楊日才++姜成東

摘 要 從香蕉中克隆了一個(gè)鉀離子通道基因MaAKT2的cDNA的ORE序列并初步分析其功能。采用PCR技術(shù)克隆該基因，利用生物信息學(xué)方法分析基因及推導(dǎo)蛋白的序列，利用RT-PCR技術(shù)對(duì)該基因的組織器官表達(dá)特性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，MaAKT2的cDNA ORE序列長為2 463 bp，編碼821個(gè)氨基酸；MaAKT2蛋白屬于植物弱內(nèi)整流鉀離子通道蛋白，該蛋白具6個(gè)跨膜區(qū)域，擁有CNBD、ANKY及KHA特征結(jié)構(gòu)域；MaAKT2在系統(tǒng)發(fā)生上更接近單子葉植物弱內(nèi)整流鉀離子通道蛋白；MaAKT2可在香蕉根、莖、葉、花以及果實(shí)中表達(dá)，在葉中的表達(dá)量高于其它器官。MaAKT2基因的克隆為在分子水平研究香蕉鉀離子吸收利用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 香蕉 ；鉀離子通道 ；基因克隆 ；生物信息學(xué) ；表達(dá)分析

中圖分類號(hào) S188

Cloning and Expression Analysis of MaAKT2-like Gene from Banana

YANG Ricai JIANG Chengdong

（College of Horticulture and Landscape Architecture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228）

Abstract The objective of this study is to clone the ORF of cDNA from a gene MaAKT2 from banana and primarily analyze its function. cDNA sequence was obtained by the approach of PCR amplification， the putative amino acid sequence were analyzed by bioinformatics software and the expression patterns in different organs was analyzed by RT- PCR. Sequence analysis indicated that the ORF of MaAKT2 gene is 2463bp in length and encodes an 861 amino acids protein. MaAKT2 protein belongs to weak inward rectifying potassium channel protein characterized with six transmembrane regions， a CNBD domain， a ANKY domain and a KHA domain. The phylogenetic analysis showed that MaAKT2 had a closer relationship with Anthurium amnicola， Ananas comosus， Oryza sativa， and Zea mays； MaAKT2 is expressed in all organs such as roots， corns， leaves， flowers and fruits with higher level in leaves than other organs. The clone of ORF of MaAKT2 is a basement for the study of the mechanical of banana potassium absorption and transport in molecular level.

Key words banana ； potassium channel ； gene clone ； bioinformatics ； expression analysis

香蕉是一種高鉀作物，其正常生長發(fā)育需要消耗大量的鉀肥，生產(chǎn)上適時(shí)提高鉀肥的施用量可有效縮短香蕉的生產(chǎn)周期、提高產(chǎn)量和品質(zhì)[1-2]。香蕉生產(chǎn)上每年要施用大量的鉀肥，而我國南方香蕉栽培產(chǎn)區(qū)土壤普遍缺鉀，加之我國鉀資源缺乏，因而提高香蕉鉀肥利用效率對(duì)于保證香蕉產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[3-4]。探究香蕉鉀吸收利用機(jī)制對(duì)于提高香蕉鉀肥利用效率至為重要。而研究鉀吸收利用的分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)于改良香蕉種質(zhì)具有重要意義。

植物鉀離子的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)主要通過鉀離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)行，克隆香蕉鉀離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體基因是研究其鉀吸收利用的分子機(jī)制的基礎(chǔ)[5]。AKT2基因是主要在植物根、莖、葉及花等器官的韌皮部中表達(dá)的基因，其編碼的AKT2鉀離子通道蛋白屬于弱內(nèi)整流鉀離子通道，其功能主要和鉀離子在植株體內(nèi)長距離的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[6-8]。目前已在植物中克隆出多個(gè)弱內(nèi)整流鉀離子通道基因，如擬南芥的AtAKT2[6]、玉米的ZMK2[9]、雨樹的SPICK1和SPICK2[10]等。但作為高鉀作物的香蕉中尚未見到相關(guān)研究?？寺∠憬禔KT2基因?qū)τ谘芯肯憬兜母哜浶枨筇匦约捌溻涬x子長距離運(yùn)輸機(jī)制具有重要意義。

鉀離子通道基因編碼序列較長，克隆這類基因具有一定的難度，需要采用適宜的克隆策略。最初克隆鉀離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)體基因多采用異源表達(dá)技術(shù)獲得[11-12]。隨著一些作物基因組測序的完成及生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，同源克隆和電子克隆[13-14]也成為鉀離子通道基因克隆的重要途徑。目前香蕉的基因組測序工作已完成，使得采用同源策略克隆香蕉鉀離子通道基因成為可能。本研究根據(jù)二倍體香蕉基因組序列設(shè)計(jì)引物利用PCR技術(shù)以中國主栽三倍體香蕉品種巴西蕉為材料克隆了AKT2鉀離子通道基因，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析及器官表達(dá)特性分析，為進(jìn)一步分析香蕉鉀離子吸收利用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

基因克隆所用材料為巴西蕉健壯成熟葉片。

克隆載體為TaKaRa公司的pMD-18T，大腸桿菌DH5α購自TaKaRa公司。

組織器官特異性分析所用材料為香蕉主栽品種巴西蕉（Musa acuminata L. AAA group cv. Brazil）。選取雌花花后發(fā)育約100-110 d，處于綠熟階段，棱角明顯的果實(shí)即7成熟狀態(tài)果實(shí)植株的白色肉質(zhì)根、球莖、葉片、雌花以及果實(shí)進(jìn)行器官特異性分析。各器官用無菌水清洗后立即用液氮速凍。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA合成

香蕉果實(shí)和花RNA的提取采用改良的CTAB法[15]。香蕉營養(yǎng)器官球莖、葉片和根系的RNA的提取方法采用改良SDS法[16]。RNA的反轉(zhuǎn)錄采用Fermentas的RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成。具體步驟參考試劑盒說明書。

1.2.2 MaAKT2基因cDNA ORF序列的克隆

根據(jù)香蕉基因組測序序列設(shè)計(jì)5′端和3′端引物，5′端引物： 5′-CGAGCTCATGGAGAGCGGCCATGAGA-3′；3′端引物，5′-ACATGCATGCTTGGCATTTGCTATGAAGCTTAACA-3′。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 3 min，35個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0 %瓊脂糖凝膠電泳分析，回收純化后連接到載體上送生化公司測序。

1.2.3 MaAKT2蛋白序列的生物信息學(xué)分析

通過美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站中的BlastX對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，選取同源性>30 %的序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。利用Protparam在線分析軟件進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析，利用TMpred和TMHMM在線分析軟件對(duì)MaAKT2蛋白進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測。采用NetPhos 3.1 Server分析MaAKT2磷酸化位點(diǎn)。利用SWISSMODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）同源建模預(yù)測蛋白的三維空間模型。利用DNAMAN對(duì)不同物種的AKT2蛋白序列進(jìn)行比較。利用Clustal1.81和Mega3.0軟件構(gòu)建MaAKT2蛋白與其它植物AKT2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 器官表達(dá)特性分析

利用RT-PCR技術(shù)分析MaAKT2的組織器官表達(dá)特性。在所獲全長序列上選取一段特異序列設(shè)計(jì)引物，上游引物：5′-AGGAACACGACGCACAATGG-3′；下游引物：5′-GCCTTACATTCCGCACCAG-3′。內(nèi)參基因?yàn)橄憬禔ctin，上游引物為：5′-TGTAGCAATTCAGGCTGTTCTT-3′；下游引物為：5′-TCAGAGATGGCTGGAAGAGAAC-3′。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MaAKT2基因cDNA序列的克隆及生物信息學(xué)分析

基于香蕉基因組測序序列，通過PCR擴(kuò)增，得到一段大于2 000 bp產(chǎn)物（圖1A），將產(chǎn)物克隆到載體上鑒定后送生化公司測序（圖1B），經(jīng)與參照基因及blast比對(duì)，確認(rèn)該片段為目的基因的ORF，命名為MaAKT2。該基因cDNA ORF全長2 463 bp，編碼821個(gè)氨基酸殘基的蛋白質(zhì)（圖2）。

利用ProtParam分析MaAKT2蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，MaAKT2的分子式為C4144H6581N1131O1208S47，相對(duì)分子量為93 082.51，等電點(diǎn)為6.53，理論推導(dǎo)半衰期為30 h。不穩(wěn)定系數(shù)為32.02，屬于穩(wěn)定蛋白。該蛋白中相對(duì)含量比較多的氨基酸是Leu（98個(gè)，11.9 %）、Glu（56個(gè)，6.8 %）、Val（55個(gè)，6.7 %）、Ala（52個(gè)，6.3 %）、Arg（51個(gè)，6.1 %）。Pyl和Sec含量為0?？偟膸ж?fù)電荷的殘基（Asp+Glu）為96，總的帶正電荷的殘基（Arg+Lys）為92，脂肪指數(shù)為96.54，親水性平均系數(shù)為-0.098，預(yù)測該蛋白為水不溶性蛋白，屬于電壓門控內(nèi)內(nèi)整流鉀離子通道家族跨膜蛋白。TargetP1.1 Server預(yù)測顯示MaAKT2定位于葉綠體、線粒體及次生代謝途徑的可能性較小，定位于其它部位的可能性較大（0.839）。MaAKT2與其同源序列氨基酸相似性達(dá)到99 %，其氨基酸僅存在7處不同，但其對(duì)應(yīng)氨基酸殘基的極性則完全相同（圖3A）。MaAKT2蛋白的理化性質(zhì)與二倍體香蕉中的同源基因預(yù)測的AKT2基本相同。

TMpred分析顯示MaAKT2具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域， 分別位于62-83、95-115、127-146、152-172、193-218、243-265和274-292氨基酸殘基處，其中243-265氨基酸殘基處為跨膜的P結(jié)構(gòu)區(qū)域，含有GYGD保守序列（圖2）。MaAKT2蛋白氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果（圖4A）顯示，該基因具有植物弱內(nèi)整流鉀離子通道家族典型的環(huán)核苷酸結(jié)合域CNBD（303-495 aa）、錨定蛋白結(jié)構(gòu)域Anky （523-687 aa）和KHA區(qū)（738-821 aa）家族特征結(jié)構(gòu)域（圖2，圖4A）。MaAKT2具有兩處配體結(jié)合位點(diǎn)分別位于444G、445E和454Q、455S、456L。磷酸化位點(diǎn)分析表明該序列具有25處磷酸化位點(diǎn)（圖3B）。利用SWISS-MODEL預(yù)測MaAKT2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果同樣表明該蛋白具有多個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)（圖4B）。

比較MaAKT2與其它物種AKT2氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)植物AKT2蛋白氨基酸序列具有較高的同源性（圖5）。根據(jù)香蕉MaAKT2和其它物種已發(fā)表的及部分推導(dǎo)的AKT2的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹的結(jié)果見圖5。全部序列可被分為2個(gè)大簇（clades），三倍體香蕉巴西蕉的AKT2和同為單子葉植物的菠蘿、紅掌、水稻、玉米及大麥等植物的AKT2構(gòu)成一簇，而其它雙子葉植物構(gòu)成一簇。香蕉的AKT2和同為單子葉植物的AKT2關(guān)系較近，與可可、擬南芥等植物的AKT2親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖6）。

2.2 MaAKT2基因組織器官表達(dá)特性

MaAKT2的器官表達(dá)特性分析結(jié)果見圖7。MaAKT2基因在香蕉根、球莖、葉、花和果實(shí)等器官中均表達(dá)，在根中的表達(dá)量較低，在球莖、花、果中表達(dá)量較高，在葉中表達(dá)量最高。

3 討論

弱內(nèi)整流鉀離子通道基因是重要的鉀離子通道類型，目前已在植物中克隆出多個(gè)弱內(nèi)整流鉀離子通道基因，如擬南芥的AtAKT2[6]、玉米的ZMK2[9]、雨樹的SPICK1和SPICK2[10]等，且在菠蘿、水稻等多個(gè)完成基因組測序的植物中發(fā)現(xiàn)該類基因[17]。該類基因推導(dǎo)的蛋白序列較長，擬南芥的AtAKT2為802個(gè)氨基酸殘基[6]，雨樹的SPICK2為832個(gè)氨基酸殘基[10]，玉米的ZMK2為846個(gè)氨基酸殘基[9]，利用PCR技術(shù)克隆該類基因的ORF存在一定難度。在對(duì)MaAKT2基因cDNA的ORF序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，本研究將擴(kuò)增時(shí)每個(gè)循環(huán)中的延伸時(shí)間設(shè)定為3 min，成功地克隆出該基因的ORF序列。這對(duì)今后克隆其它鉀離子通道基因是個(gè)有益的借鑒。

本研究從三倍體香蕉中克隆到的弱內(nèi)整流鉀離子通道基因MaAKT2與二倍體香蕉中的同源基因的ORF核苷酸序列存在著高度相似，相似性達(dá)99 %，其對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)氨基酸序列也僅存7處差異（圖3A），但這些氨基酸殘基的極性（親疏水性）卻完全一致，這表明兩個(gè)基因的功能可能沒有發(fā)生改變。對(duì)MaAKT2基因ORF序列推導(dǎo)的MaAKT2蛋白分析發(fā)現(xiàn)，該序列具有弱內(nèi)整流鉀離子通道基因典型的序列特征，即具有典型的N端的6個(gè)跨膜序列，P-loop，環(huán)核苷酸結(jié)合域CNBD，錨定蛋白結(jié)構(gòu)域Anky和KHA家族特征結(jié)構(gòu)域[18-19]。這表明AtAKT2的結(jié)構(gòu)或功能與其它植物的弱內(nèi)整流鉀離子通道基因可能基本相同。系統(tǒng)發(fā)生分析表明，MaAKT2和同為單子葉植物的菠蘿、紅掌、水稻、玉米及大麥等植物的弱內(nèi)整流鉀離子通道蛋白親緣關(guān)系較近，而與可可、擬南芥等雙子葉植物的弱內(nèi)整流鉀離子通道親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。表明其功能可能更接近于單子葉植物。

不同物種AKT2類鉀離子通道同源性較高，尤其是在構(gòu)成離子通道的跨膜區(qū)域、P-loop及CNBD結(jié)構(gòu)域相似性最高，這可能與鉀元素均以鉀離子的形式在不同物種中被吸收利用有關(guān)。但不同物種的AKT2類鉀離子通道的錨蛋白結(jié)構(gòu)域和KHA結(jié)構(gòu)域則存在較大差異。錨蛋白結(jié)構(gòu)域的功能與鉀離子通道蛋白定位于細(xì)胞骨架或與其它調(diào)節(jié)蛋白的相互作用有關(guān)[20]。而KHA結(jié)構(gòu)域則是鉀離子通道蛋白形成鉀離子通道所必需，KHA結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)了通道蛋白的異聚化并使其穩(wěn)定[21-23]。此外，不同物種AKT2類鉀離子通道的磷酸化位點(diǎn)也存在差異。鉀離子通道蛋白需要被磷酸化才能被激活，進(jìn)而定位到質(zhì)膜上介導(dǎo)胞外鉀離子向細(xì)胞內(nèi)流動(dòng)[24-25]。擬南芥的AtAKT2上僅有15處磷酸化位點(diǎn)[6]，而MaAKT2序列卻有高達(dá)25處的磷酸化位點(diǎn)；此外AtAKT2由CBL4/CIPK6所介導(dǎo)的膜定位機(jī)制也與AKT1不同。這表明MaAKT2被激活所涉及的具體信號(hào)通路可能與擬南芥等植物不同[6]。香蕉是一種高鉀植物，其正常生長發(fā)育需要大量的鉀離子，而且其根系鉀離子吸收效率也遠(yuǎn)高于其它植物[26-29]。香蕉AKT2與其它物種AKT2類鉀離子通道序列的差異是否和這一特性有關(guān)，尚需深入研究。

基因的功能與其表達(dá)特性密切相關(guān)。擬南芥的弱內(nèi)整流鉀離子通道基因AKT2主要在擬南芥韌皮部中表達(dá)，它主要介導(dǎo)鉀離子在韌皮部中的裝載或卸載，使得鉀離子可以在植株體內(nèi)進(jìn)行長距離的轉(zhuǎn)運(yùn)[6-8]。玉米的弱內(nèi)整流鉀離子通道基因ZMK2也在胚芽鞘的維管系統(tǒng)中表達(dá)[9]。這些表達(dá)特性表明植物弱內(nèi)整流鉀離子通道基因的功能均與鉀離子在植株體內(nèi)長距離的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。本研究中在香蕉的根、球莖、葉片、花及果實(shí)中均檢測到MaAKT2的表達(dá)，而香蕉的根、球莖、葉片、花及果實(shí)中均存在維管系統(tǒng)，這表明MaAKT2的功能可能也與香蕉植株內(nèi)鉀離子的長距離轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。此外，擬南芥AKT2也可在葉片的表皮細(xì)胞和葉肉細(xì)胞以及保衛(wèi)細(xì)胞中表達(dá)[6]，雨樹的SPICK1和SPICK2表達(dá)特性與雨樹葉片的節(jié)律性葉片運(yùn)動(dòng)有關(guān)[10]，這說明AKT2類離子通道的功能還與植物多種生理機(jī)制有關(guān)，MaAKT2可能還參與多種生理現(xiàn)象，相關(guān)研究尚需深入進(jìn)行。

本研究克隆了香蕉MaAKT2基因的ORF，并對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，有關(guān)該基因的其它特性尚需深入進(jìn)行。

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