王云鋒　王春梅　王長秘　張婭玲　劉林　李成云　楊靜

摘要：【目的】研究不同水楊酸（SA）濃度對稻瘟病菌菌株形態(tài)發(fā)育及受侵染水稻防御相關基因表達的影響，探究SA對稻瘟病活體寄生相關效應蛋白BAS4在稻瘟病菌與水稻互作中的作用機制，為生產(chǎn)上有效防控稻瘟病提供理論依據(jù)?！痉椒ā坷貌煌瑵舛萐A（50、100、200、500、1000和2000μmol/L）處理稻瘟病菌過表達菌株（35S：BAS4/Mo-1）和野生型菌株（A1343R-7），統(tǒng)計分析sA對過表達菌株和野生型菌株菌落生長速率、產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)和附著胞形成等形態(tài)發(fā)育的影響。調(diào)查200μmol/L SA處理稻瘟病菌菌株侵染水稻的發(fā)病率，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析受侵染水稻防御相關基因表達情況?！窘Y(jié)果】不同SA濃度對過表達菌株菌落生長速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率和附著胞形成的影響低于sA對野生型菌株的影響，經(jīng)200μmol/L SA處理過表達菌株侵染水稻的發(fā)病率降低，但降低幅度小于200μmol/L SA處理野生型菌株侵染水稻的發(fā)病率。200μmol/L SA處理能提高過表達菌株侵染水稻病程相關基因PR1a早期上調(diào)表達及PR10a基因72 h時的高效表達；使SA途徑PAL基因表達量下調(diào)，JA途徑AOS2基因早期上調(diào)表達，LOX2基因各時間點下調(diào)表達；使PR5基因早期上調(diào)表達，后期急劇下調(diào)；HSP90基因早期上調(diào)表達，但低于野生型菌株侵染水稻的表達量?！窘Y(jié)論】BAS4過表達菌株對外源SA刺激有較強的耐受性。

關鍵詞：水稻；稻瘟病菌；效應蛋白；水楊酸

中圖分類號：S432.1 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2017）12-2169-07

0引言

【研究意義】植物與病原菌協(xié)同進化導致雙方均進化形成一系列相應的防御與反防御機制。植物病原菌利用細胞壁降解酶降解寄主植物細胞壁以利于其進一步穿透，當病原菌成功侵入寄主后即分泌大量的胞外效應蛋白。病原菌效應蛋白操縱寄主細胞結(jié)構和功能以利于病原菌侵染和抑制寄主免疫響應（Hogenhout et al.，2009），一旦分泌的效應蛋白進入寄主，它們不僅能在胞外基質(zhì)中發(fā)揮作用，還能改變寄主細胞環(huán)境而有利于病菌侵染和定殖，病原菌所處環(huán)境條件決定了病原菌分泌的效應蛋白種類和數(shù)量（Kamoun，2006；Ridout et al.，2006）。因此，研究外源水楊酸（SA）對稻瘟病菌株形態(tài)發(fā)育的影響及在稻瘟病菌與水稻互作中的作用機制，可為稻瘟病的防控提供重要理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】大量研究表明，SA信號途徑、茉莉酸（JA）信號途徑和乙烯信號途徑在植物抵抗腐生病原菌和半活體寄生菌侵染中具有重要的作用（Campbell and Madden，1990）。在病原菌侵染寄主植物過程中，寄主植物周圍的pH、溫度、濕度及寄主植物細胞的微環(huán)境如植物響應病原菌侵染時產(chǎn)生的SA和JA等激素水平上升或下降均會影響病原菌侵染寄主過程中的信號轉(zhuǎn)導、裂解酶類或次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生（Verhoeff et al.，1988；Ten et al.，2001）。SA作為一種信號分子在植物細胞的一些重要代謝過程中發(fā)揮調(diào)控作用。SA可作為植物抗病反應的信號分子激活植物防御保護機制，在抗逆反應和植物信號傳導中起重要作用，當病原菌侵染植物時，SA處理可誘導植物內(nèi)源防御基因表達（Malamy et al.，1990；Mitraux et al.，1990；Durrant and Dong，2004；Tsudant et al.，2009；孟雪嬌等，2010）。稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）因?qū)λ井a(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴重危害而被認為是影響水稻生產(chǎn)最嚴重的子囊菌亞門真菌之一。稻瘟病菌接種水稻葉片后12 h，侵染菌絲在最開始穿透的表皮細胞內(nèi)生長增殖，隨后IH（Invasive hyphae）擴展至臨近的其他細胞，這時效應蛋白可能作為病菌成功侵人相鄰細胞的“先鋒”；稻瘟病菌效應蛋白包括質(zhì)外體效應蛋白（BAS4、BAS113和Slp1）及細胞質(zhì)效應蛋白（Pwl2、AVR-Pita、BAS1、BAS2、BAS3和BAS107）（St Leger et al.，1999）。BAS2和BAS3是兩個BIC相關蛋白，在侵染菌絲中表達上調(diào)，其在穿過細胞壁進入相鄰細胞的菌絲中聚集（Giraldo et al.，2013）。BAS4在稻瘟病菌侵染水稻早期高效表達的基因，在IH和EIHM（Extra-invasive hyphal membrane）間的基質(zhì)中聚集，而不在BIC中積累?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組在前期的研究中獲得了BAS4過表達稻瘟病菌株，并對其毒性進行分析，發(fā)現(xiàn)BAS4在稻瘟病菌株內(nèi)過表達提高了菌株的毒性。目前，有關SA對BAS4過表達稻瘟病菌株耐受性的影響尚未見文獻報道。【擬解決的關鍵問題】在前期研究基礎上，利用不同SA濃度處理BAS4過表達稻瘟病菌株和野生型菌株，觀察不同濃度的SA對其形態(tài)發(fā)育的影響，并分析不同SA濃度處理BAS4過表達菌株和野生型菌株后孢子侵染水稻防御相關基因的表達和受侵染水稻發(fā)病率等，探明SA對稻瘟病菌效應蛋白在稻瘟病菌與水稻互作中的作用機制，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有效防控稻瘟病提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

稻瘟病菌株：野生型菌株（構建BAS4過表達菌株的稻瘟病菌株A1343R-7，保存于云南生物資源保護與利用國家重點實驗室）；過表達菌株35S：BAS4/Mo-1（云南生物資源保護與利用國家重點實驗室構建并獲得的轉(zhuǎn)化菌株，是mCherry與35S啟動下的BAS4融合表達載體轉(zhuǎn)化到A1343R-7后獲得的菌株）。水稻品種：麗江新團黑谷（LTH，普通感病水稻品種，保存于云南生物資源保護與利用國家重點實驗室）。

1.2試驗方法

1.2.1不同SA濃度對稻瘟病菌產(chǎn)孢的影響 挑取稻瘟病菌株35S：BAS4/Mo-1和A1343R-7的菌絲放入PSB培養(yǎng)基中并置于28℃、150 r/mim的搖床培養(yǎng)，將液體培養(yǎng)的稻瘟病菌株的菌絲液接人含不同濃度SA[50、100、200、500、1000和2000μmol/L，依次記為處理1～處理6，以二甲基亞砜（DMSO）溶液為對照（CK）]的PA培養(yǎng)基（西梅汁40 mL、酵母粉1 g、乳糖5 g、瓊脂15 g和H20 1000 mL）上，先在28℃光照培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)4 d后，再晝夜交替（黑暗、光照各12 h）培養(yǎng)6 d。用5 mL ddH₂O將孢子洗下，利用血球計數(shù)板進行計數(shù)。試驗設生物學重復和技術重復各3次。

1.2.2不同SA濃度對稻瘟病菌菌落生長的影響用打孔器取在PDA培養(yǎng)基上已活化好的稻瘟病菌株35S：BAS4/Mo-1和A1 343R-7的菌塊，接種到不同SA濃度的PDA培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d測量一次菌落直徑，持續(xù)至10 d。試驗設生物學重復和技術重復各3次。

1.2.3不同SA濃度對稻瘟病菌孢子萌發(fā)和附著胞形成的影響 將稻瘟病菌株35S：BAS4/Mo-1和A1 343R-7的孢子用蒸餾水洗下后離心去上清液，分別加入不同濃度的SA ddH₂O溶液，將孢子懸浮液濃度稀釋為1×10⁵個/mL，混勻后用移液槍取10μL孢子懸浮液滴到疏水玻片上，2 h時觀察孢子萌發(fā)率，6 h時觀察孢子附著胞形成情況（Spence et al.，2015）。試驗設生物學重復和技術重復各3次。

1.2.4 SA對稻瘟病菌致病性的影響 挑選飽滿的水稻種子進行消毒（75%酒精消毒浸泡1 min，清水沖洗3～5次，1.5%次氯酸鈉消毒浸泡5 min，清水沖洗直至無次氯酸鈉的氣味為止），消毒后將種子用清水浸泡后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，種子露白后播種到育秧盤中，水稻幼苗長到3葉1心時用于接種。

將稻瘟病菌株35S：BAS4/Mo-1和A1343R-7的孢子洗下過濾后制備孢子懸浮液，離心去上清液，加入200 μmol/L SA，調(diào)節(jié)孢子懸浮液濃度為1×10⁵個/mL，再加入懸浮液總體積0.02%的吐溫-20后用于噴霧接種；以DMSO配制孢子懸浮液接種為對照。在黑暗、高溫、高濕條件下放置24 h后，將其轉(zhuǎn)移至溫室培養(yǎng)；噴霧接種后分別于0、24、48、72、96和120 h取樣，液氮速凍后于-80℃保存。接種7 d后進行病害調(diào)查，每次調(diào)查的樣本量為60株幼苗，計算發(fā)病率。發(fā)病率（%）=發(fā)病葉片數(shù)/總?cè)~片數(shù)×100。試驗設生物學重復和技術重復各3次。

1.2.5總RNA提取、cDNA逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR（qRT-PCR）分析 總RNA提?。焊鶕?jù)EasteprSuper總RNA提取試劑盒LS 1040操作。cDNA逆轉(zhuǎn)錄：根據(jù)GoScript^TMReverse Transcription System A5001試劑盒操作。qRT-PCR熒光染料：SYBR Premix EXTaq Ⅱ，反應體系根據(jù)說明配制，總體稱為20.0 μL。分析防御相關基因在受侵染水稻中的表達情況，引物設計根據(jù)相關文獻報道或在文獻報道基礎上進行修改設計（Marcel et al.，2010；Xie et al.，2011）（表1），利用2^-ΔΔCt法（Livak and Schmittgen，2001）分析檢測結(jié)果。

利用qRT-PCR分析不同SA濃度處理過表達菌株35S：BAS4/Mo-1孢子接種水稻后不同時間點（0、24、48、72、96和120 h）水稻病程相關基因OsPR1a和OsPR10a、SA介導的信號轉(zhuǎn)導相關基因OsPAL和OsEDS1及JA途徑相關基因OsLOX2、OsAOS2和逆境脅迫相關基因HSP90、OsPR5的表達情況。qRT-PCR擴增程序：95℃預變性3 min；95℃20 s，60℃20 s，進行45個循環(huán)；60℃升溫到98℃獲取溶解曲線。3次重復。

1.3統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均使用SPSS 13.0完成，用最小顯著極差法（LSD_0.05）進行平均數(shù)顯著性檢驗，再利用Excel 2007作圖分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同SA濃度對過表達菌株35S：BAS4/Mo-1和野生型菌株A1343R-7形態(tài)發(fā)育的影響

2.1.1不同SA濃度對過表達菌株菌落生長速率的影響 以配制的不同SA濃度處理過表達菌株，測量其菌落生長速率，結(jié)果見表2。從表2可看出，培養(yǎng)10 d后野生型菌株和過表達菌株的菌落生長速率基本一致，隨著SA濃度的增加，野生型菌株與過表達菌株菌落生長直徑均無顯著差異（P>0.05，下同）。

2.1.2不同SA濃度對過表達菌株產(chǎn)孢量的影響利用不同濃度的SA處理過表達菌株孢子，統(tǒng)計其對產(chǎn)孢量的影響，結(jié)果（圖1）表明，與對照相比，SA處理能降低過表達菌株和野生型菌株的產(chǎn)孢量，且隨著SA濃度的增加，過表達菌株產(chǎn)孢量降低幅度越來越大，直至SA濃度為2000 μmol/L時顯著降低了過表達菌株和野生型菌株的產(chǎn)孢量（P<0.05，下同）。

2.1.3不同SA濃度對過表達菌株孢子萌發(fā)和附著胞形成的影響 利用不同SA濃度處理過表達菌株和野生型菌株的孢子，于2 h時觀察孢子萌發(fā)，結(jié)果（圖2）顯示，與對照相比，50和100μmol/L SA處理未顯著影響過表達菌株和野生型菌株的孢子萌發(fā)率，而150和200μmol/L SA處理顯著降低過表達菌株和野生型菌株孢子的萌發(fā)率，其中200μmol/L SA處理使野生型菌株孢子萌發(fā)率降低的幅度大于過表達菌株。表明50和100μmaol/L SA對過表達菌株和野生型菌株孢子萌發(fā)沒有影響，150μmol/L SA時開始抑制稻瘟病菌孢子萌發(fā)，200μmol/L SA時顯著抑制稻瘟病菌孢子萌發(fā)。

于6 h時觀察附著胞形成情況，結(jié)果（圖3）顯示，與對照相比，50和100μmol/L SA對野生型菌株和過表達菌株附著胞形成無影響，150μmol/L SA時開始抑制稻瘟病菌株附著胞形成，200μmol/L SA時顯著抑制稻瘟病菌株附著胞形成，其中對野生型菌株附著胞形成的抑制作用明顯大于對過表達菌株的抑制作用。因此，不同SA濃度對稻瘟病菌株附著胞形成影響的趨勢與其對菌株孢子萌發(fā)的影響趨勢基本一致。

2.2 SA對過表達菌株和野生型菌株致病性及水稻防御相關基因表達的影響

2.2.1 SA處理過表達菌株孢子侵染水稻病害調(diào)查結(jié)果 對接種7 d的水稻葉片進行病害調(diào)查，結(jié)果（圖4）顯示，經(jīng)200μmol/L SA處理過表達菌株和野生型菌株孢子侵染水稻引起的發(fā)病程度較未經(jīng)SA處理稻瘟病菌株孢子侵染水稻引起的發(fā)病程度輕。

對發(fā)病葉片進行發(fā)病率統(tǒng)計，結(jié)果（表3）顯示，經(jīng)200μmol/L SA處理過表達菌株和野生型菌株噴霧接種水稻引起的發(fā)病率均低于未經(jīng)200μmol/LSA處理野生型菌株和過表達菌株侵染水稻引起的發(fā)病率，其中以200μmol/L SA處理野生型菌株噴霧接種水稻引起的發(fā)病率最低，顯著低于未經(jīng)200μmol/L SA處理野生型菌株和過表達菌株侵染水稻引起的發(fā)病率，但與經(jīng)200μmol/L SA處理過表達菌株噴霧接種水稻引起的發(fā)病率差異不顯著。

2.2.2 SA處理過表達菌株侵染水稻防御相關基因表達分析結(jié)果

2.2.2.1 SA處理過表達菌株侵染水稻不同時間點病程相關基因PR1a和PR10a的表達分析結(jié)果 利用200μmol/L SA處理過表達菌株孢子接種水稻后，運用SPSS 13.0分析接種后水稻在0、24、48、72、96和120 h時病程相關基因的表達量，結(jié)果（圖5）顯示，病程相關基因PR1a在SA處理過表達菌株侵染水稻各時間點（96 h時除外）的表達量均顯著高于SA處理野生型菌株侵染水稻的表達量；PR10a基因在SA處理過表達菌株侵染水稻各時間點（96 h時除外）的表達量均高于SA處理野生型菌株侵染水稻的表達量。PRla基因在SA處理野生型菌株侵染水稻各時間點的表達量逐漸上調(diào)，但上調(diào)幅度較小，最大表達量出現(xiàn)在96 h時；過表達菌株的PR10a和PR1a基因均在72 h時出現(xiàn)表達峰值。

2.2.2.2 SA處理過表達菌株侵染水稻不同時間點水SATLJA信號途徑相關基因表達分析結(jié)果 利用200μmol/L SA處理過表達菌株孢子接種水稻，采用qRT-PCR分析接種水稻在0、24、48、72、96和120 h時SA和JA途徑相關基因的相對表達量，結(jié)果（圖6）顯示，SA途徑相關基因EDS1在SA處理過表達菌株侵染水稻5個時間點的表達量高于SA處理野生型菌株侵染水稻的表達量，其中在120 h時的表達量最高；SA途徑相關基因PAL在SA處理過表達菌株和野生型菌株侵染水稻各時間點的表達量明顯下調(diào)，但在SA處理過表達菌株侵染水稻中表達量在72 h后下調(diào)幅度小于野生型菌株侵染水稻的表達；JA途徑相關基因LOX2在SA處理過表達菌株侵染水稻各時間點的表達量均下調(diào)，且下調(diào)幅度大于野生型菌株侵染水稻各時間點的表達量；JA途徑相關基因AOS2在SA處理過表達菌株侵染水稻24、48、96和120 h時的表達量顯著高于野生型菌株侵染水稻的表達量。

2.2.2.3 SA處理過表達菌株侵染水稻不同時間點水稻抗性相關基因及脅迫響應基因的表達分析結(jié)果利用200μmol/L SA處理過表達菌株孢子接種水稻后分析水稻在0、24、48、72、96和120 h時脅迫相關基因的相對表達量，結(jié)果（圖7）顯示，脅迫相關基因PR5在SA處理過表達菌株侵染水稻24和48 h的表達量顯著高于野生型菌株侵染水稻的表達量，而在侵染水稻72、96和120 h的表達量低于野生型菌株侵染水稻的表達量；脅迫相關基因HSP90在SA處理過表達菌株侵染水稻除96 h外的4個時間點的表達量均小于野生型菌株侵染水稻的表達量。

3討論

本研究發(fā)現(xiàn)SA影響了稻瘟病菌過表達菌株的形態(tài)發(fā)育，但影響幅度小于對野生型菌株的影響；SA對過表達菌株致病性也有一定影響，但對致病性的影響幅度亦小于野生型菌株。進一步研究SA處理過表達菌株侵染水稻在0、24、48、72、96和120 h時防御相關基因的表達，發(fā)現(xiàn)SA提高了過表達菌株侵染水稻病程相關基因PR1a的表達量，表明PR1a基因表達量被外源SA誘導上調(diào)，且PR1a作為PCD信號途徑的相關基因，其表達量上調(diào)會促進受侵染水稻細胞死亡，能進一步阻礙病原菌侵染，而本研究中PR1a基因上調(diào)表達，表明過表達菌株活體營養(yǎng)期水稻細胞大量死亡，不利于過表達菌株從活體營養(yǎng)向死體營養(yǎng)期轉(zhuǎn)變；PR10a基因在侵染早期（24和48 h）表達量較低，在72 h時表達量急劇上調(diào)，表明PR10a基因在過表達菌株侵染水稻早期并未識別與其互作的稻瘟病菌蛋白，而在72 h時隨著病菌的進一步侵染，菌株分泌了一些新的能被PR10a基因識別的效應蛋白，因此PR10a基因上調(diào)表達。由此看出，雖然SA影響了BAS4過表達菌株的形態(tài)發(fā)育，但菌株自身仍能調(diào)控侵染水稻的病程相關基因PR1a基因上調(diào)和PR10a基因下調(diào)，有利于其進一步侵入水稻，使水稻發(fā)病。

SA途徑的PAL基因是SA合成關鍵酶基因，本研究發(fā)現(xiàn)外源SA降低了受侵染水稻PAL基因表達，表明外源SA可能抑制了受侵染水稻內(nèi)源SA的合成，因此在后期觀察到受侵染水稻仍處于較高發(fā)病率。有研究表明，JA途徑的AOS2基因過量表達提高了內(nèi)源JA含量、PR1基因表達量及水稻對稻瘟病菌的抗性（Xie et al.，2011）。本研究發(fā)現(xiàn)JA途徑的AOS2基因的表達量在SA處理過表達菌株侵染水稻各時間點雖然有上調(diào)，但上調(diào)幅度均不明顯，LOX2基因的表達量則出現(xiàn)急劇下調(diào)，由于LOX2是催化JA合成的第一步，雖然AOS2基因表達量有上調(diào)，但LOX2基因的表達量大幅下調(diào)，因此總體來說受侵染水稻內(nèi)源JA的合成也受到抑制。其是在水稻應對病原菌侵染及脅迫時上調(diào)表達的基因，PR5在受到JA和SA誘導時也呈上調(diào)表達，提高了水稻對白葉枯病菌的抗性（Datta et al.，1999；Jwa et al.，2001）。本研究還發(fā)現(xiàn)PR5基因在外源SA處理過表達菌株侵染水稻早期表達量上調(diào)，表明受侵染水稻早期響應了BAS4過表達菌株的侵染，但后期其響應程度降低。水稻脅迫響應基因HSP90在水稻應對環(huán)境刺激及防御響應時起關鍵作用，其在外源SA處理的過表達菌株侵染水稻早期也出現(xiàn)上調(diào)，但上調(diào)幅度稍低于野生型菌株侵染的水稻，表明外源SA處理過表達菌株侵染水稻受到的脅迫程度較外源SA處理野生型菌株侵染水稻的低。

綜上所述，盡管過表達菌株35S：BAS4/Mo-1受到外源SA處理后其菌株形態(tài)發(fā)育和致病性均受到一定影響，但受影響的幅度較小，表明BAS4過表達菌株和野生型菌株均受到外源SA的刺激，但BAS4過表達菌株較野生型菌株有較強的調(diào)控水稻防御相關基因在不同時間的表達量促進其成功侵染定殖水稻的能力，預示著BAS4過表達菌株對SA的刺激有較強的耐受性，但其機制有待進一步探究。

4結(jié)論

不同濃度的外源SA對過表達菌株35S：BAS4/Mo-1形態(tài)發(fā)育和致病率的影響小于其對野生型菌株A1343R-7的影響，但過表達菌株通過調(diào)控受侵染水稻防御相關基因的表達量，促進其成功侵入水稻，表明BAS4過表達菌株對外源SA刺激有較強的耐受性。