李書強，李林會，沈江潔，景 煥 ，張明珠，杜曉端，蘆國嫣

(1 河北省農(nóng)墾事業(yè)發(fā)展中心，河北 石家莊，050021；2 河北科技師范學(xué)院；3 河北省易縣西陵滿族初級中學(xué))

生防菌對黃瓜枯萎病防效及其對黃瓜誘導(dǎo)抗性測定

李書強1，李林會1，沈江潔2，景 煥3，張明珠2，杜曉端2，蘆國嫣2

(1 河北省農(nóng)墾事業(yè)發(fā)展中心，河北 石家莊，050021；2 河北科技師范學(xué)院；3 河北省易縣西陵滿族初級中學(xué))

為確定生防菌對黃瓜枯萎病的防效及其對黃瓜誘導(dǎo)抗性，采用生物測定方法，測定了枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)菌劑、粉紅粘帚霉(Gliocladiumroseum)菌劑、棘孢木霉(Trichodemaasperellum)及嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)對黃瓜枯萎病的防治效果及黃瓜葉片幾種防御酶活性的影響。結(jié)果表明：經(jīng)棘孢木霉菌對黃瓜枯萎病的防治效果達到70.24%。生防菌劑處理后的黃瓜葉片中4種防御酶的活性變化呈現(xiàn)一定的規(guī)律：經(jīng)粉紅粘帚霉、枯草芽孢桿菌和棘孢木霉處理的黃瓜葉片POD活性是空白對照的1.26倍、1.11倍和1.40倍；經(jīng)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌和棘孢木霉處理的黃瓜葉片SOD活性分別是空白對照的3.92倍和2.66倍；經(jīng)粉紅粘帚霉、枯草芽孢桿菌、棘孢木霉和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌4種生防菌處理的黃瓜葉片PAL活性分別僅為空白對照處理的43.01%，69.11%，33.81%，34.70%；經(jīng)枯草芽孢桿菌、粉紅粘帚霉、棘孢木霉和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌4種生防菌處理的黃瓜葉片CAT活性分別是空白對照的1.04倍、1.88倍、1.07倍和1.07倍。說明黃瓜經(jīng)生防菌誘導(dǎo)處理后的一部分防御酶活性會升高。

生防菌；黃瓜枯萎?。环乐涡Ч?；防御酶活性

黃瓜枯萎病是一種嚴(yán)重的土傳病害，其病原菌為半知菌亞門鐮孢屬的尖孢鐮刀菌黃瓜?；?Fusariumoxysporiumf. sp．cucumerinumOwen)，是影響黃瓜生產(chǎn)的最主要病害之一。病菌從幼根或傷口侵入，大量繁殖后，堵塞黃瓜木質(zhì)部導(dǎo)管，阻礙水分沿著導(dǎo)管向地上部運輸，使植株迅速萎蔫且病勢發(fā)展迅速，很難控制。我國流行的菌系為生理小種4號[1]，常年發(fā)病率10%～30%，重病年份可達80%～90%[2]，使黃瓜大幅減產(chǎn)，嚴(yán)重影響了黃瓜生產(chǎn)，損失達幾百億美元[3]。

黃瓜枯萎病作為常見且危害最為嚴(yán)重的蔬菜真菌病害，其有效防治是目前設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中的難題[4]。目前對黃瓜枯萎病的防治主要是化學(xué)方法，但防治效果不佳，且易造成環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留等問題。利用拮抗菌防治黃瓜枯萎病日益受到國內(nèi)外重視[5,6]。生防菌的誘導(dǎo)抗性只是眾多生防機制的一個方面，它和其它防病促生機制諸如抗生作用、重寄生作用、競爭作用以及植物生長促進等具有協(xié)同增效作用，加之具有廣譜、非特異性的優(yōu)點，可在植物病蟲害綜合防治中發(fā)揮重要作用，為植物病害生物防治提供了一種新思路。王偉等[7]用木霉菌測番茄枯萎病的防治效果為63.58%～74.26%，過氧化物酶(POD)活性提高了30%，超氧化物歧化酶(SOD)活性提高28%，PAL(苯丙氨酸解氨酶)活性提高35%。李晶等[8]在黃瓜根圍土中分離得到1株枯草芽孢桿菌菌株B29，對黃瓜枯萎病的防效高達84.9%，PAL酶活性提高38%，POD為對照酶活的1.6倍。陳淼[9～11]研究表明，枯草芽孢桿菌B579菌株對黃瓜枯萎病的防治效果可達73.6%，POD酶活性提高40%，SOD酶活性提高25%。因此，筆者用木霉菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌、枯草芽孢桿菌和粉紅粘帚霉對黃瓜枯萎病進行生物活性及其對黃瓜體內(nèi)防御酶活性生物誘導(dǎo)活性的測定，以期篩選出對黃瓜枯萎病有較高防效的生防菌，并明確其對黃瓜的誘導(dǎo)抗性機理。

1 材料與方法

1.1 生防菌

棘孢木霉(Trichodemaasperellum)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，粉紅粉紅粘帚霉菌(Gliocladiumroseum)，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)，均由河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院蔬菜病害生物防治課題組提供。

1.2 供試病原菌

尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(Fusaruim oxyporiumf.sp. cucumerinum)，由河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院蔬菜病害生物防治課題組提供。

1.3 黃瓜品種

中農(nóng)6號，引自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所。

1.4 病原菌的培養(yǎng)

將尖孢鐮刀菌黃瓜專化型(F. oxyporium)用無菌水制成孢子懸浮液后加入馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PD)中，28 ℃ 120r/min震蕩培養(yǎng)7d，濾液用雙層紗布過濾，除去菌絲，將濾液經(jīng)5 000r/min離心10min，其沉淀加適量無菌水稀釋成孢子數(shù)為1×106個/mL的孢子懸浮液。

1.5 生防菌劑接種方法

將黃瓜種子經(jīng)溫湯浸種催芽后播種于10cm的營養(yǎng)缽中，每盆2粒種子。當(dāng)黃瓜苗長到2～3個真葉時，按表1所述的濃度和方法向黃瓜苗根際注射棘孢木霉和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌孢子懸浮液108cfu/mL，每株接入3mL孢子懸浮液。根據(jù)苗土的量將枯草芽孢桿菌和粉紅粘帚霉稀釋成300倍拌土使用，并設(shè)清水對照和空白對照。3d后接入尖孢鐮刀菌孢子懸浮液106cfu/mL，接種前用小刀破壞根系，每株接入3mL孢子懸浮液作為清水對照。25d后調(diào)查病情指數(shù)并計算相對防治效果。

表1 生防菌的接種方法和濃度

黃瓜枯萎病病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)為：

0級——健株，長勢良好，無病癥。

1級——病株葉片自下而上逐漸萎蔫，死缺水狀，中午更為明顯，早晚上能恢復(fù)。

2級——病株葉片萎蔫，仍為綠色，不能再恢復(fù)正常。

3級——整株葉片呈褐色枯萎下垂，不能再恢復(fù)正常，葉片干枯至整株死亡。

1.6 生防菌對黃瓜的誘導(dǎo)抗性測定

1.6.1 酶液的提取 于開花期(9～10葉)采集樣品，取黃瓜葉片用自來水快速沖洗后，用濾紙吸干，每個樣品稱取相應(yīng)的質(zhì)量，裝入自封袋，放入-70 ℃超低溫冰箱中保存。每個處理3次重復(fù)取樣。

1.6.2 葉綠素含量測定 黃瓜葉片用體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇與體積分?jǐn)?shù)為0.80的丙酮按體積比1∶1的混合液浸泡，直至葉色完全變白即可在663，645 nm下比色[12]。

1.6.3 防御酶活性測定 采用馬峙英方法[13]測定過氧化物酶(POD)活性，以每分鐘OD450值改變0.1的酶用量為一個酶活單位；采用林植芳[14]的方法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性，以每分鐘抑制氮藍四唑(NBT)50%的酶用量為一個酶活單位；采用王敬文等[15]的方法測定苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性，以每分鐘OD290值改變0.01的酶用量為一個酶活單位；參考潘汝謙等[16]的方法測定過氧化氫酶(CAT)活性，以每分鐘OD值減少0.01的酶用量為一個酶活單位；蛋白質(zhì)含量測定采用Brandford考馬斯亮蘭G-250法[17]，酶的比活性以每毫克蛋白所含的酶單位數(shù)(Uprotein)。

表2 生防菌對黃瓜枯萎病的生防效果

注：同列不同字母表示經(jīng)LSD法檢驗在0.05水平差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 生防菌對黃瓜枯萎病的生防效果

棘孢木霉、枯草芽孢桿菌、粉紅粘帚霉和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌對黃瓜枯萎病的防效分別為70.24%，53.57%，64.29%，50.0%(表2)。

2.2 生防菌對黃瓜防御酶活性的影響

2.2.1 施用不同生防菌后黃瓜葉片葉綠素的變化 經(jīng)枯草芽孢桿菌、粉紅粘帚霉、棘孢木霉和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌處理后，黃瓜葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)比空白對照處理的低，分別是空白對照處理的73.82%，61.80%，74.68%，93.13%(圖1)；而經(jīng)枯草芽孢桿菌、粉紅粘帚霉、棘孢木霉菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌處理后的黃瓜葉片葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)均比清水對照處理的高，分別是清水對照處理的1.77倍、1.48倍、1.79倍和2.23倍；經(jīng)棘孢木霉菌和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌處理的黃瓜葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是經(jīng)粉紅粘帚霉處理的1.21倍和1.51倍。2.2.2 經(jīng)不同生防菌處理后黃瓜葉片POD的變化 經(jīng)粉紅粘帚霉、枯草芽孢桿菌和棘孢木霉處理的黃瓜葉片POD活性稍高于空白對照處理的，分別是空白對照處理的1.26倍、1.11倍和1.40倍(圖2)；而經(jīng)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌處理的黃瓜葉片POD僅為空白對照處理的39.61%；經(jīng)粉紅粘帚霉、枯草芽孢桿菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌和棘孢木霉菌處理的黃瓜葉片POD活性分別僅為清水對照處理的49.98%，44.01%，15.77%，55.57%。

圖1 生防菌對黃瓜葉片葉綠素含量的影響 圖2 生防菌對黃瓜葉片POD活性的影響

2.2.3 經(jīng)不同生防菌處理的黃瓜葉片SOD的變化 經(jīng)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌和棘孢木霉處理的黃瓜葉片SOD活性高于空白對照，分別是空白對照的3.92倍和2.66倍(圖3)；經(jīng)粉紅粘帚霉、枯草芽孢桿菌和處理的黃瓜葉片SOD活性低于清水對照的，分別僅為經(jīng)清水對照的63.92%和60.46%。

2.2.4 經(jīng)不同生防菌處理的黃瓜葉片PAL的變化 經(jīng)粉紅粘帚霉、枯草芽孢桿菌、棘孢木霉和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌等4種生防菌處理的黃瓜葉片PAL活性分別僅為空白對照處理的43.01%，69.11%，33.81%，34.70%。經(jīng)粉紅粘帚霉和枯草芽孢桿菌處理的黃瓜葉片PAL活性高于清水對照處理的，分別是清水對照處理的1.06倍和1.70倍(圖4)。

圖3 生防菌對黃瓜葉片SOD活性的影響 圖4 生防菌對黃瓜葉片PAL活性的影響

2.2.5 經(jīng)不同生防菌處理的黃瓜葉片CAT的變化 經(jīng)枯草芽孢桿菌、粉紅粘帚霉、棘孢木霉和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌等4種生防菌處理的黃瓜葉片CAT活性均高于空白對照，分別是空白對照的1.04倍、1.88倍、1.07倍和1.07倍(圖5)；4種生防菌處理的黃瓜葉片CAT活性均低于清水對照的，僅為清水對照的53.13%，96.29%，54.59%，54.72%；枯草芽孢桿菌、棘孢木霉和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌處理的黃瓜葉片CAT活性僅為粉紅粘帚霉處理的55.17%，56.68%，56.82%(圖5)。

2.2.6 經(jīng)不同生防菌處理的黃瓜蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化 經(jīng)枯草芽孢桿菌、粉紅粘帚霉、棘孢木霉和嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌處理的黃瓜蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于空白對照處理的，分別是空白對照的1.69倍、2.72倍、4.46倍、4.03倍；經(jīng)粉紅粘帚霉和枯草芽孢桿菌處理的黃瓜蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別僅是清水對照處理的67.52%和42.04%；棘孢木霉菌處理的黃瓜蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)是清水對照處理的1.11倍；經(jīng)嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌和棘孢木霉菌處理的黃瓜蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別是經(jīng)粉紅粘帚霉、枯草芽孢桿菌處理的1.48倍、2.38倍和1.64倍、2.64倍。4種生防菌對黃瓜蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響由大到小的順序為：棘孢木霉菌，嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，粉紅粘帚霉，枯草芽孢桿菌(圖6)。

圖5 生防菌對黃瓜葉片CAT活性的影響 圖6 生防菌對黃瓜葉片蛋白質(zhì)活性的影響

3 結(jié)論與討論

本次研究測定了粉紅粘帚霉、枯草芽孢桿菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌和棘孢木霉等4種生防菌對黃瓜枯萎病的生防作用，并初步研究了4種生防菌對黃瓜體內(nèi)不要防御酶活性的影響，其中以棘孢木霉對黃瓜枯萎病防效最高，達到70.24%，顯著高于其他3種生防菌的防治效果。棘孢木霉防治黃瓜枯萎病后能夠刺激黃瓜葉片內(nèi)的POD，SOD，CAT酶的活性，但PAL酶活性呈現(xiàn)降低趨勢。賀字典等[16]施用棘孢木霉56 d后對黃瓜枯萎病的防治效果為64.29%～76.81%。大量研究表明，棘孢木霉對真菌的防治主要是其重寄生、抗生及競爭作用[17]，尤其對土傳病原真菌具有顯著的拮抗作用[18]。木質(zhì)化是作物對鐮刀菌的一個重要抗病反應(yīng)，而這些抗病反應(yīng)需要酶的催化才能實現(xiàn)，過氧化物酶(POD)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)在細胞壁木質(zhì)化過程中起著非常重要的作用。木質(zhì)素的合成使細胞壁增厚，形成木質(zhì)化的防御壁，從而抵御病原菌侵入。但不同的生防菌激發(fā)酶的種類可能不同，所以，就某一病害來說，今后明確病原菌侵染時植物體內(nèi)各種酶的變化動態(tài)、機制及其相關(guān)性是進行抗性誘導(dǎo)研究的基礎(chǔ)[19]。了解生防菌的防病機理，解決從實驗室走向田間的復(fù)雜過程，將在今后持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。

[1] 楊玉新,王純立,謝志剛,等.微生物肥對土壤微生物種群數(shù)量的影響[J].新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,45(S1):169-171.

[2] 張樹生.微生物有機肥緩解黃瓜枯萎病的生物學(xué)效應(yīng)及其作用機制[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.

[3] 李晶,楊謙,張淑梅,等.枯草芽孢桿菌B29菌株防治黃瓜枯萎病的田間效果及安全性評價初報[J].中國蔬菜,2009(2):30-33.

[4] Nobuyo Koike, Mitsuro Hyakumachi，Koji Kageyama，et al.Induction of systemic resistance in cucumber against several diseases by plant growthpromoting fungi lignifications and superoxide generation[J].European Journal of Plant Pathology, 2001,107(2):523-533.

[5] 潘彥彪,田永強,張阿強,等.5種精油和多抗霉素對黃瓜枯萎病原菌抑菌活性的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(15):117-120,158.

[6] 高玉亮,繆作清,孫漫紅,等.延邊地區(qū)抑制黃瓜枯萎病菌土壤放線菌的調(diào)查研究[J].延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)學(xué)報,2015,37(4)：321-325,339.

[7] 王偉,趙謙,楊微.木霉對土傳病原尖孢鐮刀菌的拮抗作用[J].中國生物防治，1997(1):46-47.

[8] 周魏,彭霞薇,李寶聚,等.綠色木霉菌糠發(fā)酵物對常見黃瓜土傳病害的防治[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué).2012(14):78-81.

[9] 賀字典,高玉峰.生防菌在植物病害防治中的研究進展(綜述)[J].河北職業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報,2003,17(2):56-59.

[10] 王晶.深綠木霉REMI突變菌株H6對黃瓜枯萎病的生物防治[D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[11] 李淼,產(chǎn)祝龍,檀根甲,等.木霉菌防治植物真菌病害研究進展[J].生物技術(shù)通訊,2009,20(2):286-290.

[12] 馬峙英,劉叔倩,王省芬,等.過氧化物酶同工酶與棉花黃萎病抗性的相關(guān)研究[J].作物學(xué)報,2000,26(4):431-437.

[13] 林植芳,李雙順,林桂株,等.水稻葉片的衰老與超氧物歧化酶及脂質(zhì)過氧化作用的關(guān)系[J].植物學(xué)報,1984,26(6):605-615.

[14] 王敬文,薛應(yīng)龍.植物苯丙氨酸解氨酶研究 Ⅲ.玉米小斑病菌HelminthosporiummaydisT小種和大斑病菌Helminthosporiumturcicum毒素對苯丙氨酸解氨酶(PAL)的刺激作用[J].植物生理學(xué)報,1982,8(3):237-244.

[15] 潘汝謙,黃旭明,古希昕.活性氧清除酶類在黃瓜感染霜霉病過程中的活性變化[J].植物病理學(xué)報,1999,29(3):287-288.

[16] 賀字典,宋士清,高玉峰,等.棘孢木霉Trichoderma asperellum在土壤中定殖量的熒光定量PCR檢測[J].植物保護學(xué)報,2016,43(4):552 -558.

[17] 魏岳榮,黃秉智，楊護，等.香蕉鐮刀菌枯萎病研究進展[J].果樹學(xué)報,2005,22(2):154-159．

[18] 游春平,劉任,肖愛萍,等.香蕉苗經(jīng)生防菌處理后體內(nèi)抗病性相關(guān)酶的變化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008,36(9):3 524-3 525．

[19] 翟彩霞,馬春紅,秦君,等.植物誘導(dǎo)抗病性的常規(guī)鑒定——相關(guān)酶活性變化與誘導(dǎo)抗病性的關(guān)系[J].中國農(nóng)學(xué)通報,2004,20(5):222-224．

(責(zé)任編輯：朱寶昌)

Efficacy of Biocontrol Agents to CucumberFusariumwiltand Their Induced Resistance

LI Shuqiang1, LI Linhui1, SHEN Jiangjie2, JING Huan3, ZHANG Mingzhu2, DU Xiaoduan2, LU Guoyan2

(1 Farm Career Development Center of Hebei Province, Shijiazhuang Hebei, 050021; 2 Hebei Normal University of Science & Technology; 3 Xiling Manchu Junior School of Yixian County; China)

Four biocontrol agents, includingBacillussubtilis,Gliocladiumroseum,TrichodemaasperellumandStenotrophomonasmaltophiliawere used to prevent from cucumberFusariumwilt, and the defense enzyme activities including PAL, SOD, CAT and POD in the cucumber leaves were studied in the paper. The results showed thatT.asperellumwas the best agent to cucumberFusariumwiltand the preventative efficacy could reach as high as 70.24%. POD activities in the cucumber leaves caused byB.subtilis,G.roseumandT.asperellumwere 1.26 times,1.11 times and 1.40 times as blank control, respectively. SOD activities activated byS.maltophiliaandT.asperellumwere 3.92 times and 2.66 times than that caused control. CAT activities were 1.04 times,1.88 times,1.07 times and 1.07 times as blank control. However, PAL activities incited by 4 biocontrol agents in the cucumber leaves were 43.01%, 69.11%, 33.81% and 34.70% as many as that of the control. Therefore, it was concluded that biocontrol agents could induce some defense enzyme activities in some degrees.

biocontrol agent; cucumberfusariumwilt; efficacy; defense enzyme activity

10.3969/J.ISSN.1672-7983.2017.01.011

河北省科技支撐農(nóng)業(yè)關(guān)鍵共性技術(shù)攻關(guān)專項(項目編號：17226914D)；秦皇島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院項目(項目編號：2014-21)；秦皇島市科技支撐計劃項目(項目編號：201402B028)；2016年河北省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(項目編號：2016-11)。

2017-01-10

S436.421.1+3

A

1672-7983(2017)01-0053-06

李書強(1970-)，男，碩士研究生。主要研究方向：植物病害生物防治。