張志畢,張 媛,于浩飛,胡煒彥,張?zhí)m春,楊 暉,*,張榮平,,*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究中心,云南昆明 650500;2.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室,云南昆明 650500;3.昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部,云南昆明 650500)

余甘子提取物對小鼠急性酒精肝損傷的保護(hù)作用研究

張志畢1,張 媛1,于浩飛2,胡煒彥2,張?zhí)m春3,楊 暉1,*,張榮平1,2,*

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程研究中心,云南昆明 650500;2.昆明醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室,云南昆明 650500;3.昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部,云南昆明 650500)

研究余甘子提取物(extractum phyllanthus emblica,EPE)對小鼠急性酒精肝損傷的預(yù)防保護(hù)作用和機(jī)制。方法:60只雄性小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、藥物對照組(美他多辛膠囊-欣立得,200 mg/kg·d)和EPE高、中、低劑量組(400、160、80 mg/kg·d),灌胃給藥30 d,末次給藥后1 h灌胃56%乙醇造急性酒精肝損傷模型。12 h后檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)濃度,檢測肝臟丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、乙醇脫氫酶(ADH)含量,實時熒光定量PCR(real time PCR)檢測肝臟脂肪酸合成酶(FAS)、脂肪分化相關(guān)蛋白(ADRP)、細(xì)胞色素P450 2E1(CYP2E1)、過氧化酶體增殖激活α受體(PPARα)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)mRNA的表達(dá),HE染色觀察肝臟組織病理變化。結(jié)果表明:EPE能顯著降低小鼠血清ALT、AST、TG濃度,減輕肝臟病理損傷;EPE顯著提高肝臟乙醇代謝酶ADH、CAT活性,下調(diào)CYP2E1 mRNA表達(dá)水平,縮短小鼠醒酒時間;EPE顯著下調(diào)脂肪酸合成酶FAS和轉(zhuǎn)運(yùn)酶ADRP基因表達(dá),抑制脂肪酸合成和向肝臟轉(zhuǎn)運(yùn);EPE顯著提高肝臟抗氧化酶SOD、GSH-Px活性,降低MDA濃度,發(fā)揮抗氧化活性保護(hù)肝臟損傷;EPE顯著降低炎性因子TNF-α和IL-6濃度,減輕肝臟炎癥損傷,但對IL-10濃度沒有顯著影響;EPE顯著下調(diào)Casepase3基因表達(dá),降低肝臟細(xì)胞凋亡水平;EPE顯著上調(diào)PPARα基因表達(dá)來減輕肝臟氧化和炎癥損傷。結(jié)論:EPE通過乙醇代謝酶活性調(diào)節(jié)、脂代謝調(diào)控、抗氧化損傷、抗炎和抗細(xì)胞凋亡來保護(hù)小鼠急性酒精肝損傷,具有開發(fā)為解酒護(hù)肝保健食品的前景。

余甘子,急性酒精肝,氧化損傷,炎癥,脂代謝

酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是由于長期大量飲酒所致的肝臟損傷性疾病,我國近年來酒精性肝病發(fā)病率逐年上升,是導(dǎo)致肝病的第二大因素[1-3]。研究表明長期過量飲酒會引起肝臟、腸胃、心血管、內(nèi)分泌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)等人體重要器官損傷,其中酒精代謝誘發(fā)的氧化應(yīng)激、炎癥等是酒精性肝病發(fā)病的主要原因[4]。

余甘子(PhyllanthusemblicaL.),又名滇橄欖、庵摩勒、油甘子等,系大戟科葉下珠屬落葉小喬木的果實[5],產(chǎn)于我國南方各省和東南亞、南亞等地[6]。余甘子中富含超氧化物歧化酶[7]、維C、多酚類物質(zhì)及多糖等活性物質(zhì)[8-9],除了具有強(qiáng)烈的抗氧化活性[10-11]外,還具有抗炎癥[12]、抗流感[13]、抗高血壓、抗腫瘤、護(hù)肝等功效[14],在滇西民間,有用余甘子泡酒的傳統(tǒng),認(rèn)為其有解酒護(hù)肝的功效?；谇叭说难芯炕A(chǔ),本研究用小鼠急性酒精肝損傷模型研究余甘子對急性酒精肝損傷的保護(hù)作用,并從乙醇代謝、脂代謝、氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡幾個方面來探討其作用機(jī)制,為余甘子解酒護(hù)肝的機(jī)制研究提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

余甘子精粉(主要成分為多酚,含量40%) 西安維特生物科技有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)流程:余甘子原料水提→濃縮→浸膏→噴霧干燥→粉碎→包裝。美他多辛膠囊-欣立得(批號:141201) 浙江震元制藥有限公司。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒(批號:20151209)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒(批號:20151210)、甘油三脂(TG)試劑盒(批號:20151209)、丙二醛(MDA)試劑盒(批號:20151201)、過氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號:20151205)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(批號:20151130)、乙醇脫氫酶(ADH)試劑盒(批號:20151215)、過氧化氫(CAT)試劑盒(批號:20160913) 南京建成生物工程研究所;Mouse TNF-α試劑盒(批號:228260134)、Mouse IL-6試劑盒(批號:220241234)、Mouse IL-10試劑盒(批號:220362143) 杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司;AxyPrep總RNA制備試劑盒,(批號:12113KD1) 美國Axygen公司;RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit,(批號:00310953) 美國Thermo Scientific公司;TAKARA熒光定量試劑盒,(批號:AK8603)寶生物工程有限公司。

ICR小鼠,雄性,昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(滇):2015-0004。

Synergy2多功能酶標(biāo)儀 美國BIOTEK;Centrifuge5804R冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf;CHB-100恒溫金屬浴 杭州博日科技有限公司;ND-1000核酸蛋白檢測儀 美國BDT;顯微鏡、切片機(jī)、EG1160包埋機(jī) 德國Leica;QuantStudioTM 6 Flex實時熒光定量PCR儀 美國Thermo Fisher。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥、造模、取樣 成年ICR小鼠60只,體質(zhì)量(20±2) g,飼養(yǎng)條件:室溫(20±2) ℃,相對濕度(60%～70%)。適應(yīng)飼養(yǎng)1周后按體質(zhì)量隨機(jī)分為6組,每組10只,分別為:空白組、模型組、藥物組(欣立得,200 mg/kg·d)、EPE各劑量組(EPE,80、160、400 mg/kg·d)。EPE和欣立得溶于0.5%羧甲基纖維素鈉,每天按劑量灌胃1次,共給藥30d,空白組和模型組每天灌胃等劑量溶劑。末次給藥后1 h,按參考文獻(xiàn)[15],除空白組外按13 mL/kg 一次性灌胃56%乙醇,禁食不禁水飼養(yǎng),12 h后眼球取血,脫臼處死小鼠后取肝臟-80 ℃保存。

1.2.2 小鼠醉酒和醒酒時間記錄 醉酒指標(biāo):翻正反射消失,小鼠背部向下保持30 s以上;醒酒指標(biāo):翻正反射恢復(fù),小鼠活動自如,靈活。醉酒時間=翻正反射消失時間-給酒時間;醒酒時間:翻正反射恢復(fù)時間-翻正反射消失時間[16]。

1.2.3 病理學(xué)組織觀察 取肝右葉,4%甲醛溶液固定,經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片,常規(guī)HE染色,顯微鏡40倍物鏡觀察肝臟組織病理改變。

1.2.4 血清ALT、AST、TG、TNF-α、IL-6、IL-10含量檢測 血樣室溫放置20 min后3500 r/min 4 ℃離心10 min,取血清,按試劑盒操作說明檢測ALT、AST、TG、TNF-α、IL-6、IL-10含量。

表1 目的基因的引物序列

表2 EPE對小鼠血清ALT、AST、TG含量的影響(x±s,n=10)

1.2.5 肝臟MDA、SOD、GSH-Px、ADH、CAT含量測定 取小鼠肝臟左葉約0.10 g加入生理鹽水制成10%肝組織勻漿,3500 r/min 4 ℃離心,取上清,按照試劑盒操作說明檢測MDA、SOD、GSH-Px、ADH、CAT含量。

注：與空白組比較:*p<0.05；**p<0.01;與模型組比較:#p<0.05；##p<0.01,表3同。

1.2.6 Real time PCR檢測肝臟FAS、ADRP、CYP2E1、PPARα、Caspase3基因表達(dá) 每組隨機(jī)選4只小鼠,取小鼠左葉肝臟約30 mg,根據(jù)RNA提取試劑盒操作說明提取RNA,檢測RNA濃度和純度,通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,-80 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫相關(guān)基因CDs序列設(shè)計引物,并進(jìn)行Blast檢索確定引物的特異性,引物序列如表1所示。Real time PCR檢測相關(guān)基因表達(dá),反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環(huán),反應(yīng)體系20 μL。以β-actin為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCt法[17]計算基因表達(dá)的相對變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 EPE對小鼠急性酒精肝損傷保護(hù)作用

由表2和圖1B可知,與空白組相比,模型組小鼠血清中ALT、AST、TG含量均極顯著升高(p<0.01),肝臟細(xì)胞腫大,細(xì)胞界限模糊,包漿成空泡狀,表明肝組織脂滴較多,肝細(xì)胞完整性被破壞,存在嚴(yán)重脂肪變性,表明小鼠急性酒精肝模型建立成功。

與模型組相比,欣立得對急性酒精肝損傷起良好的保護(hù)作用,極顯著降低血清中ALT、AST、TG含量(p<0.01);EPE高、中、低劑量組對急性酒精肝損傷也具有一定的預(yù)防作用,能顯著降低血清中ALT、AST、TG濃度(p<0.01,p<0.05),各劑量組對ALT和TG的影響呈劑量關(guān)系,對AST影響無顯著差異。

病理切片顯示,空白組(圖1A)小鼠肝臟細(xì)胞形態(tài)正常完整,肝組織結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞索排列整齊,肝細(xì)胞內(nèi)無脂肪變性。欣立得組(圖1C)和EPE高、中、低劑量組(圖1D、圖1E、圖1F)肝細(xì)胞腫脹程度較模型組減輕,組織結(jié)構(gòu)清晰,肝臟細(xì)胞完整,胞漿內(nèi)空泡減少,脂肪變性程度得到緩解,EPE高劑量組護(hù)肝效果較中、低劑量組更明顯。結(jié)果表明EPE對肝臟脂肪變性具有改善作用。

圖1 EPE對急性酒精肝損傷 小鼠肝臟組織病理學(xué)影響(HE,×400)Fig.1 Efect of EPE on acute alcohol-induced liver tissue lesions(HE,×400)注：A.空白組;B.模型組;C.欣立得; D.EPE-高;E.EPE-中;F.EPE-低。

2.2 EPE對小鼠乙醇代謝的影響

由表3可知,各組小鼠醉酒時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05),結(jié)果表明余甘子并不能調(diào)節(jié)對酒精的吸收和酒精麻痹神經(jīng)中樞過程。與模型組比較,EPE高、中、低劑量組能顯著縮短醒酒時間(p<0.05),但無劑量關(guān)系;欣立得組能極顯著縮短小鼠醒酒時間(p<0.01)。乙醇進(jìn)入體內(nèi)后由ADH、CAT和CYP2E1三套系統(tǒng)代謝。與空白組相比,模型組小鼠攝入乙醇后ADH 濃度極顯著增加(p<0.01),表明乙醇能對ADH的表達(dá)起正向調(diào)節(jié)作用。與模型組相比,欣立得能極顯著增加ADH濃度(p<0.01),EPE各劑量組能顯著增加ADH濃度(p<0.01、p<0.05),且呈劑量關(guān)系。乙醇濃度過高時,體內(nèi)需要借助CAT輔助乙醇代謝,結(jié)果表明,與空白組相比,模型組CAT活性極顯著下降(p<0.01)。乙醇底物濃度增加,輔助代謝酶CAT濃度應(yīng)該升高,但是CAT也是體內(nèi)重要的清除過氧化氫的酶,乙醇代謝時會產(chǎn)生大量的過氧化氫過,對肝臟組織進(jìn)行CAT活性檢測時,由于清除過氧化氫對CAT的消耗,所以用試劑盒檢測時表現(xiàn)為CAT活性下降,該結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致[18]。與模型組相比,EPE各劑量組能顯著提高CAT活性(p<0.01、p<0.05),呈劑量關(guān)系,欣立得對CAT活性無顯著影響。CYP2E1也是乙醇代謝的重要基因,但其代謝通路會產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化損傷,由圖2可知,與空白組相比,模型組CYP2E1表達(dá)極顯著增加(p<0.01),表明乙醇的攝入激活了CYP2E1的表達(dá),這與前人的研究結(jié)果一致[14]。與模型組比較,欣立得能顯著降低CYP2E1的表達(dá)(p<0.05),EPE劑量組都能極顯著降低CYP2E1的表達(dá)(p<0.01),EPE各劑量組之間無差異,表明EPE不會通過上調(diào)CYP2E1表達(dá)來提高乙醇代謝速率,反而下調(diào)其表達(dá)水平,減輕由其介導(dǎo)的乙醇代謝毒性。

表3 EPE對小鼠醉酒和醒酒時間、肝臟ADH和CAT活性的影響(x±s,n=10)

圖2 EPE對CYP2E1基因 mRNA表達(dá)的影響(n=4)Fig.2 Effect of EPE on the expression of CYP2E1 mRNA(n=4)

2.3 EPE對肝臟中脂肪代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

FAS是脂肪酸合成的關(guān)鍵酶,ADRP介導(dǎo)血漿中游離脂肪酸向肝細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移[19-20],二者過表達(dá)時能加速脂肪酸的合成和刺激肝臟細(xì)胞吸收脂肪酸并合成TG,導(dǎo)致脂肪肝的發(fā)生。由圖2可知,與空白組相比,模型組小鼠肝臟中FAS和ADRP基因表達(dá)都極顯著增加(p<0.01),與模型組相比,EPE高劑量能顯著降低FAS和ADRP基因的表達(dá)(p<0.05、p<0.01),EPE中劑量能顯著降低ADRP基因表達(dá)(p<0.05),欣立得對FAS和ADRP的表達(dá)沒有顯著影響(p>0.05)。結(jié)果可知,EPE(高劑量)通過降低脂肪酸合成酶FAS和轉(zhuǎn)移酶ADRP(高、中劑量)的表達(dá),減輕肝臟細(xì)胞中脂肪酸濃度,從而降低肝臟TG的含量,減輕急性酒精肝損傷。

圖3 EPE對肝臟FAS和ADRP 基因mRNA表達(dá)的影響(n=4)Fig.3 Effect of EPE on the expression of hepatic FAS and ADRP mRNA(n=4)

2.4 EPE對肝臟氧化應(yīng)激保護(hù)作用

MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)鏈?zhǔn)浇K止階段產(chǎn)生的小分子產(chǎn)物,其含量可以間接反應(yīng)自由基的產(chǎn)生情況和機(jī)體過氧化程度[21]。由表4可知,與空白組比較,模型組小鼠肝臟組織中MDA含量升高,表明小鼠體內(nèi)過氧化程度較高;SOD和GSH-Px含量極顯著降低(p<0.01),表明乙醇導(dǎo)致小鼠肝臟組織存在嚴(yán)重的氧化損傷,消耗了氧化損傷保護(hù)酶SOD和GSH-Px,細(xì)胞抵御氧化損傷能力下降。與模型組比較,欣立得組MDA極顯著降低(p<0.01),SOD和GSH-Px顯著升高(p<0.05、(p<0.01));EPE高、中、低劑量組MDA濃度極顯著降低(p<0.01),SOD和GSH-Px極顯著升高(p<0.01),各劑量組無劑量關(guān)系。結(jié)果表明,EPE通過抗氧化損傷保護(hù)小鼠急性酒精肝損傷,降低了肝臟氧化應(yīng)激水平。

表4 EPE對小鼠肝臟SOD、GSH-Px和MDA含量的影響(x±s,n=10)

表5 EPE對小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-10含量的影響(x±s,n=10)

2.5 EPE抗炎護(hù)肝作用

酒精刺激肝臟kupffer細(xì)胞,激活NF-κB信號通路,NF-κB激活后刺激致炎因子TNF-α大量表達(dá),導(dǎo)致炎癥發(fā)生。kupffer細(xì)胞功能受損,血液中內(nèi)毒素含量上升,刺激單核細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞過量分泌IL-6,引起肝細(xì)胞變性、壞死和纖維增生等。IL-10是一種與Th2免疫應(yīng)答有關(guān)密切的細(xì)胞因子,也是一種重要的免疫抑制性因子,可抑制Th2細(xì)胞增殖及Th1細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答[22]。由表5可知,與空白組相比,模型組小鼠血清致炎因子TNF-α和IL-6濃度極顯著升高(p<0.01),而抗炎因子IL-10濃度極顯著下降,表明小鼠體內(nèi)存在著炎癥損傷。與模型組相比,欣立得能顯著降低致炎因子TNF-α和IL-6(p<0.05,p<0.01),EPE高、低劑量組能顯著降低TNF-α濃度(p<0.05,p<0.01),EPE各劑量組能顯著降低IL-6濃度(p<0.01,p<0.05),但無劑量關(guān)系,表明小鼠服用欣立得和EPE能通過降低致炎因子TNF-α和IL-6的濃度,降低炎癥損傷。欣立得和EPE對抗炎因子IL-10的濃度無顯著影響(p>0.05),表明EPE和欣立得緩解抗炎作用并不是通過提高抗炎因子IL-10來調(diào)控的,可能是通過其它因素來調(diào)節(jié),如氧化應(yīng)激,乙醇細(xì)胞毒性等。

2.6 EPE抗細(xì)胞凋亡作用

酒精對肝細(xì)胞的毒性作用會誘發(fā)細(xì)胞凋亡,Caspase3是細(xì)胞凋亡通路中重要的蛋白酶,Caspase3的激活是細(xì)胞遭受各種損傷后凋亡發(fā)生的最終共同通路[23]。由圖4可知,與空白組相比,模型組小鼠肝臟中Caspase3基因mRNA表達(dá)顯著增加(p<0.05)。與模型組相比,欣立得能顯著下調(diào)Caspase3基因表達(dá)(p<0.05),EPE高劑量能顯著降低Caspase3基因的表達(dá)(p<0.05),降低肝臟細(xì)胞凋亡水平,EPE中劑量和低劑量對Caspase3表達(dá)無顯著影響(p>0.05)。

圖4 EPE對Caspase3基因mRNA表達(dá)的影響(n=4)Fig.4 Effect of EPE on the expression of Caspase3 mRNA(n=4)

2.7 EPE對PPARα基因mRNA表達(dá)的影響

乙醇會影響PPARα,而PPARα被抑制參與ALD的形成[24]。由圖5可知,與空白組相比,模型組PPARα表達(dá)顯著降低(p<0.05),與文獻(xiàn)報道一致[24]。與模型組相比,EPE高劑量組能顯著上調(diào)PPARα表達(dá)(p<0.05),而欣立得和EPE中、低劑量組對PPARα的表達(dá)無顯著影響((p>0.05)。

圖5 EPE對肝臟PPARα基因mRNA表達(dá)的影響(n=4)Fig.5 Effect of EPE on the expression of hepatic PPARα mRNA(n=4)

3 討論

人體攝入的酒精約90%都是在肝臟內(nèi)分解代謝,酒精在肝臟內(nèi)被乙醇脫氫酶(ADH)、細(xì)胞色素P4502E1(CYP2E1)和過氧化氫酶(CAT)三套代謝系統(tǒng)氧化為乙醛,然后在線粒體中通過乙醛脫氫酶將乙醛催化為乙酸,乙酸以乙酰CoA進(jìn)入三羧酸循環(huán)代謝,分解為H2O和CO2[25],酒精代謝酶檢測對評價機(jī)體對酒精代謝功能具有重要的意義。當(dāng)人體長期或大量飲酒時,酒精代謝過程中產(chǎn)生的乙醛影響三羧酸循環(huán)的正常進(jìn)行,使脂肪酸β氧化受阻,體內(nèi)脂肪酸來源增加,脂肪酸向肝臟轉(zhuǎn)運(yùn)積累,最終導(dǎo)致肝臟脂肪性病變[19]。ALD的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜,目前廣泛接受的是“二次打擊學(xué)說”,該學(xué)說認(rèn)為ALD形成的起重要作用的因素有脂質(zhì)過氧化、氧化應(yīng)激和多種炎癥細(xì)胞因子的釋放等[26]。氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞線粒體功能受損,膜通透性增高,使線粒體細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入包漿,激活Caspase凋亡信號通路,最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。在肝臟細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥發(fā)生過程中,PPARα發(fā)揮著重要的作用,PPARα是一種磷酸化蛋白,能夠調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化,增強(qiáng)機(jī)體對胰島素的敏感性,抑制炎癥因子的生成以及炎癥的形成,參與調(diào)節(jié)脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá),其低表達(dá)會加劇炎癥和氧化應(yīng)激的發(fā)生,而乙醇攝入和CYP2E1激活會抑制PPARα的表達(dá)[24,28]。

本研究結(jié)果顯示,EPE能降低急性酒精肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶ALT、AST和TG濃度,減輕肝臟脂肪變性程度,對急性酒精肝損傷具有很好的保護(hù)作用。結(jié)合ALD的發(fā)病機(jī)制和EPE前期的研究基礎(chǔ),對EPE保護(hù)急性酒精肝損傷機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),首先,EPE通過提高肝臟乙醇代謝酶ADH、CAT活性,加速乙醇在小鼠體內(nèi)的分解,縮短小鼠醒酒時間,提高乙醇分解速率來減少酒精對肝臟的毒性作用時間可能是EPE對ALD的最初的保護(hù)機(jī)制;其次,EPE通過下調(diào)脂肪酸合成酶基因FAS和轉(zhuǎn)運(yùn)基因ADRP,使脂肪酸合成和向肝臟轉(zhuǎn)移的速率降低,這可能是EPE降低肝臟脂肪變性的機(jī)制之一;第三,氧化應(yīng)激損傷是ALD發(fā)生的主原因之一,EPE通過提高肝臟細(xì)胞抗氧化酶SOD和GSH-Px活性,降低急性酒精肝損傷小鼠肝臟氧化應(yīng)激水平,抗氧化作用可能是EPE保護(hù)肝臟的主要功效;第四,EPE通過減少致炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的釋放,減輕了肝臟炎癥損傷,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),EPE對氧化應(yīng)激和炎癥的調(diào)控作用與PPARα基因有關(guān),EPE通過上調(diào)PPARα基因的表達(dá),降低肝臟氧化應(yīng)激水平和抑制炎癥因子的釋放;最后,EPE高劑量組能下調(diào)Caspase3基因的表達(dá),降低肝臟組織的凋亡水平,保護(hù)肝臟細(xì)胞功能完整?？偟膩碚f,EPE通過抗氧化、抗炎和抗凋亡作用保護(hù)了肝臟細(xì)胞,肝臟細(xì)胞功能保持完整,有利于肝臟對乙醇及其代謝的有毒物質(zhì)的分解,降低細(xì)胞毒性。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,EPE能通過提高乙醇代謝酶活性,加速乙醇代謝,并通過脂代謝調(diào)控、抗氧化、抗炎癥、抗細(xì)胞凋亡和調(diào)控PPARα基因表達(dá)幾方面,減輕小鼠急性攝入過量酒精導(dǎo)致的肝損傷,發(fā)揮解酒和護(hù)肝的功效,具有開發(fā)為解酒護(hù)肝保健食品的潛能,但本實驗所用EPE為粗提物,其解酒護(hù)肝的有效成分和作用機(jī)制還需要更進(jìn)一步的研究。

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Protection and mechanism of extractumphyllanthusemblicaon acute alcohol-induced liver injury in mice

ZHANG Zhi-bi1,ZHANG Yuan1,YU Hao-fei2,HU Wei-yan2,ZHANG Lan-chun3,YANG Hui1,*,ZHANG Rong-ping1,2,*

(1.Biomedical Engineering Research Center,Kunming Medical University,Kunming 650500,China;2.School of Pharmaceutical Science & Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural Products,Kunming Medical University,Kunming 650500,China;3.Department of Laboratory Animal,Kunming Medical University,Kunming 650500,China)

To study the preventive protection effects and mechanisms of extractum phyllanthus emblica(EPE)on acute alcoholic liver injury in mice. 60 ICR male mice were randomly divided into 6 groups,including blank group,model group,medicine contrast group(Metadoxine Capsules,200 mg/kg·d),EPE group(80、160、400 mg/kg·d). Medication groups were given with EPE or Metadoxine Capsules respectively by intragastric administration for 30 days. Then,acute alcoholic liver injury model was established by intragastric administration of 56% alcohol(13 mg/kg)to the medication and model groups 1 h later after the last administration. 12 h later,the activities of serum ALT,AST,TG,TNF-α,LI-6,IL-10,the content of hepatic MDA,SOD,GSH-Px,ADH,the mRNA levels of FAS,ADRP,CYP2E1,PPARαand Caspase3 in liver were measured. HE staining was performed for observing pathological changes of the liver tissues. The results showed that EPE can significantly reduce the level of serum ALT,AST,TG and the liver pathological damage. EPE can significantly reduce the sober time by improving the activities of hepatic alcohol metabolism enzyme ADH,CAT,meanwhile EPE reduce CYP2E1 mRNA expression. EPE significantly suppress the synthesis and transport of fatty acid by inhibiting the expression of FAS and ADRP. EPE significantly increased the activities of SOD and GSH-Px,lower MDA concentration to protect liver injury by antioxidant activity. EPE significantly reduced the content of inflammatory factor TNF-αand IL-6 to relieve liver inflammatory lesions,but EPE had no significant effects on the IL-10 content. EPE significantly reduced the level of liver cell apoptosis by down regulating the expression of Caspase3. EPE significantly relieved liver oxidative damage and inflammatory lesions by up regulating the expression of PPARα. Conclusion:EPE by ethanol metabolic enzyme activity regulation,lipid metabolic control,resistance to oxidation damage,anti-inflammatory and anti cell apoptosis can protect acute alcoholic liver injury in mice. EPE has the prospect of development to avoid hangover and be liver protection health food.

Phyllanthusemblica;acute alcoholic liver;oxidative damage;inflammation;lipid metabolism

2016-08-26

張志畢(1986-)，男，碩士，助理實驗師，研究方向：天然藥物藥理，E-mail:zhang_zhibi@163.com。

*通訊作者:楊暉(1979-)，女，碩士，講師，研究方向：藥理學(xué)，E-mail:358900939@qq.com。 張榮平(1962-)，男，博士，教授，研究方向：天然藥物化學(xué)與藥理學(xué)，E-mail:zhrp@163.com。

云南省高校協(xié)同創(chuàng)新中心-南藥研究協(xié)同中心項目(NY2014002)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)05-0351-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.058