余興 賈云生 吳湘琴 賈兵 葉振風 朱立武

摘要[目的]探討油桃果實頂腐形成的原因。[方法]以中油5號油桃果實為試材，分別測定正常油桃與頂腐油桃果實中Ca含量；從頂腐油桃上分離純化得到致病菌，采用CTAB法提取菌絲DNA，對其進行rDNA-ITS鑒定，利用NCBI在線Blast工具進行致病菌rDNA-ITS同源性比較。[結果]病果果實中Ca元素含量顯著低于對照；腐爛壞死部位分離出2種不同類型菌絲，分別為弱寄生菌“黑變病”與“黑酵母菌”。[結論]油桃頂腐主要是由缺鈣誘發(fā)后弱寄生菌侵染造成的。

關鍵詞油桃；頂腐；Ca；弱寄生菌

中圖分類號S662.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）10-0152-03

Analysis on Top Rot of Nectarine Fruits

YU Xing1，JIA Yunsheng2，WU Xiangqin2 et al

（1.Anhui Institute of Geological Experiment，Hefei，Anhui 230001； 2.College of Horticulture，Anhui Agriculture University，Hefei，Anhui 230036）

Abstract[Objective] The aim was to explore the formation causes of nectarine fruit top rot.[Method] The fruit of nectarine cultivar ‘Zhongyou5 was as testing materials，and Ca content in fruit between the normal and top rot nectarine were determined.The pathogenic bacteria was isolated and purified from the top rot nectarine，the mycelium DNA was extracted by CTAB method，and the rDNAITS sequence was analyzed and identified，and the homology was compared by the NCBI Blast online tools.[Result] Ca content in the disease fruit was significantly lower than in the control； two kinds of different types mycelium were separated from fruit decay and necrotic areas，which the weak parasitic fungus was respectively melanosis and black yeast.[Conclusion] Nectarine top rot is mainly caused by calciumdeficiency，then is infected by the weak parasite.

Key wordsNectarine；Top rot；Ca；Weak parasite

我國油桃栽培始于20世紀70年代，20世紀80年代先后推出了曙光、華光、艷光、瑞光系列、秦光系列、中油系列的多系列甜油桃品種。到20世紀90年代，油桃保護地栽培迅速崛起，成為栽培的主要方式之一，在生產(chǎn)中所占的比例越來越大，其中，陜西渭南油桃保護地栽培占栽培總量的90%以上[1]。安徽省碭山縣是傳統(tǒng)水果種植大縣，其中保護地油桃種植面積近萬畝，經(jīng)濟效益較高。

Ca是一種不易被植物吸收且吸收后又不易移動的元素，大量的Ca存在于葉中，果實中甚少。Ca只能單向（向上）轉移，并受蒸騰作用的影響，常常會發(fā)生低蒸騰果實中的Ca向樹體倒流的現(xiàn)象，因而果實極易表現(xiàn)出缺Ca癥狀。在果樹栽培中僅由此所造成的果實腐爛等損失占產(chǎn)量的20%～30%，經(jīng)濟損失嚴重[2]。保護地栽培，油桃生長速度就減緩，果實發(fā)育變慢，成熟期推遲。同時由于光照不足，枝條出現(xiàn)不同程度的徒長，葉片變大變薄，光合速率明顯下降，致使果實發(fā)育和營養(yǎng)生長間出現(xiàn)不平衡[3]。碭山縣油桃頂腐現(xiàn)象較嚴重，尤其是大棚油桃發(fā)病率遠遠高于露地油桃。筆者對頂腐油桃中Ca含量進行了測定，并對果實頂腐部位病菌進行了分離、純化和rDNA-ITS序列分析，探討了油桃果實頂腐形成原因，以期為大棚油桃生產(chǎn)預防頂腐提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料植物材料為安徽省碭山縣園藝場大棚栽培的中油5號頂腐果實和正常果實。ITS1和ITS4引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2方法

1.2.1果實Ca含量測定。取中油5號頂腐果實和正常果實，用去離子水清洗油桃果面3次，削去表皮，切取果肉，后混樣，設3次重復，Ca元素含量采用電感耦合等離子體質譜法（ICP-MS）測定[4]。

1.2.2病原菌的分離與純化。在無菌條件下，取新鮮病果（分發(fā)病輕、發(fā)病重2組），用70%乙醇擦拭病組織表面，分別切取發(fā)病輕、發(fā)病重的病果病部表皮以及重病果削去表皮后染病果肉，依次接種至代號為“1-1”“1-2”“1-3”的PDA培養(yǎng)皿（圖1），放入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待菌落直徑長至1 cm時，挑取菌落邊緣菌絲于PDA培養(yǎng)基上進行純化培養(yǎng)[5]。重復操作3次可得到純化菌株。

1.2.3形態(tài)學鑒定。將純化的病原菌接種于PDA平板培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)5～6 d，期間觀察記錄菌落在培養(yǎng)基上的生長情況；在Olympus BX51顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)。

1.2.4分子生物學鑒定。采用CTAB法提取“1-1”“1-2”“1-3”PDA培養(yǎng)基上的菌株T1、T2、T3的DNA。應用rDNA-ITS通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAAC CTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），進行PCR擴增[6]。采用20 μL反應體系：10×Buffer 2 μL，MgCl2 2 μL，0.25 mmol/L dNTP，Taq酶1 U，1 μL DNA模板，ITS1和ITS4引物各0.2 μmol/L。反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。擴增完成后，取5 μL擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收純化目的片段，回收純化產(chǎn)物送上海英駿生物公司測序。

1.2.5rDNA-ITS序列與系統(tǒng)發(fā)育分析。在GenBank網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）的數(shù)據(jù)庫中進行測序結果的比對，利用NCBI提供的Blast工具，在線搜索同源性較高的已知序列，將目標序列和搜索到的同源序列以FASTA格式編輯成為一個文本文件，用軟件ClustalX 1.83對序列進行多重比較；去掉兩端的引物序列后，利用BioEdit程序和MEGA 3.1軟件以非加權配對算術平均法構建系統(tǒng)聚類樹，分析其親緣關系[7]。

2結果與分析

2.1Ca含量測定結果表明，正常果實和頂腐果實中的Ca平均含量分別為88.9和60.2 mg/kg，病果果實中Ca含量比正常果實降低了32.3%，且二者之間Ca含量的差異達到了顯著性水平。

2.2病原菌的分離與形態(tài)學觀察

病果病部表皮病原菌的分離與形態(tài)學觀察結果（圖2、3）顯示，從病部切取獲得的組織經(jīng)分離純化培養(yǎng)5 d后，表皮病原菌菌落均呈深灰綠色，周邊乳白色，短絨毛狀，有少量環(huán)形溝紋，菌落背面黑色；生長較快。初步判斷，發(fā)病輕與發(fā)病重的病果病部表皮分離的病原菌是同一種病原菌。

病果病部果肉病原菌的分離與形態(tài)學觀察結果（圖4）顯示，其菌落和周邊均呈現(xiàn)乳白色，短絨毛狀，反面也是乳白色；生長較表皮病原菌菌落生長慢。初步判斷，表皮病原菌與果肉病原菌是2種不同的病原菌。

2.3病原菌rDNA-ITS序列分析

對“1-1”和“1-2”PDA培養(yǎng)基上的菌絲進行轉接提純，培養(yǎng)5 d后提取菌絲基因組DNA，以得到的DNA為模版，應用特異引物經(jīng)PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)電泳均獲得1條分子量為446 bp的條帶，轉化測序后，經(jīng)rDNA-ITS序列分析比對（圖5），為麥類黑變病菌屬（Cladosporium cladosporioides），即油桃“黑變病”。

對“1-3”PDA培養(yǎng)基上的的菌絲進行轉接提純，培養(yǎng)5 d后提取菌絲基因組DNA，測序得分子量為476 bp，轉化測序后，經(jīng)rDNA-ITS序列分析比對（圖6），為出芽短梗霉菌（Aureobasidium pullulans），即油桃“黑酵母菌”。

該2種真菌均為弱寄生菌，當油桃果實表皮受到機械損傷或組織疏松腐爛時，會侵染果肉，導致果實發(fā)病。

3結論與討論

在碭山地區(qū)，大棚內油桃果實頂腐現(xiàn)象明顯多于露地栽培，可能與Ca的吸收特點有關，因為Ca的運送速率在很大程度上受蒸騰速率的支配，土壤干旱時或者設施內高濕條件下，易引起缺Ca，如果實套袋后，幼果蒸騰被抑制，吸收Ca的能力均會減弱[2]。通風透光條件差的果園，其容易缺Ca[8]。同時，對Ca吸收的減少易造成油桃果實膜透性增加，果實抗腐能力下降，感病的概率也隨之增加，更容易被弱寄生病菌所侵染。因此，中油5號油桃頂腐主要由缺Ca誘發(fā)弱寄生菌“黑變病”和“黑酵母菌”侵染造成的。

廖亞運等[9]研究表明，在桃生長發(fā)育過程中葉片和果實表面噴施不同濃度的Ca溶液，能增加果實Ca含量，使細胞結構和功能得到有效保護，其中以0.015 mol/L螯合鈣處理效果較明顯，整個發(fā)育期以幼果期噴鈣效果最顯著。潘家荃等[10]研究了75%拿敵穩(wěn)WG 5 000倍和Wuxal Calcium 2 000倍組合、75%拿敵穩(wěn)WG 5 000倍、Wuxal Calcium 2 000倍、鈣爾美2 000倍、好力克5 000倍和鈣爾美2 000倍組合5個處理對蘋果苦痘病的防治效果，以Wuxal Calcium單劑2000倍稀釋液處理效果最好。李中勇等[11]研究表明，采前土壤施Ca可顯著提高貯藏期設施油桃的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性，并顯著降低設施油桃果實的質膜透性及過氧化產(chǎn)物丙二醛的積累，改善設施油桃果實貯藏品質，延長設施油桃果品貨架期。因此，設施油桃生產(chǎn)中，幼果期噴Ca是必要的，對預防頂腐病，提高果實貯藏性有很好的效果。

安徽農(nóng)業(yè)科學2017年

參考文獻

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