活性。

1.5可溶性蛋白含量測定

取各發(fā)育期本地高種吸器1.0 g用5%生理鹽水按重量（g）：體積（mL）=1：9提取可溶性蛋白，冰浴條件下制成10%組織勻漿液，3500 r/min離心10 min后取50μL上清液按照操作說明測定可溶性蛋白含量。

1.6統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SAS 9.1進行方差分析和相關(guān)性分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同發(fā)芽時期本地高種和紅矮椰子的出芽情況

由表1可看出，本地高種椰子春（3月）、夏（6月）和秋季（10月）的發(fā)芽率分別為51.0%、33.0%和58.8%，平均為47.6%，紅矮椰子在夏季（8月）和秋季（10月）的發(fā)芽率分別為27.2%和43.8%，平均為35.5%。說明炎熱夏季（6～8月）椰果的出芽率明顯低于春季（3月）和秋季（10月），生產(chǎn)上應(yīng)選擇成熟、無凍傷及響水聲較大的新鮮成熟老果在天氣涼爽時進行育苗。

2.2本地高種吸器發(fā)育過程中椰果各部位的變化情況

由表2可看出，在本地高種吸器發(fā)育過程中椰果各部位的變化差異明顯，其中，吸器的縱橫徑在T0期分別為1.2和0.8 cm，T5期分別發(fā)育生長至10.2和9.8 cm；吸器重量在T0期為0.26 g，T4期發(fā)育至287.20 g；苗長在T0期為0，T5期發(fā)育生長至104.0cm；椰果內(nèi)的椰子水含量從T0期的350 mL逐漸下降，至T5期被完全吸收；椰肉由T0期的硬質(zhì)狀、厚1.5 cm變?yōu)門5期的柔軟黏稠狀、厚0.5 cm。吸器所占整個椰果的比重也在逐漸增加，由T0期的0.015%增加到T4期的13.611%，但在椰苗生長至T5期時吸器所占比重下降到8.000%，推測為吸器中的養(yǎng)分逐漸供給椰苗生長而導(dǎo)致其比重下降。

2.3本地高種椰子吸器SOD和POD活性的變化情況

從圖2可看出，本地高種椰子吸器的POD和SOD活性均呈先上升后下降的變化趨勢，POD活性在吸器發(fā)育至T4期時達最大值，隨后下降。吸器各發(fā)育時期的POD活性排序為T4>T5>T3>T2>TI>T0，SOD活性排序為T3>T4>T5>T2>T1>T0；方差分析結(jié)果表明，吸器各發(fā)育時期的POD活性間、SOD活性間差異顯著（P<0.05，下同）。說明SOD和POD活性對椰子吸器發(fā)育初期逐漸增大起主導(dǎo)作用。

2.4本地高種椰子吸器可溶性蛋白含量的變化情況

從圖3可看出，在椰子吸器發(fā)育過程中可溶性蛋白含量逐漸下降，由T0期的0.34 g/L下降至T5期的0.12 g/L，且各發(fā)育期間差異顯著。說明椰子吸器發(fā)育過程對可溶性蛋白的消耗明顯，為幼苗發(fā)育提供了充足的能量。

2.5本地高種椰子吸器多酚含量的變化情況

從圖4可看出，椰子吸器的多酚含量隨其發(fā)育進程呈先下降后略有上升的變化趨勢，由410.00μg/g逐漸下降至185.29μg/g；T0與T1時期的多酚含量差異不顯著（P>0.05，下同），T1與T2時期、T2與T3時期、T3與T4時期及T4與T5時期的多酚含量差異顯著。多酚含量在吸器發(fā)育初期較高，隨后下降，說明多酚參與了椰子吸器的發(fā)育過程，可促進吸器變大和椰苗變高。

2.6本地高種椰子吸器各組分間的相關(guān)性分析結(jié)果

對椰子吸器的多酚含量、POD和SOD活性及可溶性蛋白含量進行相關(guān)性分析，結(jié)果（表3）表明，多酚含量與SOD活性呈顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.83，多酚含量與可溶性蛋白含量呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），相關(guān)系數(shù)為0.94；POD活性與可溶性蛋白含量呈顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.82；SOD活性與可溶性蛋白含量的相關(guān)系數(shù)為-0.78，相關(guān)性不顯著；POD活性與SOD活性呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.47。說明在椰子吸器發(fā)育過程中內(nèi)含物的變化總體上相輔相成，互相利用。

3討論

目前采用組培技術(shù)生產(chǎn)椰苗尚屬世界性難題，椰子種苗繁育只能以成熟椰果為種源，育苗成活率低，周期長，且易受不同品種及不同成熟期影響，因此選擇較合適的椰果進行育苗才能節(jié)省椰果和提高育苗成活率。吸器作為椰子胚發(fā)育的關(guān)鍵器官，研究其內(nèi)含物變化有助于理清椰子胚發(fā)育機理和確定吸器作為食品的一些評判指標。林玉玲和賴鐘雄（2007）研究發(fā)現(xiàn)，SOD可清除活性氧，促進龍眼體細胞胚的發(fā)生；Lin和Lai（2010）研究認為，SOD在體細胞胚發(fā)生分裂的早期起關(guān)鍵作用。本研究中，椰子吸器發(fā)育過程中SOD和POD活性均較高，可促進椰子吸器發(fā)育，對椰子種苗繁育起重要作用；多酚含量最高為410.00 μg/g，高于李一偉等（2012）對萍婆胚測定的多酚含量，表明多酚不僅在椰子發(fā)育中發(fā)揮重要作用，其含量還可作為高酚含量水果開發(fā)利用的參考指標。

吸器的多酚含量、POD和SOD活性及可溶性蛋白含量問有較密切的相關(guān)性，多酚含量與SOD活性呈顯著負相關(guān)，與可溶性蛋白含量呈極顯著正相關(guān)，對應(yīng)的相關(guān)系數(shù)分別為-0.84和0.94；POD和SOD活性與可溶性蛋白含量呈負相關(guān)，表明這些活性物質(zhì)問相輔相成，在椰子吸器發(fā)育過程中起相互促進作用。Chikku和Raiamohan（2012）研究發(fā)現(xiàn)，椰子吸器水提取物對大鼠心肌梗死有顯著的保護作用和抗氧化性能，本研究中吸器的多酚含量、SOD和POD活性較高，其抗氧化功能也較強，具有作為椰果另一個可食部分開發(fā)利用的潛力，但需進一步對吸器的其他營養(yǎng)成分進行檢測，才能更完整地評價其食用價值（Manivannan et al.，2016）。

4結(jié)論

新鮮成熟椰果的吸器在發(fā)育過程中具有較高的SOD、POD活性及多酚和可溶性蛋白含量，用作繁殖材料可獲得較佳的育苗效果。