許 岱,范光森,3,富志磊,馬 超,孫嘯濤,楊 然,孫寶國(guó),3,李秀婷,3,*

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048;2.北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100048;3.食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康北京高精尖創(chuàng)新中心,北京 100048)

一株高產(chǎn)β-苯乙醇酵母菌的篩選、鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu)化

許 岱1,2,范光森1,2,3,富志磊1,馬 超1,孫嘯濤1,2,楊 然1,孫寶國(guó)1,2,3,李秀婷1,2,3,*

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院,北京 100048;2.北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100048;3.食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康北京高精尖創(chuàng)新中心,北京 100048)

目的:本文主要是從大曲中篩選一株高產(chǎn)β-苯乙醇酵母菌株,并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。方法:采用平板涂布法篩選高產(chǎn)β-苯乙醇酵母菌株,通過(guò)菌落形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和分子生物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行鑒定;利用單因素優(yōu)化L-苯丙氨酸濃度、酵母浸粉濃度、溫度和初始pH等發(fā)酵條件,在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken法設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化,確定其產(chǎn)β-苯乙醇最佳發(fā)酵條件。結(jié)果:從濃香型大曲中篩選獲得一株高產(chǎn)β-苯乙醇的酵母,命名為Y1511,經(jīng)鑒定為庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母(Pichiakudriavzevii);該菌株在豆芽汁培養(yǎng)基中能產(chǎn)近30種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì);通過(guò)單因素和響應(yīng)面最終獲得該酵母發(fā)酵產(chǎn)苯乙醇的最佳條件為:葡萄糖 80 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、磷酸二氫鉀5 g/L、L-苯丙氨酸10 g/L、酵母浸粉5.5 g/L,初始pH5,在26 ℃培養(yǎng),苯乙醇產(chǎn)量達(dá)到3.25 g/L。結(jié)論:本文首次報(bào)道了大曲來(lái)源的庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母產(chǎn)苯乙醇研究。

大曲,庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母,苯乙醇,優(yōu)化

β-苯乙醇是繼香蘭素之后應(yīng)用最廣泛的香味化合物,具有柔和、愉快而持久的玫瑰香氣,作為香料在食品香精、化妝品、洗滌產(chǎn)品中得到廣泛應(yīng)用[1]。同時(shí),β-苯乙醇也是白酒、黃酒、清酒、果酒、葡萄酒、醬油、面包、干酪等傳統(tǒng)發(fā)酵食品中重要的呈味物質(zhì)[2-4]。如在米香型白酒中其為主體香,并且其不僅在濃香型白酒、醬香型白酒、豉香型白酒和黃酒等是重要的特征性風(fēng)味物質(zhì),而且對(duì)這些發(fā)酵食品其它風(fēng)味物質(zhì)起到協(xié)和及增效的作用[5-7]。由此可見(jiàn),無(wú)論是作為香味調(diào)節(jié)劑還是對(duì)于提升發(fā)酵食品品質(zhì),β-苯乙醇都具有重要的研究?jī)r(jià)值。

目前,全球β-苯乙醇的產(chǎn)量近萬(wàn)噸,絕大多數(shù)是采用化工原料苯或苯乙烯通過(guò)化學(xué)合成的方法生產(chǎn),也有少數(shù)部分是從玫瑰或玫瑰精油中提取出來(lái)的[8]。雖然化學(xué)合成β-苯乙醇價(jià)格低廉,市場(chǎng)價(jià)格僅為3.5美元/kg,但由于其合成所使用的廉價(jià)化工原料苯或苯乙烯多屬于致癌物質(zhì),不僅對(duì)人體健康和環(huán)境都有巨大危害,而且還含有一些不良?xì)馕兜母碑a(chǎn)物,嚴(yán)重影響β-苯乙醇的品質(zhì)。植物提取方法在安全性方面得到保障,但由于原料有限而造成天然提取的β-苯乙醇價(jià)格高達(dá)1000美元/kg以上[9]。隨著食品生物技術(shù)的發(fā)展和人們對(duì)食品安全性越來(lái)越重視,通過(guò)微生物發(fā)酵法生產(chǎn)天然苯乙醇香料得到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注與重視。同時(shí),在以β-苯乙醇為特征風(fēng)味物質(zhì)的多種發(fā)酵食品釀造過(guò)程中,更加強(qiáng)調(diào)通過(guò)調(diào)控自身微生物菌群而達(dá)到提高β-苯乙醇含量的目的。目前,已有多種分離獲得的酵母具有合成β-苯乙醇的能力報(bào)道,如釀酒酵母[1,10-12]、馬克斯克魯維酵母[13-14]、乳酸克魯維酵母[15]、異常威克漢姆酵母[16]等,這些研究主要集中于篩選獲得高產(chǎn)β-苯乙醇的菌株,從而利用生物發(fā)酵法獲得天然β-苯乙醇產(chǎn)物,很少有針對(duì)特殊發(fā)酵食品釀造中的微生物進(jìn)行篩選高產(chǎn)β-苯乙醇菌株的研究。

大曲是濃香型白酒釀造的發(fā)酵劑和生香劑,含有大量能起發(fā)酵和產(chǎn)香作用的微生物和酶類,為濃香型白酒釀造中重要的微生物菌庫(kù)[16]。以大曲作為篩選濃香型白酒釀造過(guò)程中高產(chǎn)苯乙醇菌株的樣品具有突出的代表性和可行性。因此,本文以大曲為高產(chǎn)苯乙醇菌株篩選的出發(fā)點(diǎn),針對(duì)濃香型白酒中的特征風(fēng)味物質(zhì)——苯乙醇進(jìn)行功能微生物的篩選,期望獲得一株高產(chǎn)β-苯乙醇的功能微生物,對(duì)所獲的功能微生物進(jìn)行鑒定,并進(jìn)行其產(chǎn)苯乙醇條件優(yōu)化研究,為實(shí)現(xiàn)利用該菌株提高濃香型白酒釀造過(guò)程中β-苯乙醇含量打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

濃香型大曲:取自安徽古井集團(tuán)有限責(zé)任公司2015年4月制備的大曲,從成熟曲房中不同位置隨機(jī)取得5塊完整大曲后,利用粉碎機(jī)粉碎,按照四分法取樣后裝入物菌袋中,于4 ℃保存待篩選菌株用。

β-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司;甲醇為色譜純;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

YPD培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母膏10,瓊脂粉20,115 ℃滅菌20 min。

WL培養(yǎng)基(g/L):酵母浸粉5,胰蛋白胨5,葡萄糖50,瓊脂20,磷酸二氫鉀0.55,氯化鉀0.425,氯化鈣0.125,氯化鐵0.0025,硫酸鎂0.125,硫酸錳0.0025,溴甲酚綠0.022,pH為6.5,121 ℃滅菌20 min。

活化培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20,蛋白胨20,酵母膏10,腺嘌呤0.04,尿嘧啶0.02,pH5.5,115 ℃滅菌20 min。

產(chǎn)香培養(yǎng)基(g/L):豆芽汁100,葡萄糖50,蒸餾水調(diào)配,115 ℃滅菌20 min。

轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖80,硫酸鎂0.5,磷酸二氫鉀5,L-苯丙氨酸10,酵母浸粉5,121 ℃滅菌20 min。

BCN-1360型生物潔凈工作臺(tái) 北京東聯(lián)哈爾儀器公司;電子天平,pH計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;LHS-100CL恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海一恒儀器設(shè)備有限公司;TU-19紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;CKX41-F32FL倒置熒光顯微鏡 日本OLYMPUS;BL-2200H型電子分析天平 島津國(guó)際貿(mào)易(上海)有限公司;7890A-5975C型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS) 美國(guó)Agilent科技有限公司;Tprofessional PCR儀 Biometra公司;Microfuge 2R離心機(jī) 北京田林恒泰科技有限公司;高效液相色譜儀(1260series) Agilent科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌株的篩選和分離 稱取1 g曲粉,加入9 mL無(wú)菌水,浸泡15 min后充分振蕩,制成菌懸液。在無(wú)菌操作條件下,用無(wú)菌水逐級(jí)稀釋至10-3、10-4、10-5和10-6梯度菌懸液。取各梯度菌懸液0.1 mL涂布于YPD平板上,每個(gè)稀釋梯度做三個(gè)平行。將培養(yǎng)基平板倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d,挑選平板上球形、表面突起、乳白色、不透明的單菌落,劃線于YPD平板上,直至在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)一致。將得到純菌種保存于YPD斜面培養(yǎng)基上。

1.2.2 酵母菌株初篩 將1.2.1篩選獲得的酵母接于活化培養(yǎng)基中,于30 ℃,轉(zhuǎn)速為160 r/min的搖床中培養(yǎng)16 h,再以1%的接種量轉(zhuǎn)接于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中,于30 ℃,轉(zhuǎn)速為160 r/min,培養(yǎng)54 h。發(fā)酵液于10000 r/min離心10 min,取上清液采用高效液相色譜法檢測(cè)β-苯乙醇含量。

1.2.3 高效液相色譜法測(cè)定β-苯乙醇含量 發(fā)酵上清液,用0.22 μm濾膜過(guò)濾,用純水稀釋適當(dāng)濃度后進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。具體方法參數(shù)為:C-18反相柱(ZORBAX Eclipse Plus C-18)4.6×250 mm,5 μm;流動(dòng)相為甲醇∶水=1∶1(v/v),流速:0.5 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL;β-苯乙醇檢出時(shí)間為16.8 min。

1.2.4 菌株鑒定

1.2.4.1 菌落形態(tài)觀察 WL培養(yǎng)基形態(tài)觀察:將1.2.2初篩獲得的高產(chǎn)苯乙醇菌種接種至YPD上進(jìn)行活化,培養(yǎng)24～48 h后接種至WL培養(yǎng)基,30 ℃下培養(yǎng),5 d后進(jìn)行觀察。

1.2.4.2 顯微結(jié)構(gòu)觀察 挑取1.2.4.1中YPD平板上單菌落的少量菌體,輕柔、均勻涂布在載玻片中的無(wú)菌水液滴中,固定后,采用美藍(lán)染色液進(jìn)行染色,制作臨時(shí)裝片,于10×100油鏡下觀察,記錄細(xì)胞形態(tài)特征、細(xì)胞大小、出芽情況。置于熒光倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.2.4.3 分子生物學(xué)鑒定 26S rDNA基因的PCR擴(kuò)增與序列測(cè)定：采用氯化芐法提取1.2.2初篩獲得的高產(chǎn)苯乙醇酵母基因組DNA,以基因組DNA為模板擴(kuò)增26S rDNA,以通用PCR引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)擴(kuò)增D1/D2區(qū)序列。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸45 s,31個(gè)循環(huán);72 ℃再延伸10 min。反應(yīng)體系(25 μL):Taq DNA聚合酶(5 U/L)0.25 μL,10×PCR Buffer 2.5 μL,dNTP(2.5 mol/L)2 μL,模板DNA(基因組DNA)2 ng,引物NL-1(20 μmol/L)0.5 μL,引物NL-4(20 μmol/L)0.5 μL,雙蒸水定容至25 μL。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),在紫外成像系統(tǒng)上拍照分析。將驗(yàn)證后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建:使用BLAST將26S rDNA測(cè)序結(jié)果在NCBI(http://www.ncbi. nlm. nih.gov/)上比對(duì),根據(jù)同源性搜索結(jié)果,使用MEGA 6.0生物學(xué)軟件對(duì)測(cè)試菌株和相關(guān)菌株的多個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)分析及Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.5 酵母發(fā)酵產(chǎn)香 將1.2.4鑒定的酵母在YPD液體培養(yǎng)基(固體YPD培養(yǎng)基中不添加瓊脂)中活化,以1%的接種量接種于產(chǎn)香培養(yǎng)基中,在30 ℃下靜置培養(yǎng)72 h。發(fā)酵液于4 ℃,10000 r/min離心10 min,取上清液采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法(SPME-GC-MS)檢測(cè)該酵母所產(chǎn)揮發(fā)性香氣成分。

1.2.6 頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定揮發(fā)性成分 將離心后的發(fā)酵液倒入頂空瓶中,恒溫(80 ℃)水浴30 min平衡樣品,同時(shí)將50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入GC-MS進(jìn)樣口,打開(kāi)老化柱子程序并老化萃取頭30 min。將老化后的萃取頭插入頂空瓶中吸附30 min,隨后將萃取頭移入氣相色譜的高溫汽化室中解吸5 min,進(jìn)行GC-MS分析。具體的GC-MS條件參數(shù)為:毛細(xì)管色譜柱為DB-FFAP,規(guī)格為(60 m×250 μm×0.25 μm);手動(dòng)進(jìn)樣,分流比為10∶1,進(jìn)樣口溫度250 ℃;程序升溫50 ℃,保留2 min,以8 ℃/min的速率升至120 ℃,保留2 min;再以10 ℃/min升至200 ℃,穩(wěn)定5 min;最后以5 ℃/min升至250 ℃,穩(wěn)定20 min;檢測(cè)器溫度250 ℃;載氣為He,流速 1 mL/min;EI電離源,電子能量70 eV;掃描范圍10-500 u;離子源溫度250 ℃;接口溫度250 ℃。

1.2.7 單因素實(shí)驗(yàn) 將1.2.4鑒定的酵母接種于活化培養(yǎng)基中,在30 ℃下以160 r/min條件下培養(yǎng)16～18 h。然后接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中,于200 r/min條件下培養(yǎng)。依次考察L-苯丙氨酸濃度(5、10、15、20、25和30 g/L)、酵母浸粉濃度(0、5、10、15、20、25和30 g/L)、溫度(20、25、30、35和40 ℃)和初始pH(1、2、3、4、5、6和7)。檢測(cè)方法參照1.2.3。

1.2.8 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 在單因素基礎(chǔ)上選擇酵母浸粉濃度、pH和溫度3個(gè)因素為自變量,采用 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì),以苯乙醇濃度為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)了3因素3水平響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)組合的因素與水平選取如表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Excel 2013和Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 苯乙醇產(chǎn)生菌株初篩

通過(guò)梯度稀釋結(jié)合平板涂布方法先后從古井貢酒曲中分離出16株菌株,經(jīng)菌落形態(tài)和細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)觀察,初步確定這些菌株為酵母菌。將上述獲得的酵母菌株接種于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中,于30 ℃,轉(zhuǎn)速為160 r/min,培養(yǎng)54 h,通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)β-苯乙醇含量,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2(未檢測(cè)到β-苯乙醇菌株未列出)。

表2 不同酵母發(fā)酵液中β-苯乙醇含量比較結(jié)果

發(fā)酵結(jié)束時(shí),通過(guò)嗅聞發(fā)現(xiàn)有多株酵母能產(chǎn)生明顯的香味物質(zhì),初步表明多株酵母具有產(chǎn)香能力。由表2可知,不同酵母產(chǎn)β-苯乙醇能力不同,有多株酵母具有較理想的產(chǎn)β-苯乙醇能力,同時(shí)與嗅聞時(shí)香味強(qiáng)弱結(jié)果幾乎一致,初步表明香味成分主要就是β-苯乙醇。通過(guò)表2可以發(fā)現(xiàn),酵母Y1507、Y1511、Y3604和Y11601所產(chǎn)β-苯乙醇能力相對(duì)較高,初步達(dá)到1.0 g/L以上,其中酵母Y1511顯示出最高的β-苯乙醇合成能力(艾氏途徑[17]),其產(chǎn)量初步達(dá)到1.57 g/L。圖1為菌株Y1511發(fā)酵上清液的高效液相色譜圖。由圖1可以看出,酵母Y1511發(fā)酵液在方法1.2.3條件下可以充分洗脫和分離,β-苯乙醇出峰時(shí)間在16.8 min左右(與苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)品出峰時(shí)間一致),峰形對(duì)稱且無(wú)明顯干擾峰,同時(shí)β-苯乙醇標(biāo)品在0～3.2 g/L內(nèi)線性關(guān)系良好,線性回歸方程為y=1889.0x+3.5567(R2=0.9998)。

圖1 酵母Y1511發(fā)酵液高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of β-phenylethanol in fermentation of yeast strain Y1511

表3 酵母Y1511發(fā)酵液中揮發(fā)性成分檢測(cè)

2.2 酵母Y1511發(fā)酵產(chǎn)香實(shí)驗(yàn)

酵母Y1511接種于產(chǎn)香培養(yǎng)基中,30 ℃下靜置培養(yǎng)72 h后,發(fā)酵液上清通過(guò)SPME-GC-MS方法檢測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示,由表3可以看出酵母Y1511能合成β-苯乙醇(屬于莽草酸從頭合成途徑[17]),初步表明該菌株能夠在白酒釀造過(guò)程中產(chǎn)生β-苯乙醇。除此之外,可以看到酵母Y1511還能產(chǎn)生多種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì),酯類有13種,醇類4種(包括β-苯乙醇),醛類2種,酚類1種,烷烴、烯烴類5種、酸類2種等。在這些風(fēng)味物質(zhì)中,已酸乙酯是濃香型白酒的主體呈香呈味風(fēng)味物質(zhì),而同樣具有玫瑰香的乙酸苯乙酯和苯乙醛則分別是清香型白酒和綿柔型白酒的重要風(fēng)味物質(zhì)[18-20]。由此可見(jiàn),酵母Y1511是白酒釀造過(guò)程中重要的產(chǎn)香酵母,研究酵母Y1511產(chǎn)β-苯乙醇能力對(duì)于更好的在白酒釀造中利用該菌提供理論基礎(chǔ)。

2.3 酵母Y1511的鑒定

2.3.1 酵母Y1511形態(tài)特征 酵母Y1511在WL培養(yǎng)基上菌落呈黃綠色,邊緣不規(guī)則,中間突起(圖2a)。其在顯微鏡下細(xì)胞呈長(zhǎng)橢圓形,并且有狹長(zhǎng)的細(xì)胞,生殖方式為頂端出芽,屬典型酵母特征(圖2b)。

圖2 酵母在WL培養(yǎng)基上菌落形態(tài)特征(a) 及顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)特征(×1000)(b)Fig.2 The colony morphology(a)of yeast strain Y1511 on WL culture medium and cell morphology(b)of yeast strain Y1511 captured by microscope(×1000)

2.3.2 26S rDNA序列分析 將酵母Y1511的26S rDNA測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST比對(duì),結(jié)果表明,與東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)或庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母(P.Kudriavzevii)的26S rDNA序列同源性最高,相似度達(dá)到99%。使用分子軟件MEGA 6.0對(duì)與酵母Y1511相似度較高的10株菌株進(jìn)行多序列比對(duì)分析,并利用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3)。由圖可以看出酵母Y1511與庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母同源性最高,鑒定為庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母(P.Kudriavzevii)。該菌株已于2016年5月31日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,其保藏號(hào)為CGMCC NO.12567。喬曉梅等[21]、蘭玉倩等[22]、Zheng等[23]和Li等[24]分別通過(guò)高通量測(cè)序法和變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)等方法研究了清香大曲真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母是其酵母屬的重要組成成分;孫劍秋等研究表明庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母可能是北大倉(cāng)白酒釀造過(guò)程中重要的微生物,在釀造過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[25];王曉丹等從醬香白酒中獲得一株庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母,發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)乙酸苯乙酯能力較強(qiáng)[26]。由此可見(jiàn),庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母是白酒釀造過(guò)程中的重要酵母菌株,但同時(shí)發(fā)現(xiàn)該菌株主要是在清香型白酒和醬香型白酒中報(bào)道,本文為首次在濃香型白酒中報(bào)道其重要性。更為重要的是,尚未見(jiàn)該菌株產(chǎn)β-苯乙醇的相關(guān)報(bào)道,為此,本文對(duì)該菌株產(chǎn)苯乙醇條件進(jìn)行優(yōu)化。

圖3 酵母Y1511基于26S rDNA D1/D2序列及Neighbor-Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of yeast strain Y1511 using neighbor-joining analysis based on the 26S rDNA D1/D2

2.4 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酵母Y1511合成β-苯乙醇條件

2.4.1 L-苯丙氨酸濃度對(duì)酵母Y1511合成苯乙醇的影響 在酵母產(chǎn)β-苯乙醇的艾氏途徑中,作為轉(zhuǎn)化底物的L-苯丙氨酸濃度至關(guān)重要,濃度過(guò)低酵母菌不能充分發(fā)揮催化能力,濃度過(guò)高則會(huì)造成轉(zhuǎn)化率低,導(dǎo)致成本增加[12]。為此,考察了底物L(fēng)-苯丙氨酸濃度對(duì)β-苯乙醇合成的影響,結(jié)果如圖4。可以看出,在L-苯丙氨酸濃度低于15 g/L時(shí),酵母Y1511合成β-苯乙醇的濃度隨底物濃度增加而增加,之后出現(xiàn)小幅度下降趨勢(shì)。當(dāng)L-苯丙氨酸添加量分別為10 g/L和15 g/L時(shí),酵母Y1511合成β-苯乙醇濃度分別達(dá)到1.78 g/L和1.85 g/L,兩者相差不大,故選擇10 g/L為最優(yōu)L-苯丙氨酸添加量,這與Etschmann等研究結(jié)果相近[27]。大多數(shù)研究表明L-苯丙氨酸濃度在5～10 g/L之間為最佳底物濃度范圍[13-15],如Eun等通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化獲得最佳的L-苯丙氨酸濃度為6.53 g/L,黃筱萍等實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明L-苯丙氨酸濃度在8 g/L時(shí)最佳[28-29];而Fabre等研究發(fā)現(xiàn)在L-苯丙氨酸濃度為2 g/L時(shí)最佳,苯乙醇產(chǎn)量達(dá)到1.4 g/L,同樣,Eshkol等研究表明當(dāng)L-苯丙氨酸濃度為4 g/L時(shí)β-苯乙醇產(chǎn)量達(dá)到較高水平,繼續(xù)增加L-苯丙氨酸濃度,苯乙醇產(chǎn)量不再增加[11,30];Grygier等和唐育岐等研究卻發(fā)現(xiàn)L-苯丙氨酸濃度分別為21 g/L和25 g/L時(shí)β-苯乙醇產(chǎn)量最高[31-32]。由此可見(jiàn),不同的酵母所需要的最佳底物濃度不同。

圖4 L-苯丙氨酸濃度對(duì)β-苯乙醇合成的影響Fig.4 Effect of L-phenylalanine on β-phenylethanol production from yeast strain Y1511

2.4.2 酵母浸粉濃度對(duì)酵母Y1511合成β-苯乙醇的影響 在酵母細(xì)胞中,β-苯乙醇合成走哪一條途徑取決于培養(yǎng)基中氮源的種類,只有當(dāng)L-苯丙氨酸作為唯一氮源存在時(shí),能高產(chǎn)β-苯乙醇的艾氏途徑才能占優(yōu)勢(shì)[33]。所以,很多研究中轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中只有L-苯丙氨酸作為唯一氮源[14-15,28]。然而,有相關(guān)研究表明,由于酵母浸粉中含有酵母生長(zhǎng)所需要的大量氨基酸、維生素和微量元素等生長(zhǎng)因子,所以在促進(jìn)酵母生長(zhǎng)方面具有重要的意義,從而促進(jìn)酵母合成β-苯乙醇[12,29,32]。本文對(duì)酵母浸粉添加量進(jìn)行了考察,結(jié)果如圖5所示,可以看出,酵母浸粉添加量為5 g/L時(shí),相比只有L-苯丙氨酸時(shí),酵母合成β-苯乙醇能力增強(qiáng),然而其它濃度情況下,酵母合成β-苯乙醇能力則都有所下降。這可能是因?yàn)樵诮湍附蹪舛容^低時(shí),主要為酵母生長(zhǎng)提供必要的因子,而在較高濃度時(shí),則因?yàn)榄h(huán)境中有更多容易利用的氮源存在,L-苯丙氨酸會(huì)通過(guò)其它途徑被代謝,如通過(guò)肉桂酸途徑降解為3-酮基乙二酸而進(jìn)入TCA循環(huán)[33]。以上結(jié)果與梅建鳳等、黃筱萍等和唐育岐等研究結(jié)果一致[12,29,32]。

圖5 酵母浸粉濃度對(duì)β-苯乙醇合成的影響Fig.5 Effect of yeast extract on β-phenylethanol production from yeast strain Y1511

2.4.3 溫度對(duì)酵母Y1511合成β-苯乙醇的影響 溫度會(huì)影響酵母的生長(zhǎng)和活力,考慮到酵母生長(zhǎng)溫度范圍,本實(shí)驗(yàn)選擇20～40 ℃的范圍內(nèi)進(jìn)行考察溫度對(duì)酵母Y1511合成苯乙醇的影響,結(jié)果由圖6?？梢钥闯?當(dāng)溫度為25 ℃時(shí),酵母Y1511合成β-苯乙醇產(chǎn)量最高為2.79 g/L。較高或較低溫度不僅影響菌株的正常生長(zhǎng),而且轉(zhuǎn)化所需要的酶在低溫條件下活性較低,在高溫則會(huì)導(dǎo)致酶失活,從而導(dǎo)致β-苯乙醇產(chǎn)量降低[29]。梅建鳳等通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得到釀酒酵母最佳的催化溫度為30 ℃,黃筱萍等結(jié)果表明酵母轉(zhuǎn)化生成β-苯乙醇的最佳溫度為28～30 ℃,而Etschmann等和Fang等實(shí)驗(yàn)結(jié)果則表明馬克斯克魯維酵母催化溫度較高,分別在32.5 ℃和35 ℃具有最佳轉(zhuǎn)化能力[12,14,27,29]。

圖6 溫度對(duì)Y1511合成β-苯乙醇的影響Fig.6 Effect of temperature on β-phenylethanol production from yeast strain Y1511

2.4.4 pH對(duì)酵母Y1511合成β-苯乙醇的影響 適宜的pH不僅有利于酵母生長(zhǎng),而且會(huì)影響代謝途徑,對(duì)酵母代謝起到重要的調(diào)控作用。通過(guò)優(yōu)化初始pH發(fā)現(xiàn)(圖7),隨著初始pH增加,酵母Y1511合成β-苯乙醇的量不斷增加,當(dāng)初始pH達(dá)到5.0時(shí),產(chǎn)量達(dá)到最大,為3.18 g/L,之后,隨著初始pH繼續(xù)增加,產(chǎn)量逐漸降低。圖中所示的自然pH為5.5左右,也符合上述規(guī)律。黃筱萍等采用磷酸鹽類緩沖液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH和控制代謝過(guò)程中的pH以及加入CaCO3控制轉(zhuǎn)化過(guò)程的pH,結(jié)果表明pH控制在5.2～5.3有利于轉(zhuǎn)化的順利進(jìn)行[29]。崔志峰等對(duì)釀酒酵母合成β-苯乙醇條件優(yōu)化發(fā)現(xiàn)最佳的初始pH為5～6;Eun等對(duì)異常畢赤酵母優(yōu)化的結(jié)果表明,其最適初始pH為5.03;同樣,Grygier等對(duì)季也蒙畢赤酵母合成β-苯乙醇初始pH條件進(jìn)行優(yōu)化,最佳結(jié)果為5.0,以上結(jié)果與本文一致[28,31,34]。值得注意的是,該菌株pH適應(yīng)性比較強(qiáng),即使在pH為1.0時(shí)也能很好的生長(zhǎng),并能合成β-苯乙醇。

圖7 pH對(duì)Y1511合成β-苯乙醇的影響Fig.7 Effect of pH on β-phenylethanol production from yeast strain Y1511

2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化酵母Y1511合成β-苯乙醇條件

2.5.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理,選擇酵母浸粉濃度、pH和溫度為優(yōu)化參數(shù),以β-苯乙醇的產(chǎn)量為響應(yīng)值,對(duì)酵母Y1511發(fā)酵產(chǎn)β-苯乙醇實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì),并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析(表4)。通過(guò)Design-Expert8.0.6軟件分析,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合,得到回歸方程:Y=3.20+0.065A-0.025B+0.045C+0.055AB-0.050AC-0.020BC-0.24A2-0.18B2-0.13C2。

表4 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

對(duì)模型進(jìn)行回歸分析后,其結(jié)果如表5。

2.5.2 各因素間交互作用分析 通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件繪制三維響應(yīng)曲面圖,探究?jī)梢蛩亻g交互作用對(duì)酵母Y1511發(fā)酵產(chǎn)β-苯乙醇的影響,結(jié)果見(jiàn)圖8～圖10?？梢?jiàn)酵母浸粉濃度和pH、溫度之間具有較強(qiáng)的交互作用,溫度和pH間交互作用弱,但也對(duì)酵母Y1511發(fā)酵產(chǎn)β-苯乙醇具有一定的影響。

通過(guò)回歸方程得出,酵母浸粉濃度、pH、溫度分別為5.56 g/L、4.94、25.79 ℃時(shí),預(yù)測(cè)β-苯乙醇含量達(dá)到3.21 g/L。為方便后續(xù)實(shí)驗(yàn),選擇酵母浸粉濃度5.5 g/L、pH5,在26 ℃條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn),β-苯乙醇含量達(dá)到3.25 g/L,與預(yù)測(cè)值接近,證明擬合模型可以較好的找出酵母Y1511發(fā)酵產(chǎn)β-苯乙醇的最優(yōu)條件。這與榮紹豐等報(bào)道的結(jié)果近似(3.26 g/L),高于Fabre等研究的馬克斯克魯維酵母發(fā)酵水平,而略低于Eshkol等研究的釀酒酵母產(chǎn)β-苯乙醇的能力,處于單相發(fā)酵的中等偏上水平[11,30,35]。

表5 回歸模型方差分析

圖8 酵母浸粉和pH對(duì)酵母Y1511發(fā)酵產(chǎn)β-苯乙醇影響Fig.8 Effect of yeast extract and pH on β-phenylethanol production from yeast strain Y1511

圖9 酵母浸粉和溫度對(duì)酵母Y1511發(fā)酵產(chǎn)β-苯乙醇影響Fig.9 Effect of yeast extract and temperature on β-phenylethanol production from yeast strain Y1511

圖10 pH和溫度對(duì)酵母Y1511發(fā)酵產(chǎn)β-苯乙醇影響Fig.10 Effect of pH and temperature on β-phenylethanol production from yeast strain Y1511

注：*為顯著,**為極顯著。

3 結(jié)論

本研究從濃香型大曲中篩選獲得一株高產(chǎn)β-苯乙醇的庫(kù)德里阿茲威畢赤酵母,且該酵母發(fā)酵產(chǎn)香物質(zhì)較多,適合應(yīng)用于白酒釀造過(guò)程中,作為功能強(qiáng)化菌調(diào)控白酒的風(fēng)味。通過(guò)單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化,最終確定該酵母最佳條件為:葡萄糖80 g/L,硫酸鎂0. 5 g/L,磷酸二氫鉀5 g/L,L-苯丙氨酸濃度10 g/L,酵母浸粉濃度5.5 g/L,初始pH5,培養(yǎng)溫度26 ℃。在該條件酵母Y1511合成β-苯乙醇高達(dá)3.25 g/L,這是首次有關(guān)該種屬酵母產(chǎn)β-苯乙醇的相關(guān)研究,為白酒生產(chǎn)中產(chǎn)香酵母的研究奠定基礎(chǔ)。

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Screening of a high-yieldβ-phenylethanol yeast and optimization of its cultural conditions

XU Dai1,2,FAN Guang-sen1,2,3,FU Zhi-lei1,MA Chao1,SUN Xiao-tao1,2,YANG Ran1,SUN Bao-guo1,2,3,LI Xiu-ting1,2,3,*

(1.School of Food and Chemical Engineering,Beijing Technology & Business University,Beijing 100048,China;2.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients,Beijing Key Laboratory of Flavor Chemistry,Beijing 100048,China;3.Beijing Innovation Centre of Food Nutrition and Human Health,Beijing 100048,China)

Objective:A yeast with high-yield forβ-phenylethanol was isolated and purified from Daqu,and the fermentation conditions ofβ-phenylethanol produced from it were optimized. Methods:The high-yieldβ-phenylethanol yeast was isolated and purified by traditional microbial separation;then the yeast was identified by the morphological and physiological characteristics and its 26S rDNA D1/D2 sequence. The factors including L-phenylalanine,yeast extract,temperature and initial pH,that affected the yield ofβ-phenylethanol,were studied in single factor optimization test. On the basis of single factor test,the conditions forβ-phenylethanol production were explored by Box-Behnken design involving the yeast extract,temperature and initial pH at three levels in combination with response surface methodology. Results:A yeast designated as Y1511 with high-yield forβ-phenylethanol was isolated and purified from strong-flavor Daqu,then the yeast was identified as types ofPichiakudriavzevii. It was tested for arom production in bean sprouts medium,and there were nearly thirty kinds of volatile components present in the fermentation of medium. By the experiments of single factor and Box-Behnken design,the optimal conditions forβ-phenylethanol production were as follows:glucose 80 g/L,MgSO40.5 g/L,KH2PO45 g/L,L-phenylalanine 10 g/L,yeast extract 5.5 g/L and initial pH5,incubated at 26 ℃. Under the condition,the yeast Y1511 yieldedβ-phenylethanol of 3.25 g/L. Conclusion:This is the first report aboutβ-phenylethanol production ofP.Kudriavzeviifrom strong-flavor Daqu.

Daqu;Pichiakudriavzevii;phenylethanol;optimization

2016-10-08

許岱(1992-)，女，碩士，研究方向:傳統(tǒng)食品釀造，E-mail：xdxd0627@163.com。

*通訊作者:李秀婷(1970-)，女，博士，研究方向:食品微生物與酶工程，E-mail:lixt@btbu.edu.cn。

“十三五”科技計(jì)劃國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016YFD0400500)；中國(guó)博士后科學(xué)基金面上項(xiàng)目(2016M590026)。

TS201.3

B

1002-0306(2017)05-0151-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.020