梁偉放+趙建國(guó)++柳賢德

摘 要 抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的長(zhǎng)期濫用，對(duì)水環(huán)境產(chǎn)生的污染問(wèn)題日益受到關(guān)注。本研究采用5種不同梯度濃度（0，200，220，240，260，280 mg/L）的四環(huán)素溶液對(duì)斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行處理，隨后觀察其在受精后144 h的死亡率和孵化率；將成年斑馬魚(yú)暴露于四環(huán)素溶液（400 mg/L）96 h，隨后取其肝、腎、肌肉和腦，并分別測(cè)定這4類組織中過(guò)氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性。結(jié)果表明：四環(huán)素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育有明顯的毒性作用，并導(dǎo)致幼魚(yú)的脊柱彎曲、魚(yú)鰾萎縮甚至死亡；CAT酶在肌肉組織中顯著升高，而SOD酶在肝臟組織中顯著上升。魚(yú)類肌肉中的CAT酶活性和肝臟中的SOD酶活性可成為水生生態(tài)抗生素污染的生物標(biāo)記。

關(guān)鍵詞 四環(huán)素 ；胚胎發(fā)育 ；CAT ；SOD

中圖分類號(hào) Q493

Effects of Tetracycline on Embryo Development and Enzymatic Activities of Zeb7rafish

LIANG Weifang ZHAO Jianguo LIU Xiande

（Department of Veterinary Medicine，Hainan University，Haikou，Hainan 570228）

Abstract Due to long-term abuse of antibiotics in aquaculture，environmental pollution of water is increased. Zebrafish embryo were exposed to different concentration（0，200，220，240，260，280 mg/L）of tetracycline solution，and then observed mortality and hatchability at 144 hpf. Adult zebrafish were exposed to tetracycline solution（400 mg/L）for 96 hours and removed the liver，kidney，muscle，and brain. The catalase（CAT）and superoxide dismutase（SOD）activity were determined in liver，kidney，muscle，and brain. Results indicated that tetracycline toxic to zebrafish embryos，and inducedspinal curvature and swim bladder atropy inzebrafish larve. CAT activity was significantly increased in muscle and SOD activity was slightly increased in liver. Therefore，CAT activity of muscle and SOD activity of liver may become to biomarker for tetracycline pollution of aquatic environment.

Key words tetracycline ；embryo development ；CAT ；SOD

抗生素由于能促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和增產(chǎn)，在養(yǎng)殖業(yè)中以亞治療劑量被長(zhǎng)期添加于動(dòng)物飼料中。目前，世界上生產(chǎn)的抗生素已達(dá)200多種，其中至少有50 %的抗生素用于蓄牧業(yè)、養(yǎng)蜂業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[1]?？股剡M(jìn)入生物體后，并不被完全吸收，其中85 %以上以原藥形式排出體外，有些抗生素在生物體內(nèi)經(jīng)生物轉(zhuǎn)化，生成毒性更強(qiáng)的代謝物隨糞便和尿液排出體外[2]。這些抗生素及其代謝物隨雨水、地表徑流污染地表水，或通過(guò)滲濾作用污染地下水[3]。由于在水產(chǎn)和家畜養(yǎng)殖中長(zhǎng)期頻繁的使用抗生素，對(duì)水生生態(tài)系統(tǒng)和人體健康構(gòu)成極大的潛在威脅[4]。

本研究選取四環(huán)素作為目標(biāo)化合物，分析四環(huán)素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的孵化率和死亡率的影響，從而評(píng)價(jià)四環(huán)素對(duì)水生生物的毒性等級(jí)及其生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。此外，還分析了四環(huán)素對(duì)斑馬魚(yú)成魚(yú)的肝、腎、肌肉和腦中CAT和SOD含量的影響，為水生物的生物標(biāo)記物挖掘提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

鹽酸四環(huán)素（Sigma-Ardrich Co. LLC，USA）、BCA法蛋白定量測(cè)試盒（南京建成生物科技有限公司）、CAT試劑盒（南京建成生物科技有限公司）、SOD試劑盒（南京建成生物科技有限公司）。

1.1.2 設(shè)備及器材

ZKH-定制版四層單排斑馬魚(yú)養(yǎng)殖系統(tǒng)（青島中科海水處理有限公司）、Moticam 2056體式顯微鏡（MOTIC CHINA GROUP CO.，LTD）、LRH-250F生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法

試驗(yàn)所用的斑馬魚(yú)胚胎和成年斑馬魚(yú)均自繁自養(yǎng)，采用專業(yè)的飼養(yǎng)系統(tǒng)正規(guī)飼養(yǎng)，水溫維持在（28-29） ℃，pH為7.0-7.5，溶氧量≥6.0 mg/L，光照周期為14/10 h（晝/夜）。所有試驗(yàn)過(guò)程中，保證滿足上述溫度和水質(zhì)條件。

1.2.1 胚胎毒性試驗(yàn)

用胚胎培養(yǎng)液將鹽酸四環(huán)素配制0、200、220、240、260、280 mg/L等6個(gè)梯度濃度，用NaHCO3把pH調(diào)整為7.0，并依次裝入6孔板中，每孔含8 mL的四環(huán)素溶液；于受精后1-2 h內(nèi)選取正常一致的胚胎，每孔放入30-40胚胎，置于28.5 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；4 hpf（hours post fertilization）從每孔中選出發(fā)育正常的胚胎置于裝有2 mL四環(huán)素溶液的24孔板中，每孔放5個(gè)胚胎，每板設(shè)置20孔為四環(huán)素培養(yǎng)液實(shí)驗(yàn)組，剩下4孔為胚胎培養(yǎng)液空白對(duì)照組（試驗(yàn)成立標(biāo)準(zhǔn)：空白對(duì)照組致死率≤16 %）；每2 h換1次培養(yǎng)液，記錄144 hpf的孵化率和死亡數(shù)，并使用體式顯微鏡觀察斑馬魚(yú)胚胎在發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)學(xué)變化。

1.2.2 成魚(yú)毒性試驗(yàn)

將雌、雄各半且長(zhǎng)度及年齡相同的成年斑馬魚(yú)暴露于400 mg/L四環(huán)素溶液中，處理96 h；將40條斑馬魚(yú)分成4組，每組10條，其中3組用400 mg/L四環(huán)素溶液處理，剩下1組作為對(duì)照組；96 h后，將各組斑馬魚(yú)解剖，并分別摘取其肝、腎、肌肉、腦4類組織，稱重，勻漿，配制成10 %組織勻漿，于4 ℃離心10 min，取上清液置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 CAT和SOD酶活性測(cè)定

CAT和SOD酶活性按照試劑盒的操作方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用 SPSS（19.0版）軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并用 GraphPadPrism 5 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚胎毒性試驗(yàn)結(jié)果

將斑馬魚(yú)胚胎暴露于6個(gè)不同梯度（0、200、220、240、260、280 mg/L）的四環(huán)素溶液中，觀察144 hpf的死亡率和孵化率。結(jié)果表明，相比胚胎發(fā)育前期，后期的四環(huán)素毒性作用更為明顯；斑馬魚(yú)胚胎死亡率隨四環(huán)素濃度的劑量的加大而呈上升趨勢(shì)，260和280 mg/L處理組的大部分胚胎死亡（圖1-A）；斑馬魚(yú)孵化率在240 mg/L處理組中顯示為最低，但260和280 mg/L處理組反而有上升的趨勢(shì)，這主要是由于計(jì)算過(guò)程中剔除了大量死胚而導(dǎo)致的（圖1-B）。

除了提高死亡率和降低孵化率之外，抗生素還能導(dǎo)致胚胎的畸形，如脊柱彎曲、魚(yú)鰾萎縮。在144 hpf，隨四環(huán)素濃度的升高，脊椎彎曲和魚(yú)鰾萎縮的幼魚(yú)比率也隨之上升（圖2）。

2.2 酶活性測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果

為了尋找合適的生物標(biāo)志物，分別在肝、腎、肌肉、腦4類組織中檢測(cè)了CAT和SOD酶活性。相比對(duì)照組， CAT活性在四環(huán)素處理組中都有升高，但與其它組織相比，其在肝組織中活性的提高幅度最為顯著（圖3-A）。經(jīng)四環(huán)素處理后，肌肉和腦部中的超氧化物歧化酶（SOD）活性都有提高，但其在肝臟中的活性變化幅度相比其他組織更為明顯（圖3-B）。因此，通過(guò)魚(yú)類對(duì)水體中的四環(huán)素污染進(jìn)行監(jiān)控時(shí)，肝臟中CAT和肌肉中SOD活性升高均可作為水體污染的依據(jù)。

3 結(jié)論

目前，關(guān)于抗生素對(duì)水生生物的毒性研究主要集中在細(xì)菌[5]、藻類[6]和甲殼類[7]。斑馬魚(yú)具有個(gè)體小、產(chǎn)卵多、體外受精、發(fā)育快、胚胎透明、易于觀察、飼養(yǎng)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到環(huán)境毒理學(xué)家們的青睞[8]。Oliveira等[9]分析了四環(huán)素和阿莫西林對(duì)斑馬魚(yú)胚胎的影響，結(jié)果顯示，抗生素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育具有顯著的毒性，成魚(yú)的頭部、肌肉、魚(yú)鰓、肝的CAT、GST、LDH等活性均具有顯著差異。

抗生素廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)，隨動(dòng)物的排泄物嚴(yán)重污染水生生態(tài)系統(tǒng)。四環(huán)素作為養(yǎng)殖業(yè)中使用最廣泛的抗生素，對(duì)斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)發(fā)育具有較大的毒性，可導(dǎo)致幼魚(yú)脊柱彎曲和魚(yú)鰾萎縮，高濃度或長(zhǎng)時(shí)間暴露時(shí)可引起死亡。四環(huán)素顯著提高成魚(yú)肝臟CAT和肌肉SOD活性，可作為水體抗生素污染的生物標(biāo)志物。

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