郭敏，黃永光*，邱樹(shù)毅，胡建峰，胡峰，鐘方達(dá)

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025；3.貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州習(xí)水564622）

高通量測(cè)序在醬香白酒微生態(tài)多樣性研究中的應(yīng)用

郭敏1，2，黃永光1，2*，邱樹(shù)毅1，2，胡建峰3，胡峰3，鐘方達(dá)3

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025；3.貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）習(xí)酒有限責(zé)任公司，貴州習(xí)水564622）

通過(guò)提取醬香型白酒生產(chǎn)發(fā)酵過(guò)程3輪次、7輪次酒醅微生物基因組DNA，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)酒醅中的微生態(tài)多樣性進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果表明，醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程3輪次酒醅（L3）中乳桿菌屬（Lactobacillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）是原核微生物中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，而7輪次酒醅（L7）中鹽單胞菌屬（Halomonas）是原核微生物中最優(yōu)勢(shì)菌屬；同時(shí)在L3樣品中嗜熱真菌屬（Thermomyces）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）是發(fā)酵過(guò)程真核微生物中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，而在L7樣品中隱球菌屬（Cryptococcus）則是真核微生物中的最優(yōu)勢(shì)菌屬。對(duì)比兩輪次酒醅中微生物分析結(jié)果，二者的微生態(tài)多樣性存在較大的差異。分析認(rèn)為可能正是因?yàn)閮奢喆尉契形⑸镌诎l(fā)酵過(guò)程中處于動(dòng)態(tài)變化的差異性，導(dǎo)致兩個(gè)輪次生產(chǎn)出的酒在產(chǎn)量和質(zhì)量風(fēng)味上自然存在較大的差異。

醬香型白酒；酒醅；高通量測(cè)序方法；微生物多樣性

GUO Min1,2,HUANG Yongguang1,2*,QIU Shuyi1,2,HU Jianfeng3,HU Feng3,ZHONG Fangda3
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory of Fermentation Engineering and Biological Pharmacy of Guizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 3.Guizhou Moutai Brewery(Group)Xijiu Co.,Ltd.,Xishui 564622,China)

醬香型白酒是中國(guó)最具有代表性、獨(dú)特性的蒸餾酒，以其獨(dú)特的釀造工藝形成獨(dú)特的風(fēng)格體系；以醬香突出、酒體醇厚、空杯留香等風(fēng)格而聞名[1]。醬香型白酒生產(chǎn)過(guò)程發(fā)酵酒醅在堆積、窖池發(fā)酵過(guò)程富集、培養(yǎng)了大量微生物，微生物在酒醅中生長(zhǎng)繁殖并產(chǎn)生大量代謝物和風(fēng)味化合物。在醬香型白酒生產(chǎn)中，第3、4、5輪次生產(chǎn)酒醬香風(fēng)格典型突出，酒體較為醇厚、豐滿，產(chǎn)量和質(zhì)量效益優(yōu)勢(shì)明顯；而第7輪次酒的生產(chǎn)屬于醬香型白酒釀造工藝的最后一輪，發(fā)酵底物的發(fā)酵特性處于最差狀態(tài)，微生物的群落結(jié)構(gòu)也明顯與3、4、5輪次存在明顯差異，所生產(chǎn)基酒的風(fēng)格、質(zhì)量、出酒率也都相差較大。發(fā)酵酒醅中的微生物結(jié)構(gòu)直接決定著酒的產(chǎn)質(zhì)量與酒體風(fēng)味，釀酒微生物主要包括細(xì)菌、真菌等，真菌包括霉菌、酵母菌等。細(xì)菌在發(fā)酵過(guò)程主要功能作用是分泌風(fēng)味型酶、代謝產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)、調(diào)節(jié)發(fā)酵過(guò)程微生態(tài)結(jié)構(gòu)等。霉菌主要分泌糖化酶、蛋白酶等，將淀粉轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性的糖、分解蛋白質(zhì)，提高淀粉、蛋白質(zhì)的利用率。酵母菌主要包括了酒精酵母、產(chǎn)酯酵母等，酒精酵母主要起代謝產(chǎn)酒精的作用，產(chǎn)酯酵母具有產(chǎn)酯能力，能夠增加酒體的酯含量，賦予酒舒適的香氣。因此，研究醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程的微生態(tài)多樣性及其結(jié)構(gòu)對(duì)詮釋醬香型白酒獨(dú)特風(fēng)味的形成具有重要的意義。

高通量測(cè)序技術(shù)（high-throughput sequencing）可以滿足對(duì)多個(gè)樣品中的微生物進(jìn)行深入分析，其主要特點(diǎn)是通量高、速度快、準(zhǔn)確度高、實(shí)時(shí)檢測(cè)、數(shù)據(jù)信息量大等，能在很短時(shí)間內(nèi)獲取大量的數(shù)據(jù)[2-3]。目前，國(guó)內(nèi)應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)分析研究濃香型、清香型白酒發(fā)酵酒醅中細(xì)菌或真菌微生態(tài)多樣性已有報(bào)道[4-7]，且高通量測(cè)序技術(shù)也被用于研究不同發(fā)酵食品中的微生物生態(tài)，包括醋[8]和牛奶[9]，而在醬香型白酒釀造領(lǐng)域還很少涉入。

本研究以醬香型白酒釀造的第3輪次和第7輪次的釀造酒醅為樣本，探索利用高通量測(cè)序分析酒醅中的細(xì)菌16SrDNA的V4變異區(qū)序列和真菌內(nèi)的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列，研究醬香型白酒釀造過(guò)程酒醅中細(xì)菌和真菌的生態(tài)結(jié)構(gòu)。旨在從微生態(tài)多樣性的角度解析導(dǎo)致兩個(gè)輪次產(chǎn)酒在產(chǎn)量、質(zhì)量和風(fēng)格上存在較大差異的原因，建立高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于醬香型白酒制酒微生態(tài)多樣性及其結(jié)構(gòu)的研究分析方法，更加準(zhǔn)確、完整的解析醬香型白酒釀造過(guò)程酒醅中微生物的群落結(jié)構(gòu)及其主導(dǎo)功能，為今后全面研究醬香型白酒釀造微生態(tài)多樣性及其相關(guān)研究提供可行性的方法和奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品取自茅臺(tái)集團(tuán)XJ公司醬香型酒制酒車間2016年第3輪次、第7輪次生產(chǎn)酒醅，取后置于-20℃冰柜保存，備用。

DNA提取試劑盒：美國(guó)MP Biomedicals公司；引物由深圳市恒創(chuàng)基因科技有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

SpeedCycler PCR儀，德國(guó)Analytikjena公司；GS junior高通量測(cè)序儀，美國(guó)Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

稱取10 g樣品，用15 mL滅菌后的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）懸浮，加入適量玻璃珠，漩渦振蕩5 min，300 r/min離心5 min，取上清，沉淀用PBS緩沖液重復(fù)洗滌3次，離心后收集上清，將所有收集上清混勻。全部上清于9 000 r/min離心3 min，棄去上清，收集細(xì)胞沉淀。再用5 mL PBS洗3次，每次于9 000 r/min離心3 min，收集沉淀。

1.3.2 微生物DNA提取

采用試劑盒方法提取DNA，提取過(guò)程參照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.3 微生物擴(kuò)增和焦磷酸測(cè)序

使用16S rDNA通用引物515F（5'-GTGCCAGCMGCC GCGG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對(duì)細(xì)菌DNA的V4高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增；使用真菌引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2R（5'-GC TGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對(duì)真菌ITS1F-ITS2R區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。

1.3.4 PCR反應(yīng)體系

TransStartFastpfuDNA聚合酶20μL反應(yīng)體系：Forward引物（5 μmol/L）0.8 μL；Reverse引物（5 μmol/L）0.8 μL；5×FastPfu Buffer 4 μL；2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）2 μL；FastPfu Polymerase0.4μL；TemplateDNA10ng；補(bǔ)ddH2O至20μL。

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增程序：細(xì)菌為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；55℃復(fù)性30 s；72℃延伸45 s；共27個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸10 min。真菌為95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s；55℃復(fù)性30 s；72℃延伸45 s；共29個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸10 min。

1.3.5 高通量測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

采用高通量測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用QIIME軟件總體分析測(cè)序數(shù)據(jù)后再利用Greengene數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋，進(jìn)一步確定序列對(duì)應(yīng)微生物的分類學(xué)地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品微生物測(cè)序指標(biāo)分析

對(duì)酒醅中微生物的DNA提取并PCR產(chǎn)物純化及定量后上機(jī)測(cè)序分析，其Shannon、Chao1指數(shù)等分析指標(biāo)見(jiàn)表1。

表1Shannon等指標(biāo)分析結(jié)果Table 1 Analysis results of Shannon and other indexes

由表1可知，在所測(cè)定2個(gè)樣本的細(xì)菌中共獲得69651條16SrDNA基因序列（其中L3為32 846，L7為36 805），真菌中共獲得34 497條ITS基因序列（其中L3為634，L7為12 459）。為了獲得樣品中微生物多樣性信息，根據(jù)97%相似性將序列聚類成為操作分類單元（operational taxonomic unit，OUT），OUT數(shù)一定程度上說(shuō)明了樣品多樣性的程度。細(xì)菌的總OUT數(shù)為657（其中L3為634，L7為23），真菌的總OUT數(shù)為127（其中L3為54，L7為73），說(shuō)明樣品中微生物構(gòu)成中，原核微生物的復(fù)雜程度高于真核微生物。Alpha值可用來(lái)估計(jì)樣品中細(xì)菌群落物種的豐度和多樣性，包括Chao1、Shannon等分析指數(shù)，在相似度97%以上的分類水平上，利用應(yīng)用軟件計(jì)算樣品的豐度和多樣性指數(shù)。Chao1指數(shù)用來(lái)衡量群落豐度的指數(shù)，隨著值的增大，微生物群落的豐度也相應(yīng)較高。本研究中，樣品的Shannon曲線值分別是0.12和4.27，Chao 1指數(shù)值分別是23和669.68，細(xì)菌的測(cè)序深度為30 000，因此只需對(duì)30 000條序列進(jìn)行測(cè)定分析就可以覆蓋酒醅中所有細(xì)菌。本次研究樣品中細(xì)菌多樣性分析了36 805和32 846條序列；在真菌中，樣品的Shannon曲線值分別為3.9和1.47，Chao 1指數(shù)值分別為73和64，真菌的測(cè)序深度為10000，因此也只需對(duì)10000條序列進(jìn)行測(cè)定分析就可以覆蓋酒醅中所有真菌，而本次研究真菌多樣性分析了12 459和22 038條序列，說(shuō)明樣品的物種多樣性和豐富度都較高。

由表1還可知，2個(gè)樣品中細(xì)菌的Chao1指數(shù)大小順序?yàn)長(zhǎng)3＞L7，說(shuō)明第3輪次堆積酒醅中細(xì)菌的群落豐度比第7輪次高；比較2個(gè)樣品真菌的Chao1指數(shù)，結(jié)果表明Chao1指數(shù)大小為L(zhǎng)7＞L3，說(shuō)明第7輪次堆積酒醅中真菌的群落豐度比第3輪次堆積酒醅高，這與生產(chǎn)實(shí)際符合。Shannon指數(shù)的大小與Chao 1指數(shù)的變化一致。測(cè)序結(jié)果表明醬香型酒醅樣品中的生物物種多樣性和豐度都比較高，所覆蓋的信息量足以真實(shí)性的表征酒醅中微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性。

2.2 細(xì)菌多樣性分析

表2 樣品中細(xì)菌序列的百分含量Table 2 Percentage contents of bacterial sequences in samples

樣品中細(xì)菌菌群測(cè)序數(shù)據(jù)解析結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，在L3樣品中厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、梭桿菌門（Fusobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）為優(yōu)勢(shì)菌門。在屬分類水平上，優(yōu)勢(shì)菌屬分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）24.14%、芽孢桿菌屬（Bacillus）14.88%、乳球菌屬（Lactococcus）5.30%、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）5.12%、Lentibacillus屬1.86%、普雷沃氏菌科-NK3B31屬（Prevotellaceae-NK3B31）1.57%、鏈球菌屬（Strepococcus）1.42%、科羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）1.37%、創(chuàng)傷球菌屬（Helcococcus）1.35%、狹義的梭菌屬（Clostridium sensu strict）1.10%、未分類梭桿菌科（UnclassifiedFusobacteriales）1.08%、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）1.05%。在L3樣品中特有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有：乳球菌屬（Lactococcus）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、Lentibacillus、普雷沃氏菌科-NK3B31屬（Prevotellacea-NK3B31）、鏈球菌屬（Strepococcus）、科羅彭斯特菌屬（Kroppenstedtia）、創(chuàng)傷球菌屬（Helcococcus）、狹義的梭菌屬（Clostridium sensu stricto）、未分類梭桿菌科（Unclassified fusobacteriales）、硝化螺旋菌屬（Nitrospira）。

由表2還可知，在L7樣品中，以厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）為主要優(yōu)勢(shì)門。在屬的分類水平上，鹽單胞菌屬（Halomonas）47.51%是最主要的優(yōu)勢(shì)屬，此外，占總序列的13.26%、8.84%、7.73%、5.52%、4.97%、4.97%、3.31%、2.21%、1.66%的序列分別屬于不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、吞菌弧菌屬（Peredibacter）、戴沃斯菌屬（Devosia）、南極適冷菌屬（Rheinheimera）、黃桿菌屬（Flavobacterium），還包括金黃桿菌屬（Chryseobacterium）、土壤桿菌屬（Agrobacterium）、纖維弧菌屬（Cellvibrio）。在L7樣品中特有的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬有鹽單胞菌屬（Halomonas）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、吞菌弧菌屬（Peredibacter）、戴沃斯菌屬（Devosia）、倫黑墨氏菌屬（Rheinheimera）、黃桿菌屬（Flavobacterium）。其中，鹽單胞菌屬（Halomonas）為最優(yōu)勢(shì)菌屬（占總序列的47.51%），該菌屬在釀酒領(lǐng)域研究中的報(bào)道較少，唐婧[10]利用宏基因組學(xué)方法對(duì)茅臺(tái)酒酒曲中的細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析過(guò)程檢測(cè)到鹽單胞菌，該菌為耐鹽細(xì)菌，部分鹽單胞菌可應(yīng)用于處理高鹽染料廢水[11]。不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）為條件致病菌，其耐藥性較強(qiáng)，對(duì)氨芐青霉素、氯霉素等抗菌藥物具有耐藥作用[12]，該類菌主要為石油烴的降解者，對(duì)石油烴具有乳化和降解作用，可以降低石油烴生物毒性[13]。假單胞菌屬（Pseudomonas）于條件致病菌[14]，該菌類大多可對(duì)蛋白質(zhì)和脂肪進(jìn)行分解；假單胞菌屬與某些高級(jí)醇類具有較好的相關(guān)性，說(shuō)明該屬的細(xì)菌能生成高級(jí)醇。假單胞菌屬在釀酒領(lǐng)域報(bào)道較少，侯小歌等[15]以河南宋河白酒發(fā)酵30 d的糟醅為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)富集培養(yǎng)及稀釋涂布法分離厭氧及兼性厭氧菌，共分離到5株己酸菌、6株丁酸菌、2株甲烷菌、6株乳酸菌。丁酸菌、己酸菌和乳酸菌革蘭氏染色均為陽(yáng)性，甲烷菌為革蘭氏陰性菌。丁酸菌和己酸菌分別歸梭菌屬（Clostridium）和芽孢桿菌屬（Bacillus），甲烷菌為假單胞菌屬（Pseudomonas），乳酸菌為芽孢乳桿菌屬（Sporolactobacillus）。乳桿菌屬（Lactobacillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）是醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，并且乳桿菌屬（Lactobacillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）在L3樣品中為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，比例分別為24.14%和14.88%，而在L7樣品中含量相對(duì)較少，分別為8.84%和7.73%，這與第3輪次酒和第7輪次酒的風(fēng)味差異成正相關(guān)，這一群落結(jié)構(gòu)也決定了第3輪次酒和第7輪次酒的本質(zhì)差異。乳酸桿菌屬?gòu)V泛存在于酒醅中，該類細(xì)菌為酒類發(fā)酵過(guò)程中的生酸微生物，可以通過(guò)同型和異型乳酸兩種發(fā)酵方式產(chǎn)生大量乳酸，并能產(chǎn)生抗菌素等物質(zhì)，對(duì)釀酒過(guò)程中致病菌的生長(zhǎng)繁殖具有抑制作用，可以促進(jìn)酵母、霉菌等有益微生物的生長(zhǎng)，對(duì)釀酒過(guò)程的微生態(tài)環(huán)境具有保護(hù)、穩(wěn)定調(diào)控作用[16]；芽孢桿菌是醬香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中的主要產(chǎn)醬香功能菌，具有較強(qiáng)的分泌蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶等酶類的能力，可分解大分子物質(zhì)形成雙乙酰、含氮化合物等芳香物質(zhì)，對(duì)醬香型白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成具有重要貢獻(xiàn)作用。多項(xiàng)研究證明芽孢桿菌是醬香風(fēng)味成分形成的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，并將其應(yīng)用于制作強(qiáng)化大曲和堆積過(guò)程具有增強(qiáng)白酒醬香風(fēng)味與提高醬香型白酒質(zhì)量等作用[17-18]。當(dāng)前對(duì)芽孢桿菌耐高溫、產(chǎn)酶、產(chǎn)香的功能性研究較多，不同的芽孢桿菌代謝分泌的酶活力不同且功能特性也不一樣[19]。

2.3 真菌多樣性分析

醬香型白酒釀造過(guò)程真菌類微生物主要有酵母和霉菌。酵母具有產(chǎn)酒和產(chǎn)酯香功能；霉菌主要分泌糖化酶、蛋白酶等，降解淀粉、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，對(duì)產(chǎn)酒具有積極的促進(jìn)作用。同時(shí)，在生長(zhǎng)代謝過(guò)程還產(chǎn)生一些呈香呈味物質(zhì)，對(duì)醬香酒的風(fēng)味具有一定的貢獻(xiàn)。樣品中真菌序列的百分含量分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，在L3樣品中子囊菌門（Ascomycota）為優(yōu)勢(shì)菌門，占99.84%。在屬分類水平上，優(yōu)勢(shì)菌屬分別為嗜熱霉屬（Thermomyces）40.73%、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）25.98%、未分類的散囊菌目（Unclassfied-eurotiales）3.16%、Rasamsonia屬4.16%、曲霉屬（Aspergillus）2.59%、絲衣霉屬（Byssochlamys）2.35%、假絲酵母屬（Candida）0.55%、紅曲霉屬（Monascus）0.17%、毛孢子菌屬（Trichosporon）0.07%、小囊菌屬（Microascus）0.06%、Trichomonascus屬0.03%、青霉屬（Penicillium）0.02%、鏈格孢霉屬（Alternaria）0.02%。在L3樣品中特有的優(yōu)勢(shì)真菌屬包括嗜熱霉屬（Thermomyces）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、絲衣霉屬（Byssochlamys）、紅曲霉屬（Monascus）等。其中，嗜熱霉屬（Thermomyces）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）是醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的真菌微生物且都屬于嗜熱真菌類，它們是白酒發(fā)酵環(huán)境中重要酶類的來(lái)源，大多能產(chǎn)生具有高活力和熱穩(wěn)定性的纖維素酶、蛋白酶等，對(duì)降解高分子多糖和蛋白質(zhì)具有促進(jìn)作用，有利于釀酒原料被微生物利用，起到促進(jìn)微生物繁殖生長(zhǎng)以及產(chǎn)酒生香的作用。SHI J H等[20]研究發(fā)現(xiàn)，嗜熱霉菌屬為汾酒曲曲心的優(yōu)勢(shì)真菌，且該屬真菌在多種不良環(huán)境中都具有較好的熱穩(wěn)定性和較高的活力，表明其對(duì)醬香型白酒制酒環(huán)境的適應(yīng)性較好。嗜熱子囊菌能產(chǎn)生熱堿穩(wěn)定性較好的過(guò)氧化氫酶，該酶廣泛運(yùn)用于食品消毒、臨床分析、醫(yī)學(xué)診斷以及紡織、造紙、制漿等工業(yè)[21]。

表3 樣品中真菌序列的百分比含量Table 3 Percentage contents of fungal sequences in samples

在L7樣品中主要有兩個(gè)門類微生物—子囊菌門和擔(dān)子菌門，分別占49.5%和47.1%。在屬分類水平上，隱球酵母屬（Cryptococcus）占總序列的48.29%。此外，占總序列13.42%、6.32%、4.17%、2.59%、2.35%、1.8%、1.49%、1.46%的序列分別屬于曲霉菌屬（Aspergillus）、球果傘屬（Stro-bilurus）、假絲酵母屬（Candida）、木拉克酵母屬（Mrakia）、Kazachstania屬、梗孢酵母屬（Sterigmatomyces）、鎖霉菌屬（Itersonilia）、紅酵母菌屬（Rhodotorula）。還包括鏈孢霉屬（Neurospora）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、嗜熱霉屬（Thermomyces）、許旺酵母屬（Schwanniomyces）、絲衣霉屬（Byssochlamys）等。在L7樣品中特有的優(yōu)勢(shì)真菌屬有隱球酵母屬（Cryptococcus）、木拉克酵母屬（Mrakia）、Kazachstania屬、梗孢酵母屬（Sterigmatomyces）、鎖霉菌屬（Itersonilia）、紅酵母菌屬（Rhodotorula）。其中，隱球酵母屬（Cryptococcus）為最優(yōu)勢(shì)菌屬，關(guān)于隱球酵母屬在醬香型酒醅中的報(bào)道較少，大多報(bào)道表明隱球酵母屬具有較強(qiáng)的產(chǎn)酯能力[22]，并且作為非釀酒酵母對(duì)醇類的形成影響也較大，并在酒精發(fā)酵中發(fā)揮重要作用，具體作用尚未明確，正在對(duì)隱球酵母屬在醬香型白酒中的作用機(jī)制做進(jìn)一步的研究。

曲霉屬（Aspergillus）和假絲酵母屬（Candida）是醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)真菌屬，曲霉是釀酒過(guò)程中的一大類微生物，是釀造霉菌中種類最多的菌。由于醬香型白酒釀造環(huán)境偏酸性，曲霉分泌以酸性水解酶類為主，如酸性淀粉酶、酸性蛋白酶等，這些酶不僅耐乙醇，還具有耐酸特性，使曲霉能在酸性釀造環(huán)境條件下正常生長(zhǎng)代謝，分解原料中的淀粉與蛋白質(zhì)，為發(fā)酵提供持續(xù)性的動(dòng)力[23]。假絲酵母是白酒釀造發(fā)酵過(guò)程中的主要產(chǎn)酒酵母，對(duì)醬香酒風(fēng)味形成和感官品質(zhì)具有重要影響。目前，在多種發(fā)酵類食品中均有報(bào)道，例如酒曲[24]、奶酪[25]等，該屬真菌可以產(chǎn)生大量的酯類化合物，例如乙酸乙酯、乙酸異戊酯等酯類物質(zhì)[26]等，可為曲坯增加濃郁的酯香，此外假絲酵母還具有較強(qiáng)的產(chǎn)2-丁酮的能力[27]。劉蕓雅[28]對(duì)黃酒中的假絲酵母屬真菌與發(fā)酵中有機(jī)酸的相關(guān)性進(jìn)行研究，結(jié)果表明在白酒發(fā)酵過(guò)程中該菌類對(duì)形成有機(jī)酸具有重要作用，并對(duì)酒體風(fēng)格的形成具有重要影響。

3 結(jié)論

本研究使用高通量測(cè)序方法對(duì)酒醅樣品中微生物進(jìn)行了分析研究。結(jié)果表明，在醬香型白酒發(fā)酵過(guò)程中，在第3輪次樣品中乳桿菌屬（Lactobacillus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，而在第7輪次樣品中鹽單胞菌屬（Halomonas）為最優(yōu)勢(shì)菌屬；同時(shí)在第3輪次樣品中，嗜熱霉屬（Thermomyces）和嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）是發(fā)酵過(guò)程真菌微生物中的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，而在第7輪次樣品中隱球酵母屬（Cryptococcus）則為最優(yōu)勢(shì)菌屬。對(duì)比第7輪次和第3輪次酒醅中微生物的分析結(jié)果，二者在微生態(tài)多樣性上存在較大的差別。分析認(rèn)為可能正是因?yàn)榈?輪次和第7輪次的酒醅中的微生物在白酒發(fā)酵過(guò)程中處于動(dòng)態(tài)變化的差異性，導(dǎo)致兩個(gè)輪次生產(chǎn)出的白酒在產(chǎn)量和風(fēng)味質(zhì)量上存在較大的差異。

高通量測(cè)序技術(shù)與醬香型白酒釀造過(guò)程微生物研究的傳統(tǒng)方法相比較，由于傳統(tǒng)微生物技術(shù)的局限性，只能對(duì)酒醅中少量的功能微生物進(jìn)行研究，遠(yuǎn)不能滿足對(duì)復(fù)雜的微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性研究的需求[20，29]；而高通量測(cè)序技術(shù)從基因組的水平上解析微生物群落結(jié)構(gòu)，對(duì)于研究醬香型白酒生產(chǎn)過(guò)程中的微生物多樣性結(jié)構(gòu)分析更加全面，檢測(cè)獲取的生物信息量更大，更能說(shuō)明微生物結(jié)構(gòu)的真實(shí)性，顯示出高通量技術(shù)在醬香型白酒生產(chǎn)中對(duì)復(fù)雜微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)研究中的明顯優(yōu)勢(shì)[30-32]。因此該研究為探究白酒釀造微生物群落結(jié)構(gòu)特征提供了一種可借鑒的方法，可為進(jìn)一步研究醬香型酒醅中功能微生物提供參考。參考文獻(xiàn)：

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TS261.1

0254-5071（2017）05-0146-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.031

2017-02-09

貴州省工業(yè)攻關(guān)項(xiàng)目（黔科合GZ字[2011]3015）；貴州省科學(xué)技術(shù)廳重大專項(xiàng)（黔科合重大專項(xiàng)字[2012]601-5，黔科合重大專項(xiàng)字[2015]6012）；校立項(xiàng)目（研理工2017020）

郭敏（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)獒u香型白酒微生物。

*通訊作者：黃永光（1976-），男，研究員，博士，研究方向?yàn)獒u香型白酒。