陳志堅(jiān) 羅佳佳 彭璽如 劉攀道 郇恒福 劉國道 白昌軍

摘 要 以6份柱花草（Stylosanthes guianensis）種質(zhì)為材料，采用水培法，分析15% PEG-6000模擬干旱處理對柱花草生長的影響，并綜合評價(jià)柱花草種質(zhì)的抗旱性。結(jié)果表明：15% PEG處理顯著抑制了柱花草的生物量、根系生長、葉綠素濃度（SPDA）及最大光化學(xué)效率（Fv/Fm），并顯著增加了丙二醛（MDA）含量，但不同種質(zhì)的抗旱性存在差異。運(yùn)用隸屬函數(shù)法對柱花草抗旱性進(jìn)行綜合分析，結(jié)果表明：種質(zhì)TF227和TF210抗旱能力最強(qiáng)，為抗旱型柱花草，R2和R5次之，TF226和TF244抗旱能力最弱。植株鮮重、地上部鮮重、丙二醛含量、葉綠素濃度和Fv/Fm可作為評價(jià)柱花草抗旱能力的指標(biāo)。

關(guān)鍵詞 柱花草；干旱脅迫；抗旱性；綜合評價(jià)

中圖分類號 S541 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Analysis of Drought Resistance in Six Stylosanthes Accessions

CHEN Zhijian1， LUO Jiajia1，2， PENG Xiru1，2， LIU Pandao1，

HUAN Hengfu1， LIU Guodao1， BAI Changjun1 *

1 Institute of Tropical Crop Genetic Resources， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences / Key Laboratory of Crop Gene

Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture， Danzhou， Hainan 571737， China

2 Institute of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract Plant growth and drought resistance of six Stylosanthes guianensis（stylo）accessions were investigated under 15% PEG-induced drought stress in hydroponics. Results showed that plant biomass， root growth， chlorophyll concentration（SPDA）and the maximum photochemical efficiency（Fv/Fm）of stylo accessions were differentially inhibited by 15% PEG treatment， whereas malondialdehyde（MDA）content in stylo increased under drought stress. Comprehensive analysis showed that TF227 and TF210 exhibited the superior ability of drought stress resistance， followed by R2 and R5， while TF226 and TF224 were susceptible stylo accessions. Furthermore， the changes in plant fresh weight， shoot fresh weight， MDA content， SPDA and Fv/Fm were regarded as the reference indices used for the evaluation of drought resistance in stylo.

Key words Stylosanthes； drought stress； drought resistance； comprehensive evaluation

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.10.004

由于全球氣溫變暖，1950～2008年間，全球土地的干旱面積以每10 a 1.74%的速率快速增長[1]。自1980年以來，中國東北部、北部以及西北部的干旱地區(qū)也快速增加[2]。干旱脅迫已成為限制作物生長及產(chǎn)量的重要障礙因素之一。水分的虧缺會影響植物許多生理生化過程，包括光合作用、呼吸作用、物質(zhì)運(yùn)輸、能量傳遞和信號傳導(dǎo)等[3]。并且，干旱脅迫會破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，影響細(xì)胞分裂，產(chǎn)生活性氧自由基并導(dǎo)致膜脂過氧化[4-5]。

植物在長期進(jìn)化過程中形成了復(fù)雜的適應(yīng)干旱脅迫的機(jī)制，包括形態(tài)、生理、生化和分子水平等方面的變化[6]。植物可以通過增加氣孔導(dǎo)度、提高光合作用能力以及快速生長的策略抵抗干旱脅迫[7]。在干旱脅迫下，植物會促進(jìn)主根和側(cè)根生長，增加對深層土壤水分的吸收[8]。并且，酚類化合物在植物抵抗干旱脅迫造成的氧化性損傷中具有重要作用[9]。此外，植物可以通過增強(qiáng)脫落酸信號通路相關(guān)基因的表達(dá)，從而增強(qiáng)其抵抗干旱脅迫的能力[6]。

柱花草（Stylosanthes spp.）是熱帶和亞熱帶地區(qū)的重要豆科牧草，主要用于牧草飼料、天然草地改良和綠肥覆蓋等，其具有耐貧瘠和酸性土壤等特點(diǎn)[10]。目前，柱花草已在中國海南、廣東、廣西和云南等省（區(qū)）推廣種植[11]。然而，干旱脅迫嚴(yán)重限制了柱花草的種植和生產(chǎn)[12]。雖然干旱脅迫影響柱花草種子萌發(fā)、開花期和植株生物量等方面已有文獻(xiàn)報(bào)道[12-14]，但是，植物響應(yīng)干旱脅迫是一個(gè)復(fù)雜生理過程，不同植物品種、不同生長期的抗旱性也有所差異，單一評價(jià)指標(biāo)難以準(zhǔn)確地衡量和評價(jià)植物的抗旱性[12]。因此，本研究以6份柱花草為材料，分析干旱脅迫對柱花草鮮重、根系生長、丙二醛含量、葉綠素濃度及最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）的影響，通過隸屬函數(shù)法對柱花草的抗旱性進(jìn)行綜合評價(jià)，以期篩選出抗旱性強(qiáng)的柱花草種質(zhì)，為后續(xù)挖掘柱花草抗旱相關(guān)基因資源提供種質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試柱花草為圭亞那柱花草（Stylosanthes guianensis），種質(zhì)編號分別為RY2、RY5、TF210、TF226、TF227和TF244，共6份材料，供試種子由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所草業(yè)研究室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所草業(yè)研究室的大棚進(jìn)行。柱花草種子除去外種皮后，80 ℃加熱2 min，冷卻至室溫后，于28 ℃的黑暗條件下催芽。柱花草種子萌發(fā)后，參照陳志堅(jiān)等[15]方法，幼苗移栽至1/2 Hoagland營養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)。幼苗正常培養(yǎng)1個(gè)月后，進(jìn)行PEG-6000處理。參照王利彬等方法[16]，實(shí)驗(yàn)設(shè)置2個(gè)PEG-6000濃度處理，分別為0（對照組，CK）和15%（W/V） PEG-6000（處理組，PEG），每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。處理5 d后收獲樣品。

1.2.2 指標(biāo)測定 根系經(jīng)掃描儀（EPSON 1640XL，日本）掃描后，用圖像分析軟件WinRhizo（Regent Instruments，加拿大），計(jì)算總根長和根表面積。丙二醛（MDA）含量的測定參照Lu等[17]方法，即通過三氯乙酸從葉片中提取丙二醛，以硫代巴比妥酸顯色后，用分光光度法測定。葉片葉綠素含量采用SPAD502型葉綠素分析儀測定。葉片最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）用便攜式熒光儀Pocket PEA（Hansatech，英國）測定。以上每個(gè)指標(biāo)測定設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行處理，采用SPSS11.5軟件（SPSS Institute，美國）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。參照王贊等[18]的方法，計(jì)算隸屬函數(shù)值（D值），綜合評價(jià)柱花草的抗旱能力，各測定指標(biāo)與D值的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG處理對柱花草生長的影響

15% PEG處理顯著抑制了柱花草地上部和根部鮮重，但不同種質(zhì)材料受15% PEG處理的抑制程度不同（圖1）。相對對照（CK）處理，TF227、TF210和TF244地上部鮮重在15% PEG處理下分別降低了32.0%、41.1%和76.6%，但15% PEG處理對RY2、RY5和TF226的地上部鮮重影響不明顯（圖1-A）。15% PEG處理顯著降低了RY2、RY5和TF244根部鮮重，但對TF227、TF210和TF226的根部鮮重影響不明顯。相對對照處理，RY2、RY5和TF244根部鮮重在15% PEG處理下分別降低了27.9%、39.1%和33.1%（圖1-B）。從圖1-C可以看出，相對對照處理，TF227、TF210、RY2、RY5、TF226、TF244植株鮮重在15% PEG處理下分別降低了32.7%、38.7%、47.2%、42.5%、67.4%、67.9%。以上結(jié)果表明，15% PEG處理顯著影響柱花草的生長，TF227和TF210植株生長受抑制程度低于其他種質(zhì)。

2.2 PEG處理對柱花草根系生長的影響

15% PEG處理顯著影響柱花草總根長和根表面積，但不同柱花草種質(zhì)根系生長對15% PEG處理的響應(yīng)不同（圖2）。相對對照（CK）處理，TF210、RY5、TF226、TF244的總根長在15% PEG處理下降低了24.5%～44.2%，但15% PEG處理對TF227和RY2的總根長影響不明顯（圖2-A）。此外，15% PEG處理顯著降低了RY2，TF226和TF244的根表面積，但對其他柱花草種質(zhì)的根表面積影響不明顯。RY2，TF226和TF244的根表面積在15% PEG處理下降低了22.4%～47.2%（圖2-B）。

2.3 PEG處理對柱花草葉片丙二醛含量、葉綠素濃度和Fv/Fm的影響

從圖3-A可以看出，15% PEG處理顯著增加了柱花草葉片的丙二醛含量。相對對照（CK）處理，TF210、RY2、TF226和TF244的葉片丙二醛含量在15% PEG處理下分別增加了61.2%、72.9%、102.3%和80.3%，但15% PEG處理對TF227和RY5的葉片丙二醛含量影響不明顯（圖3-A）。15% PEG處理顯著降低了TF210、RY2、RY5、TF226和TF244的葉綠素濃度（SPAD值），但對TF227的影響不明顯。TF210、RY2、RY5、TF226和TF244的SPAD值在15% PEG處理下降低了35.3%～55.4%（圖3-B）。類似的，15% PEG處理顯著降低了6份柱花草種質(zhì)的葉片F(xiàn)v/Fm值，TF227和TF210葉片F(xiàn)v/Fm在15% PEG處理下降低了約28.0%，而RY2、RY5、TF226和TF244降低了51.0%～62.7%（圖3-C）。以上結(jié)果表明，TF227和TF210能夠維持干旱脅迫下較低的葉片丙二醛含量和較高的葉綠素濃度及Fv/Fm值。

2.4 柱花草抗旱性綜合評價(jià)

本研究進(jìn)一步對柱花草種質(zhì)總生物量、地上部生物量等8個(gè)指標(biāo)進(jìn)行分析，計(jì)算隸屬函數(shù)值（D值），綜合評價(jià)柱花草的抗旱能力。從表1可以看出，TF227和TF210綜合評價(jià)D值最大，分別為0.9345和0.8101，R2和R5次之，TF226和TF224最小，分別為0.1372和0.1835。以上結(jié)果表明，TF227和TF210抗旱能力最強(qiáng)，為抗旱型柱花草，R2和R5抗旱能力中等，TF226和TF224抗旱能力最弱。此外，與D值顯著負(fù)相關(guān)的指標(biāo)是植株鮮重、地上部鮮重、丙二醛含量、葉綠素濃度和Fv/Fm（表1），說明以上5個(gè)指標(biāo)可作為柱花草抗旱能力評價(jià)和鑒定的參考指標(biāo)。

3 討論

植物的生長和發(fā)育受到干旱脅迫的影響。干旱脅迫對植物光合作用、呼吸作用、離子吸收以及物質(zhì)分配產(chǎn)生有害的影響[19]。PEG-6000是一種高分子滲壓劑，能通過調(diào)節(jié)溶液的滲透壓來限制水分進(jìn)入植物細(xì)胞內(nèi)，其常被作為模擬干旱脅迫的滲透脅迫劑[16]。本研究以15% PEG-6000模擬干旱處理不同的柱花草種質(zhì)，發(fā)現(xiàn)不同種質(zhì)間存在抗旱性差異，其中，TF227和TF210植株生物量受抑制程度低于其他4份種質(zhì)（圖1），暗示了這2份種質(zhì)具有較強(qiáng)的抗旱能力。類似的，薛瑞等[12]研究發(fā)現(xiàn)，不同柱花草種質(zhì)對干旱脅迫的響應(yīng)不一樣，認(rèn)為植株生物量受干旱脅迫影響越小的種質(zhì)，其抗旱性越強(qiáng)。植株鮮重、干重等被認(rèn)為是評價(jià)植物抗旱性的重要指標(biāo)，如鷹嘴豆和玉米等[20-21]。

根系是植物吸收水分和營養(yǎng)元素的主要器官，也是感知環(huán)境水分缺乏的重要部位[22]，根系生長是評價(jià)植物適應(yīng)干旱環(huán)境的重要指標(biāo)。干旱條件下，植物根系生長會發(fā)生適應(yīng)性變化[23]。Zhong等[24]研究表明，在干旱下，促進(jìn)根系生長是抗旱性植株的主要特征。本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱條件下，相對其他種質(zhì)，TF227、TF210和TF226的根系鮮重受干旱脅迫影響不明顯，并且在6份柱花草中，15% PEG處理對TF227的總根長和根表面積無顯著影響，而干旱脅迫顯著抑制了其他種質(zhì)總根長和根表面積（圖1、2）。因此，干旱脅迫下，維持根系生長可能有助于促進(jìn)柱花草根系對水分的吸收。

干旱脅迫下植物細(xì)胞會大量產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致膜脂過氧化，增加丙二醛含量。丙二醛是植物抗旱性評價(jià)的生理指標(biāo)之一，丙二醛積累越多，表明植物受干旱脅迫傷害程度越大[25]。Raluca等[26]研究表明，在干旱脅迫下，丙二醛含量與萬壽菊耐旱能力呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，耐旱的萬壽菊品種丙二醛含量較低。本研究中，15% PEG處理顯著增加了4份柱花草種質(zhì)葉片丙二醛的含量，但15% PEG處理對TF227和RY5的葉片丙二醛含量影響不明顯（圖3-A），暗示了在干旱脅迫下，這2份柱花草種質(zhì)細(xì)胞膜受傷害程度較小。葉綠素和最大光化學(xué)效率（PSⅡ）與植物的光合作用密切相關(guān)，是評價(jià)植物抗旱性的重要指標(biāo)[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫顯著降低了柱花草的葉綠素濃度（SPAD值）和Fv/Fm。在6份柱花草中，柱花草TF227和TF210能夠維持較高的葉綠素濃度及Fv/Fm值（圖3）。類似的，F(xiàn)araloni等[29]利用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)篩選耐旱型橄欖樹，發(fā)現(xiàn)抗旱性強(qiáng)的橄欖樹品種，其具有較高的Fv/Fm。因此，在干旱脅迫下，柱花草TF227和TF210可能通過維持根系生長和對水分的吸收，降低了干旱脅迫對細(xì)胞膜的傷害，從而維持了較高的SPAD和Fv/Fm以適應(yīng)干旱脅迫環(huán)境。

植物抗旱性與植物品種、表型性狀、生理生化性狀等密切相關(guān)，因此，對不同的指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)分析，才能夠客觀、有效地反映植物的抗旱能力[30-32]。胡標(biāo)林等[32]通過比較5種不同的抗旱性評價(jià)方法，認(rèn)為利用隸屬函數(shù)的綜合抗旱能力（D值）法，能夠系統(tǒng)準(zhǔn)確地評價(jià)水稻的抗旱性。Liu等[33]運(yùn)用隸屬函數(shù)法綜合評價(jià)了白羊草的抗旱性，從而篩選出具有不同抗旱性的白羊草材料。本研究對柱花草總生物量、地上部生物量等8個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合評價(jià)分析，隸屬函數(shù)值（D值）表明TF227和TF210抗旱能力最強(qiáng)，為抗旱型柱花草，R2和R5抗旱能力中等，TF226和TF224抗旱能力最弱（表1）。并且植株總生物量、地上部生物量、丙二醛含量、葉綠素濃度和Fv/Fm可作為柱花草抗旱能力評價(jià)和鑒定的參考指標(biāo)。因此，本研究為抗旱柱花草種質(zhì)篩選和遺傳改良提供了理論依據(jù)和種質(zhì)材料，并為挖掘柱花草抗旱基因奠定基礎(chǔ)。

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