邱永秀，石 雷，劉永麗，陳曉芳，金琳琳，趙音羽

（臺州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)制藥研究所， 浙江 臺州 318000）

HPLC法測定依折麥布辛伐他汀納米粒中藥物含量及包封率

邱永秀，石 雷，劉永麗，陳曉芳，金琳琳，趙音羽

（臺州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 化學(xué)制藥研究所， 浙江 臺州 318000）

建立了高效液相色譜法測定依折麥布辛伐他汀固體脂質(zhì)納米粒中藥物含量及包封率。采用 Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，流動相為乙腈-0.025 mol/mL磷酸二氫鈉水溶液（pH4.50）梯度洗脫，流速1 mL/min，檢測波長分時段設(shè)置為234 nm或238 nm，柱溫35 ℃；進樣量20 μL；采用葡聚糖凝膠過濾法測定依折麥布辛伐他汀納米粒包封率。結(jié)果表明，依折麥布在2.090～45.978 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 8），平均回收率為98.79%（RSD=1.11%）；辛伐他汀在2.182～48.013 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 8），平均回收率為99.56%（RSD=0.70%）；納米粒膠體溶液中依折麥布的包封率為87.4%，辛伐他汀的包封率為83.1%。本方法簡便、高效、準確，可用于依折麥布辛伐他汀納米粒藥物含量及包封率的測定。

依折麥布；辛伐他汀；固體脂質(zhì)納米粒；含量測定；包封率；高效液相色譜法

依折麥布為膽固醇吸收選擇性抑制劑，作用于小腸黏膜 NPC1L1轉(zhuǎn)運蛋白，抑制膳食和膽汁中的膽固醇跨小腸轉(zhuǎn)運，降低總膽固醇和低密度脂蛋白[1,2]。辛伐他汀是一種 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，能夠抑制體內(nèi)膽固醇合成，使血漿中低密度脂蛋白和膽固醇濃度降低[3]。臨床研究表明，依折麥布與辛伐他汀聯(lián)合使用可對膽固醇吸收和合成產(chǎn)生雙重抑制，增強血漿中膽固醇和低密度脂蛋白調(diào)節(jié)效果，減少不良反應(yīng)發(fā)生；同時還有改善血管內(nèi)皮功能、抑制血栓形成等作用[4-6]。依折麥布與辛伐他汀均為難溶性藥物，口服不利于吸收，將兩種藥物制成復(fù)方固體脂質(zhì)納米粒，可提高藥物水溶性，促進藥物吸收[7]。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

依折麥布辛伐他汀固體脂質(zhì)納米粒膠體溶液（自制）；依折麥布對照品（湖北藝康源化工有限公司，含量 99.52%）；辛伐他汀對照品（浙江江北藥業(yè)有限公司，含量99.2%）；葡聚糖凝膠（臺州市四甲生化塑料廠，G50，100～200目）；乙腈為色譜純；甲醇、磷酸二氫鈉等均為分析純。

BSA224S型電子天平；UV-1801型紫外可見分光光度計；Agilent 1220型高效液相色譜儀；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；KQ-250B型超聲波清洗機。

1.2 檢測波長確定

取適量依折麥布、辛伐他汀，分別加乙腈溶解，制備得到濃度約為 10 μg/mL的依折麥布溶液和辛伐他汀溶液，用紫外分光光度計在200～400 nm內(nèi)進行掃描，結(jié)果見圖1。由圖1可知，依折麥布在234 nm處有最大吸收峰，辛伐他汀在238 nm處有最大吸收峰，故選擇234 nm作為依折麥布的檢測波長，238 nm作為辛伐他汀的檢測波長。

圖1 依折麥布和辛伐他汀UV掃描圖Fig.1 UV scanning figure of ezetimibe and simvastation

1.3 色譜條件[8]

色譜柱：Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A相為乙腈，B相為0.025 mol/mL磷酸二氫鈉水溶液（pH4.50）；梯度洗脫條件：0～11 min，A相維持50%，11～14 min，A相從50%線性改變至70%，14～24 min，A相維持70%，24～27 min，A相從70%線性改變至50%，27～35 min，A相維持50%；流速：1.0 mL/min；檢測波長：0～11 min，維持234 nm，11～24 min，維持238 nm，24～35 min，維持234 nm；柱溫：35℃；進樣量：20 μL。

1.4 溶液制備

1.4.1 對照品溶液

精密稱取依折麥布、辛伐他汀對照品適量，加流動相（A相和B相均為50%）溶解并稀釋定容至100 mL，搖勻，配制成依折麥布104.5 μg/mL、辛伐他汀109.1 μg/mL的混合對照品儲備液。

1.4.2 供試品溶液

取所制備的依折麥布辛伐他汀固體脂質(zhì)納米粒膠體溶液，精密吸取1.0 mL置10 mL容量瓶中，加無水甲醇稀釋至刻度，超聲10 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得依折麥布辛伐他汀固體脂質(zhì)納米粒破乳液。

1.4.3 空白納米粒溶液

取所制備的不加藥物的空白固體脂質(zhì)納米粒膠體溶液，按1.4.2節(jié)方法操作，即得空白固體脂質(zhì)納米粒破乳液。

1.5 葡聚糖凝膠過濾[9]

稱取葡聚糖凝膠（G50）2.5 g，純化水溶脹12 h以上，超聲脫氣，裝于凝膠柱中（柱直徑1 cm，柱高20 cm）。精密吸取依折麥布辛伐他汀固體脂質(zhì)納米粒膠體溶液 1.0 mL上柱，用脫氣后的純化水洗脫，流速1.0 mL/min，收集洗脫液18 mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，無水甲醇多次清洗旋蒸瓶，清洗液轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中，加無水甲醇稀釋至刻度，超聲10 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得包封藥物的破乳液。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性實驗

分別取20 μL對照品溶液、供試品溶液和空白納米粒溶液，按1.3節(jié)色譜條件測定，測定結(jié)果見圖2。

圖2 HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of standard solution, sample solution and blank solution

由圖2可知，輔料與依折麥布、辛伐他汀分離良好，輔料對藥物成分檢測無干擾，依折麥布色譜峰保留時間約為8.9 min，辛伐他汀色譜峰保留時間約為21.1 min。依折麥布理論塔板數(shù)大于8 000，辛伐他汀理論塔板數(shù)大于30 000，與相鄰色譜峰間分離度均大于2.0。

2.2 線性關(guān)系

精密吸取混合對照品儲備液0.2，0.8，1.4，2.0，2.6，3.2，3.8，4.4 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用流動相（A相和B相均為50%）稀釋至刻度，配制成一系列濃度梯度的溶液。按1.3節(jié)色譜條件測定，記錄峰面積。以峰面積A為縱坐標，以樣品濃度C（μg/mL）為橫坐標進行線性回歸分析，得依折麥布回歸方程為A = 50.576 C - 15.500（r = 0.9998），得辛伐他汀回歸方程為A = 61.327 C - 18.648（r = 0.9998）。結(jié)果表明，依折麥布在 2.090～45.978 μg/mL內(nèi)、辛伐他汀在2.182～48.013 μg/mL內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 檢測限和定量限

精密吸取混合對照品儲備液，按比例稀釋，按1.3節(jié)色譜條件測定。信噪比為3∶1時，依折麥布檢測限濃度為0.003 μg/mL，辛伐他汀檢測限濃度為0.007 μg/mL；信噪比為10∶1時，依折麥布定量限濃度為0.012 μg/mL，辛伐他汀定量限濃度為0.031 μg/mL。

2.4 精密度實驗

選取2.2節(jié)系列濃度梯度溶液中的一瓶，按1.3節(jié)色譜條件連續(xù)重復(fù)進樣5次，記錄峰面積，依折麥布、辛伐他汀峰面積的RSD分別為1.06%，0.53%，實驗結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性實驗

取同一批依折麥布辛伐他汀固體脂質(zhì)納米粒膠體溶液，按1.4.2節(jié)方法制備6份納米粒破乳液，按1.3節(jié)色譜條件測定，依折麥布、辛伐他汀峰面積的RSD分別為1.89%，1.07%，實驗結(jié)果表明本方法的重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性實驗

取同一份供試品溶液，在0，1，2，4，6，8，10 h，按1.3節(jié)色譜條件測定，記錄峰面積，依折麥布、辛伐他汀峰面積的RSD分別為1.21%，0.75%，實驗結(jié)果表明10 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.7 回收率實驗

精密吸取混合對照品儲備液 0.2，2.0，3.8 mL各3份，分別置于10 mL容量瓶中，用空白固體脂質(zhì)納米粒膠體溶液稀釋至刻度，按1.4.2節(jié)方法制備納米粒破乳液，按1.3節(jié)色譜條件測定，對回收率進行計算。結(jié)果依折麥布、辛伐他汀的平均回收率分別為98.79%，99.56%，RSD分別為1.11%，0.70%。

2.8 含量測定

取3批依折麥布辛伐他汀固體脂質(zhì)納米粒膠體溶液，按1.4.2節(jié)方法制備納米粒破乳液，按1.3節(jié)色譜條件測定，通過峰面積計算藥物含量，結(jié)果見表1。

表1 依折麥布辛伐他汀固體脂質(zhì)納米粒含量測定結(jié)果（n=3）Table 1 The contents of ezetimibe and simvastation nanoparticles(n=3)

2.9 包封率測定

取3批依折麥布辛伐他汀固體脂質(zhì)納米粒膠體溶液，按2.8節(jié)方法得到依折麥布的總含量C1總和辛伐他汀的總含量C2總。按 1.5節(jié)方法制備包封藥物破乳液，按1.3節(jié)色譜條件測定，記錄峰面積并計算依折麥布的包封藥物含量C1包和辛伐他汀的包封藥物含量C2包。計算依折麥布的包封率（包封率%=C1包/C1總×100%）和辛伐他汀的包封率（包封率%=C2包/C2總×100%）。結(jié)果，3批固體脂質(zhì)納米粒膠體溶液中依折麥布的包封率分別為87.6%，85.4%，89.3%；辛伐他汀的包封率分別為83.2%，84.1%，82.1%。

3 結(jié) 論

在實驗中，參考文獻做法[8,10]，對流動相組成和pH值、梯度洗脫條件、檢測波長等進行了調(diào)整和優(yōu)化，使得藥物檢測避免了卵磷脂等輔料的干擾，專屬性強、準確度高，藥物主峰峰形好，與雜質(zhì)峰分離度好。通過包封率測定方法的嘗試，選擇了葡聚糖凝膠過濾法，該方法對設(shè)備要求低、操作簡便、重復(fù)性好，較好的分離了包封藥物和游離藥物。

該研究建立了 HPLC法同時測定依折麥布辛伐他汀固體脂質(zhì)納米粒膠體溶液中兩種藥物含量的方法，通過葡聚糖凝膠過濾法對納米粒膠體溶液中的包封藥物和游離藥物進行分離，并測定其包封率。本方法簡便、高效、準確，為依折麥布辛伐他汀固體脂質(zhì)納米粒膠體溶液的質(zhì)量控制提供了參考依據(jù)。

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Determination of Drug Content and Entrapment Efficiency of Ezetimibe and Simvastation Nanoparticles by HPLC

QIU Yong-xiu, SHI Lei, LIU Yong-li, CHEN Xiao-fan, JIN Lin-lin, ZHAO Yin-yu

（Chemical Pharmaceutical Research Institute, Taizhou Vocational & Technical College, Zhejiang Taizhou 318000, China）

The HPLC method was established to determine the drug content and encapsulation efficiency of ezetimibe and simvastation nanoparticles. Detection conditions were as follows: chromatographic column was Agilent SB-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm); mobile phase was acetonitrile and 0.025 mol/mL sodium dihydrogen phosphate solution (pH4.50) for gradient elution with the flow rate 1mL/min; the detection wavelength was 234 nm or 238 nm; the temperature of column was 35 ℃; the sample volume was 20 μL. The dextran gel filtration method was employed to isolate the nanoparticles for determination the encapsulation efficiency. The results showed that: the linear correlation was good (r=0.999 8) in the range of ezetimibe concentration 2.090～45.978 μg/ml, and the average recovery was 98.79% with RSD 1.11%; the linear correlation was good (r=0.999 8) in the range of simvastation concentration 2.182～48.013 μg/ml, and the average recovery was 99.56% with RSD 0.70%; and the encapsulation rates were 87.4% for ezetimibe, 83.1% for sivastation. The detection method is simple, efficient, accurate for determining drug content and encapsulation efficiency of ezetimibe and simvastation nanoparticles.

Ezetimibe; Simvastation; Solid lipid nanoparticles; Determination; Entrapment efficiency; HPLC

TQ 460.7；R 917

A

1671-0460（2017）04-0613-03

浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動計劃，項目號：2015R462006；浙江省教育廳科研項目，項目號：Y201225666。

2017-02-14

邱永秀（1995-），女，江西省贛州市人，研究方向：從事藥物新劑型新制劑研究。E-mail：qyx1377131217@163.com。

石雷（1978-），男，副教授，碩士，研究方向：從事藥物新劑型新制劑研究。E-mail：sl_1026@126.com。