王京偉 趙禮文 吳 薇 陳 振 李 艷

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湖北地區(qū)9 058例女性人乳頭瘤病毒基因分型分析*

王京偉 趙禮文 吳 薇 陳 振 李 艷#

目的：分析湖北地區(qū)人乳頭瘤病毒(HPV)感染狀況及基因型分布。方法：2012-03-2015-11在本院體檢、門診或住院9 058例女性宮頸脫落細(xì)胞，采用流式點(diǎn)陣儀/液態(tài)芯片分析系統(tǒng)檢測(cè)其HPV基因分型，分析所有受檢者HPV基因型分布及單一、多重感染分布，比較不同年齡、不同就診途徑及不同疾病組間HPV 感染特點(diǎn)。結(jié)果：所有受檢者中共檢出HPV陽(yáng)性2 524例，感染率27.86%。湖北地區(qū)最常見(jiàn)的四種HPV亞型為HPV16(7.37%)、52(5.05%)、58(4.03%)、18(2.27%)。單一基因型感染率最高(20.51%，1 858/9 058)，二重-六重及以上感染逐漸減少。各年齡組HPV中低危型及高危型感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，混合感染率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中低危型感染以≤20歲組最高，高危型感染率以41-60歲組最高，同一年齡組內(nèi)均以高危型感染為主。不同就診途徑受檢者HPV各型感染率組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，各組中低危型感染率在體檢組最高，明顯高于其它兩組(P<0.01)；門診組和住院組以高危型為主，明顯高于體檢組(P<0.01)。住院患者不同疾病組間中低危型HPV感染率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)；高危型HPV感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，惡性腫瘤組高危型感染率最高，其它組最低(P<0.01)；各組高危型HPV感染率均明顯高于中低危感染率(P<0.05)。結(jié)論：應(yīng)加強(qiáng)湖北地區(qū)女性HPV的篩查力度，特別是HPV16、52、58、18四種最常見(jiàn)基因型的篩查，尤其針對(duì)41-60歲年齡組人群，可有效降低宮頸癌和由HPV引發(fā)的其它腫瘤或疾病發(fā)生率。

宮頸癌；人乳頭瘤病毒；基因分型

宮頸癌是僅次于乳腺癌的女性惡性腫瘤。人乳頭瘤病毒(HPV)是一種嗜上皮性病毒，能導(dǎo)致人類多部位上皮的增生性病變，是宮頸癌的主要病因和必要條件。目前已發(fā)現(xiàn)的HPV有200多個(gè)亞型，其中30多個(gè)與生殖道感染有關(guān)， HPV致癌性分為高危和中低危。中低危型包括HPV6，11，42，43，44等，可致生殖器尖銳濕疣等良性病變，但有一定比例與高危型混合感染[1]；高危型包括HPV16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68等，與宮頸、陰道、外陰、肛門、陰莖、口咽等部位惡性腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，99.7%的宮頸癌存在高危型HPV感染，且病毒量與宮頸病變程度有關(guān)[2, 3]。我國(guó)婦女83%的子宮浸潤(rùn)癌、84%的子宮頸鱗癌由HPV16或18型引起[4]。因此，適齡女性及相關(guān)疾病患者進(jìn)行HPV基因分型檢測(cè)很有必要。在宮頸癌篩查中大力推廣HPV基因檢測(cè)可極大提高宮頸癌早期檢出率。

有關(guān)指南和權(quán)威機(jī)構(gòu)[5，6]陸續(xù)發(fā)布指南建議對(duì)30歲以上女性定期進(jìn)行宮頸癌篩查，尤其將HPV基因分型檢測(cè)作為常規(guī)篩查手段，提高篩查靈敏度和特異性。國(guó)內(nèi)一些地方已有較多報(bào)道，包括武漢地區(qū)的檢測(cè)報(bào)道[7, 8]，而湖北地區(qū)目前還缺乏大樣本的數(shù)據(jù)分析。

因此，本研究收集2012-03-2015-11在本院體檢、門診及住院的不同年齡人群的宮頸上皮細(xì)胞樣本9058例，采用流式點(diǎn)陣儀/液態(tài)芯片分析系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行HPV基因分型檢測(cè)，分析受檢者HPV基因型分布及單一、多重感染分布，比較不同年齡，不同就診途徑及不同疾病組間HPV 感染特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象和分組

收集2012-03-2015-11在本院體檢、門診及住院女性患者的宮頸上皮細(xì)胞樣本9 058例進(jìn)行HPV基因分型檢測(cè)，均來(lái)自湖北省各市縣及其周邊地區(qū)?；颊吣挲g9個(gè)月-87歲，平均41.49±11.04歲，根據(jù)受檢者的年齡分為4組(≤20歲組，21-40歲組，41-60歲組，≥61歲組)；根據(jù)就診途徑分為3組(體檢組、門診組和住院組)；根據(jù)就診患者疾病類型將住院患者分為4組(炎癥組、良性腫瘤組、惡性腫瘤組和其它組)。

1.2 儀器和試劑

HPV基因分型檢測(cè)試劑盒(上海透景生命科技股份有限公司)；T100 PCR 擴(kuò)增儀(美國(guó)Biorad公司)；多功能流式點(diǎn)陣儀和Luminex200液相芯片分析系統(tǒng)(美國(guó)Luminex公司)；MK-10干式恒溫器(鄭州南北儀器設(shè)備有限公司)。

1.3 標(biāo)本采集

窺陰器暴露宮頸后，用干凈棉拭子擦去宮頸口過(guò)多分泌物，將宮頸刷伸入宮頸口順時(shí)針旋轉(zhuǎn)3-5圈，折斷刷柄后將刷頭放入細(xì)胞保存液中，密封并盡快送檢。若不能立即檢測(cè)則置4℃冰箱保存，不合格標(biāo)本需重新采樣。對(duì)于未婚或無(wú)性生活史者直接取陰道分泌物進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 HPV基因檢測(cè)

1.4.1 DNA提?。撼浞窒疵搶m頸刷后，取0.4ml洗脫液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，14 000rpm離心3min，棄上清，保留沉淀物；向沉淀物中加入200μl脫落細(xì)胞核酸釋放試劑，振蕩混勻，100℃干式恒溫器加熱15min，14 000 rpm離心5min，當(dāng)天檢測(cè)，若不能當(dāng)天檢測(cè)，則吸取上清于-20℃冰箱保存待檢。

1.4.2 PCR擴(kuò)增： 取出PCR反應(yīng)管，在管蓋上做好標(biāo)記，分別加入已提取待測(cè)樣品5μl。加樣結(jié)束后將PCR反應(yīng)管放置擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序95℃ 5min，95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，共5個(gè)循環(huán)，95℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，共35個(gè)循環(huán)，72℃ 3min， 4℃保存產(chǎn)物。

1.4.3 HPV DNA變性及雜交：在微孔雜交板內(nèi)加入22μl微球雜交液和3μl擴(kuò)增產(chǎn)物，抽吸混勻。封口膜封口。在擴(kuò)增儀中進(jìn)行變性和雜交，程序?yàn)?5℃ 5min，48℃ 30min。雜交結(jié)束后每孔加入SA-PE溶液75μl，抽吸混勻，封口后在擴(kuò)增儀內(nèi)繼續(xù)孵育(48℃，15min)。將微孔雜交板快速轉(zhuǎn)移至預(yù)熱48℃的Luminex 200上進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.4 結(jié)果判定：HPV基因分型檢測(cè)能使29種亞型同步檢測(cè)，包括高危型19種：HPV16，18，26，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，73，82，CP8304；中低危型10種：HPV6，11，40，42，43，44，55，61，81，83。采用Luminex流式分析儀閱讀，取每種復(fù)合物的微球編碼及對(duì)應(yīng)熒光信號(hào)，經(jīng)透鏡HPV專用分析軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判讀：陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照Globin的信號(hào)大于150，且大于等于2.5倍背景信號(hào)值，表明實(shí)驗(yàn)成功。如果不符合前述條件，代表實(shí)驗(yàn)失敗?？赡艿脑蚴菢颖局袥](méi)有采集到細(xì)胞、某種試劑失效或者相關(guān)儀器設(shè)備故障。HPV亞型探針的信號(hào)>150，且≥2.5倍背景信號(hào)值，即可判斷該探針對(duì)應(yīng)的HPV型別為“陽(yáng)性”，反之為“陰性”；若HPV亞型探針信號(hào)小于150，則該亞型檢出無(wú)效，不輸出結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Excel建立數(shù)據(jù)庫(kù)，剔除重復(fù)數(shù)據(jù)，以首次結(jié)果錄入，以SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用百分率(%)表示，組間差異比較采用χ2檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)各基因型HPV感染率時(shí)以感染株表示，統(tǒng)計(jì)高危型、中低危型及合計(jì)感染率時(shí)以感染例數(shù)計(jì)算。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HPV基因型及感染率分布

9 058例受檢者中HPV陽(yáng)性2 524例(陽(yáng)性率27.86%)；共檢出29種基因型3 434個(gè)HPV株，包括中低危型490株(14.27%)，高危型2 944株(85.73%)，后者顯著高于前者(χ2=3 504.5，P<0.01)。高危型感染者以HPV16型最多，占全部被檢病例的7.37%，其它基因依次減少，HPV52型占5.05%、HPV58型占4.03%、HPV18型占2.27%、HPV53型占2.19%、HPV33型占2.09%；中低危感染者以HPV11型較多，占全部被檢病例的1.29%，HPV6型次之，占1.19%(表1)。HPV感染的單一基因型感染較多，達(dá)1 858例(20.51%)，二重-六重及以上感染逐漸減少，分別為493例(5.44%)、127例(1.40%)、28例(0.31%)、13例(0.14%)、5例(0.04%)，共666例(7.35%)。單一感染率明顯高于多重感染率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1 125.9，P<0.01)(圖1)。

表1 HPV各基因亞型的感染率分布

注：*為有效檢測(cè)總例數(shù)

圖1 HPV單一和多重基因型感染分布圖

2.2 不同年齡組HPV基因型感染分布

9 058例受檢者中有年齡記載的共8 816例，各年齡組中低危型、高危型感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，混合型感染率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.01)。中低危型感染以≤20歲組最高，其它組間感染率相當(dāng)；高危型感染率以41-60歲組最低，其它組間感染率相當(dāng)。同一年齡組內(nèi)中低危型、高危型及混合型感染率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，且均以高危型感染率最高。見(jiàn)表2。

表2 不同年齡組HPV基因型感染分布

注：與≤20歲組比較，1)P<0.01；與21-40歲組比較，2)P<0.01；與41-60歲組比較，3)P<0.01；與同組中低危型感染比較，4)P<0.01；與同組高危型感染比較，5)P<0.01

2.3 不同就診途徑受檢者HPV基因型感染分布

不同就診途徑受檢者HPV各型感染率組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。體檢組中低危型感染率最高(P<0.01)；門診組和住院組高危型感染率最高明顯高于體檢組(P<0.01)。體檢組高危型感染率低于中低危型感染率；門診組和住院組高危型感染率均高于中低危型感染率(均P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 不同就診途徑患者HPV基因型感染分布

注：與體檢組比較，1)P<0.05；與同組中低危型感染比較，2)P<0.01

2.4 不同疾病組HPV基因型感染分布

住院患者不同疾病組間中低危型HPV感染率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高危型HPV感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，惡性腫瘤組最高，其它組最低。不同疾病各組患者高危型HPV感染率均高于中低危型感染率(均P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 不同疾病組的HPV基因型感染分布情況

注：與炎癥組比較，1)P<0.05；與良性腫瘤組比較，2)P<0.05；與同組中低危型感染比較，3)P<0.01

3 討 論

宮頸癌是由高危型HPV的持續(xù)或者反復(fù)感染而誘發(fā)的女性第二大常見(jiàn)婦科惡性腫瘤，嚴(yán)重危害女性生殖健康[9]。對(duì)高危型HPV病毒的持續(xù)感染予以有效阻斷能夠阻滯癌前病變的發(fā)展，是防治宮頸癌的重要方法[10, 11]。因此，強(qiáng)化HPV篩查力度、提高檢測(cè)靈敏度對(duì)宮頸癌的防治至關(guān)重要。

HPV各基因型分布與地區(qū)及經(jīng)濟(jì)發(fā)展程度有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，較發(fā)達(dá)地區(qū)HPV感染率明顯低于發(fā)展中及一般發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)，且以HPV 16最為常見(jiàn)[12]。國(guó)際癌癥研究協(xié)會(huì)(IARC)調(diào)查顯示，全球?qū)m頸癌患者中最常見(jiàn)的10種亞型依次為(數(shù)據(jù)不包括中國(guó)人)：HPV 16、18、45、31、33、52、58、35、59、56；亞洲相對(duì)流行的是HPV 52和58；其中東亞和中南亞地區(qū)為HPV 16、52、58；南亞和東非地區(qū)主要是HPV 16、18、31[13]。

本研究中HPV感染型別由高到低依次是HPV 16、52、58、18，該結(jié)果與東亞和東南亞地區(qū)感染型別一致，但與國(guó)內(nèi)其它地區(qū)報(bào)道有差異，如河南省是HPV 16、58、18、31[14]，陜西是HPV 16、58、52、53[15]，天津是HPV 16、58、52、33[1]，廣州地區(qū)最常見(jiàn)的亞型依次是HPV 16、52、53、58和HPV CP8304型[16]。雖然各地區(qū)的優(yōu)勢(shì)基因型別排序及合計(jì)感染率不盡相同，但均以高危型感染居多，排在前三位的型別基本一致。本研究中HPV多重感染占7.35%，以二重感染為主，混合感染主要是以HPV 16、52、58、53、18這5個(gè)亞型之間的相互混合感染最為多見(jiàn)。表明這5種型別可能更易相互感染，但最終結(jié)論可能還要結(jié)合更多地區(qū)的大數(shù)據(jù)做進(jìn)一步研究論證。

HPV多重感染的患者出現(xiàn)持續(xù)性感染的概率更高，多重HPV感染比單一型感染造成的癌前病變風(fēng)險(xiǎn)也更高[17]。本研究的上述結(jié)果提示應(yīng)加強(qiáng)對(duì)湖北地區(qū)感染率最高的4種高危型HPV進(jìn)行早期預(yù)防和監(jiān)控。本研究也為湖北區(qū)域HPV耐藥基因型的疫苗制備提供參考依據(jù)。

國(guó)內(nèi)外研究表明，HPV感染與年齡相關(guān)。在本次研究中發(fā)現(xiàn)不同年齡組HPV高危、中低危型及感染率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，中低危型感染以≤20歲組最高，高危型感染率以41-60歲組最高；各年齡組內(nèi)均以高危型感染率最高。各年齡段中低危感染率、混合型感染率在≤20歲呈現(xiàn)峰值。其原因可能為≤20歲為性行為活躍期，衛(wèi)生防護(hù)意識(shí)較薄弱，感染率相對(duì)較高，而其自我恢復(fù)能力較強(qiáng)，感染后多可自行恢復(fù)。而41-60歲組年齡段女性，分娩時(shí)產(chǎn)道的損傷，自身抵抗力隨著卵巢功能衰退而逐漸下降，而此年齡段女性生活壓力較大，導(dǎo)致免疫力下降，因此高危型HPV感染率明顯上升。因此加強(qiáng)對(duì)31歲以后的女性進(jìn)行HPV基因分型檢測(cè)對(duì)宮頸癌及宮頸癌前病變的預(yù)防很有必要。

不同就診途徑患者間的HPV感染率也存在差異，其中體檢組的HPV合計(jì)感染率最高(30.87%)，以低危型HPV 6或11型為主。門診患者組次之(28.74%)，住院患者組的合計(jì)感染率相對(duì)最低(26.86%)，但均以高危型HPV 16或18為主。相較門診及住院患者，相對(duì)健康的體檢人群中HPV感染率反而最高，提示應(yīng)加強(qiáng)湖北地區(qū)“健康女性”的HPV的篩查。住院患者其惡性腫瘤組患者HPV合計(jì)感染率最高，且以高危型為主，可見(jiàn)高危型HPV感染與炎癥與腫瘤之間關(guān)系密切。

目前國(guó)內(nèi)通過(guò)接種HPV疫苗實(shí)現(xiàn)一級(jí)預(yù)防，通過(guò)癌前病變的檢測(cè)和治療來(lái)實(shí)現(xiàn)二級(jí)預(yù)防。每年的宮頸細(xì)胞涂片檢查帶來(lái)大量的假陽(yáng)性和不必要的治療[18]。大樣本隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)證實(shí)HPV篩查比細(xì)胞涂片報(bào)告的宮頸上皮內(nèi)瘤變3級(jí)及以上(CIN3+)的檢出率約高出50%，且半數(shù)以上的CIN3+患者細(xì)胞學(xué)檢測(cè)正常。因此，HPV作為宮頸癌初篩方案或可降低CIN3+的發(fā)病率，而且還能提高宮頸腺癌的檢出率，細(xì)胞學(xué)檢測(cè)很難檢測(cè)出宮頸腺癌。已有報(bào)道HPV篩查可將因缺乏有效篩查手段和干預(yù)措施而導(dǎo)致的宮頸癌新發(fā)病例減少70-80%，而采用HPV疫苗又可防止約80%的癌前病變發(fā)生。所以，HPV疫苗聯(lián)合HPV DNA篩查可有效降低宮頸癌發(fā)生率[19，20]。

綜上所述，湖北地區(qū)女性HPV感染不容忽視，應(yīng)加強(qiáng)HPV篩查，特別是HPV 16、52、58、18型，可有效降低宮頸癌的的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。

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本文第一作者簡(jiǎn)介：

王京偉(1986-)，女，漢族，博士，主治醫(yī)師，主要從事分子診斷與個(gè)體化醫(yī)療研究

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The Genetic Subtypes of HPV Infection in 9 058 Women in Hubei

WANG Jing-wei， ZHAO Li-wen， WU Wei， CHEN Zhen， LI Yan#

Department of Clinical Laboratory, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China;#

Objective: To investigate the relationship of HPV infection status and the genotype distribution in Hubei region with age, different clinic visit source and different disease types. Method: Cape flow-through hybridization was used to detect HPV genotyping in 9 058 local women patients in renmin hospital of wuhan university from March 2012 to November 2015. The distribution of HPV genotype and the distribution of single and multiple infections were analyzed. The HPV genotyping in different age groups, different clinic visit source groups and different disease type groups were compared and analyzed. The rates of single infection and multiple infections were analyzed. Results: Among the 9 058 patients, 2 524 were infected with HPV(27.86%). Out of 29 subtypes of HPV, HPV16 (7.37%), 52 (5.05%), 58 (4.03%) and 18(2.27%)were the most common types. 1 858 patients were single infection(20.51%), the rates of single infection were higher than multiple infection. The difference of HPV genotype in different age groups were significantly(P<0.01). The infection rate of middle and low-risk HPV infection and multiple infection were highest in ≤20 years old groups, while infection rate of high-risk HPV infection groups were highest in 41-60 years old groups. The infection rate of high-risk HPV were higher than middle and low-risk HPV infection in different age groups. The difference of HPV genotype in different sources of patients were significantly(P<0.01), the middle and low-risk HPV infection of patients from general population screen was highest,while the rates of outpatient took the top spot of high-risk HPV infection, the high-risk HPV infection from outpatient and inpatient groups were higher than general population screen. The high-risk HPV genotype in different disease groups were significantly(P<0.01), the high-risk HPV infection in different disease groups were higher than middle and low-risk HPV infection. Conclusion: It's important to promote HPV screening rate in women in Hubei region,especially screening for the most common HPV genotypes 16, 52, 58 and 18, and 41-60years old groups should draw extra attentions, which can effectively reduce cervical cancer and HPV caused by other tumor or disease incidence.

Cervical cancer; HPV; Genotype

國(guó)家自然基金項(xiàng)目(81200389)，武漢大學(xué)青年教師自主科研項(xiàng)目(2042015kf0113)

武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科， 武漢 430060；#

，E-mail:yanlitf1120@163.com

本文2016-11-24收到，2017-03-19修回

R737.33

A

1005-1740(2017)02-0037-06