朱蓮花+凌蕾

摘 要 目的：選擇適宜方法對(duì)多種直接接觸藥品的包裝材料微生物限度進(jìn)行檢查，并對(duì)方法的適用性進(jìn)行驗(yàn)證。方法：對(duì)固體藥用聚丙烯瓶等數(shù)種藥品包裝材料按照相應(yīng)藥品包裝材料國家標(biāo)準(zhǔn)和中國藥典2015年版四部附錄通則的要求進(jìn)行微生物限度方法適用性驗(yàn)證。結(jié)果：金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽胞桿菌、白色念珠菌和黑曲霉五種標(biāo)準(zhǔn)菌株在菌落計(jì)數(shù)法驗(yàn)證試驗(yàn)中的回收率為60%～150%，符合藥典規(guī)定。在控制菌的方法驗(yàn)證試驗(yàn)中，均可檢出相應(yīng)的試驗(yàn)菌。結(jié)論：選定的方法適用于不同的藥品包裝材料的微生物限度檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 藥品包裝材料 微生物限度檢查 適用性驗(yàn)證

中圖分類號(hào)：R951 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2017）09-0073-03

Applicability verification of microbial limit test method for different drug packaging materials

ZHU Lianhua*， LING Lei（Shanghai Food and Drug Packaging Material Control Center， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To verify the applicability of the appropriate method for microbial limit test on different drug packaging materials. Methods： The microbial limit test and the validation test for the determination of the microbial contamination on pharmaceutical packaging materials such as the solid medicinal polypropylene bottle were performed based on the regulations of the National Standard Packaging Method and Chinese Pharmacopoeia 2015 edition. Results： The recovery rates of five standard strains Staphylococcus aureus， Pseudomonas aeruginosa， Bacillus subtilis， Candida albicans and Aspergillus niger were in the range of 60% ～150% by the colony count method， which meet the requirements of Chinese Pharmacopoeia. The corresponding test strains cold be detected by the validation test of control bacteria when they were incubated for a certain time at appropriate temperature. Conclusion： The selected method can be applied to the microbial limit test for the determination of the microbial contamination on different drug packaging materials.

KEy WORDS drug packaging material； microbial limit test； applicability verification

直接接觸藥品的包裝材料及容器既具備了盛藥品的功能，也因?yàn)槠渑c藥品的接觸而可能影響藥品的質(zhì)量。微生物污染是藥品包裝容器可能給藥品質(zhì)量帶來的風(fēng)險(xiǎn)之一，因此，為了確保藥品的安全有效，必須嚴(yán)格控制包裝容器的微生物污染程度[1-2]。藥品包裝材料微生物限度檢驗(yàn)主要是通過對(duì)附著在容器或材料表面的微生物進(jìn)行采集和檢驗(yàn)[3-4]，而藥品包裝容器的材料組成成分、生產(chǎn)工藝、貯存條件等各種因素都會(huì)對(duì)附著的微生物數(shù)量和種類帶來影響[5-6]。同時(shí)，檢驗(yàn)方法中對(duì)樣品表面附著微生物的采集方法——即供試液制備過程中涉及的提取介質(zhì)及具體制備方法都可能對(duì)微生物造成一定的損傷從而影響微生物生長，可能給檢驗(yàn)的準(zhǔn)確性帶來影響。微生物檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性還受到其他多種因素的影響，如樣本分布均勻性、樣品溶液制備過程中微生物收集的有效性、檢驗(yàn)方法的靈敏度等，這些內(nèi)容一般已經(jīng)在標(biāo)準(zhǔn)方法中有詳細(xì)的規(guī)定從而確保檢驗(yàn)方法的科學(xué)性。但各個(gè)實(shí)驗(yàn)室仍需對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法在本實(shí)驗(yàn)室的適用性進(jìn)行驗(yàn)證，從而確保本實(shí)驗(yàn)室的人員操作、實(shí)驗(yàn)環(huán)境、培養(yǎng)基和試劑等各個(gè)環(huán)節(jié)不會(huì)對(duì)該方法的結(jié)果造成影響，從而保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[7-10]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

生化培養(yǎng)箱Thermo 815（賽默飛世爾）；高壓蒸汽滅菌鍋MLS-3780（日本三洋公司）；ESCO生物安全柜Class II BSC（藝思高科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)用標(biāo)準(zhǔn)菌株

生物梅里埃定量質(zhì)控菌株BioBall MultiShot 550系列，包括金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus）NCTC 10788（批號(hào)：B3651）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P. aeruginosa）NCTC 12924（批號(hào)：B3653）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，B. sub）NCTC 10400（批號(hào)：B3647）、白色念珠菌（Candida albicans，C. albicans）NCPF 3179（批號(hào)：B3663）、黑曲霉（Aspergillus niger，A. niger）NCPF 2275（批號(hào)：B3642）、大腸埃希菌（Escherichia coli，E. coli）NCTC 12923（批號(hào)：B3661）。

1.3 培養(yǎng)基及試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）干粉、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）干粉、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）干粉、麥康凱液體培養(yǎng)基干粉、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基干粉、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基干粉、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基干粉，均來自于上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司。上述培養(yǎng)基適合性檢查符合規(guī)定[11]。

1.4 實(shí)驗(yàn)樣品

本實(shí)驗(yàn)所用樣品均為日常測(cè)試樣品。

1.5 菌液的制備

將不同種類的BioBall MultiShot 550標(biāo)準(zhǔn)菌株球分別倒入1.1 ml 14 d復(fù)溶液中，混勻，為實(shí)驗(yàn)用菌液（即500 cfu/ml標(biāo)準(zhǔn)菌株實(shí)驗(yàn)用菌液）。

1.6 供試液及濾膜的制備

1.6.1 墊片、膜、藥用瓶、鋁管等

藥用聚酯/鋁/聚丙烯封口墊片、外用貼膏劑用聚酯非織造布及復(fù)合膜、口服固體藥用瓶、鋁管及軟膏管分別按國家藥包材標(biāo)準(zhǔn)中YBB00132005-2015、YBB00132002-2015、YBB00082002-2015、YBB00162002-2015微生物檢查項(xiàng)下的要求進(jìn)行供試液制備后，分別取相當(dāng)于技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)中的一個(gè)單位（一片墊片、100 cm2的復(fù)合膜、一個(gè)瓶、一支鋁管）的供試液進(jìn)行薄膜過濾[12]。

1.6.2 氣霧劑閥門

取樣品10個(gè)，置于錐形瓶中，加入氯化鈉注射液100 ml，振搖1 min，即得1∶10供試液。取供試品溶液10 ml進(jìn)行薄膜過濾。

1.6.3 口服固體藥用瓶蓋

取本品10個(gè)，將無菌棉簽用氯化鈉注射液沾濕，在瓶蓋內(nèi)側(cè)擦拭，然后立即剪斷后將棉簽投入盛有100 ml氯化鈉注射液的錐形瓶中，換1支棉簽，同法操作（即每個(gè)瓶蓋用2支棉簽擦拭）。將瓶快速搖晃1 min，即得1∶10供試品溶液。分別取供試品溶液10 ml進(jìn)行薄膜過濾。

1.6.4 濾膜的沖洗

每張濾膜沖洗3次，每次的沖洗液體積為50 ml。

取濾膜照中國藥典2015年版四部通則1105進(jìn)行需氧菌總數(shù)、霉菌及酵母總數(shù)檢查，照中國藥典2015年版四部通則1106進(jìn)行控制菌檢查。

1.6.5 菌落計(jì)數(shù)和控制菌檢驗(yàn)

需氧菌、酵母及霉菌菌落計(jì)數(shù)及控制菌E. coli、S. aureus和P. aeruginosa檢驗(yàn)均按文獻(xiàn)操作[11]。

1.7 方法適用性驗(yàn)證

需氧菌、霉菌及酵母總數(shù)計(jì)數(shù)及控制菌方法適用性驗(yàn)證試驗(yàn)按照文獻(xiàn)操作[11]。加入的標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定菌種量為50 cfu，即上述1.5中的菌液0.1 ml?；厥章剩?）=（試驗(yàn)組菌數(shù)–供試品對(duì)照組菌數(shù)）/菌液對(duì)照組菌數(shù)×100%。當(dāng)5種標(biāo)準(zhǔn)菌的回收率均為50%～200%時(shí)，判定為合格。

2 結(jié)果

對(duì)8種藥品包裝材料的微生物限度試驗(yàn)中的需氧菌、霉菌及酵母的方法適用性驗(yàn)證結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)菌株的回收率均為63%～143%（表1～2）；在控制菌的驗(yàn)證試驗(yàn)中，大腸埃希菌的試驗(yàn)組和菌液對(duì)照組在封口墊片、藥用復(fù)合膜、氣霧劑閥門、口服固體藥用瓶及藥用瓶蓋包裝材料上的試驗(yàn)結(jié)果均是陽性，而供試品對(duì)照組則為陰性；金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的試驗(yàn)組和菌液對(duì)照組在非織造布、氣霧劑閥門、藥用復(fù)合膜、鋁管和軟膏管上的試驗(yàn)結(jié)果均是陽性，而供試品對(duì)照組則為陰性。這些結(jié)果表明，這三種控制菌的方法適用性驗(yàn)證結(jié)果均符合藥典相關(guān)要求，而8種藥品包裝材料的微生物限度試驗(yàn)方法也均適用。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)直接接觸藥品的包裝容器及材料中的封口墊片、非織造布、復(fù)合膜、氣霧劑閥門、口服固體藥用瓶、瓶蓋、軟膏管、鋁管8個(gè)產(chǎn)品的檢驗(yàn)方法進(jìn)行了適用性驗(yàn)證。在菌落計(jì)數(shù)法中，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉5種標(biāo)準(zhǔn)菌株回收率均為63%～143%，符合2015年版《中國藥典》四部通則1105中50%～200%的要求。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌的控制菌方法適用性驗(yàn)證也均符合2015年版《中國藥典》四部通則1106的要求。

對(duì)不同的藥品包裝材料的產(chǎn)品，應(yīng)選擇合適正確的檢驗(yàn)方法，并對(duì)所選的方法進(jìn)行適用性驗(yàn)證，只有當(dāng)方法適用性驗(yàn)證結(jié)果符合要求時(shí)，才能證明所選用的方法標(biāo)準(zhǔn)是合理的，檢測(cè)該類產(chǎn)品的結(jié)果是準(zhǔn)確有效的。但在標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)于同類品種不同生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)時(shí)是否進(jìn)行方法適用性的驗(yàn)證未作明確規(guī)定，有待今后進(jìn)一步完善[13-14]。

參考文獻(xiàn)

[1] 李永安， 蔡弘， 金宏， 等. 藥品包裝實(shí)用手冊(cè)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社， 2003.

[2] 周健丘， 梅丹. 藥品包裝材料對(duì)藥品質(zhì)量和安全性的影響[J]. 藥物不良反應(yīng)雜志， 2011， 13（1）： 27-31.

[3] 張艷霞， 陳光伏. 藥品包裝用復(fù)合膜與鋁箔實(shí)施微生物限度檢驗(yàn)的方法[J]. 人參研究， 2010（2）： 42-43.

[4] 戰(zhàn)宏利， 馬仕洪， 戴翬， 等. 口服液體藥用塑料瓶微生物污染狀況分析及試驗(yàn)方法改進(jìn)[J]. 藥物分析雜志， 2014， 34（6）： 1100-1105.

[5] 胡昌勤， 林平華， 許華玉. 實(shí)用藥品微生物檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)指南[M]. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 2015.

[6] 馬緒英，蘇德模. 藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)手冊(cè)[M]. 北京：科學(xué)出版社， 2001.

[7] 曹曉云， 郭艷娟. 藥品微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn)及其相關(guān)的技術(shù)問題[J]. 天津藥學(xué)， 2006， 18（6）： 49-51.

[8] 嚴(yán)杰， 羅海波， 陸德源. 現(xiàn)代微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及其應(yīng)用[M]. 北京： 人民衛(wèi)生出版社， 1997.

[9] 朱亞虹， 黃凱， 曾環(huán)想. 藥品微生物檢測(cè)的質(zhì)量保證[J].中國醫(yī)藥指南， 2010， 8（33）： 176.

[10] 劉金鳳. 分析藥品微生物限度檢驗(yàn)誤差影響因素[J]. 食品與藥品檢驗(yàn)， 2014， 24（2）： 188-189.

[11] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典2015年版四部[M]. 北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2015： 附錄通則1105-1106.

[12] 中國食品藥品檢定研究院. 國家藥包材標(biāo)準(zhǔn)（2015年版）[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 2015.

[13] 柴海毅. 淺析微生物計(jì)數(shù)方法的回收率[J]. 醫(yī)藥工程設(shè)計(jì)，

2013， 34（1）： 30-31.

[14] 寧黎麗， 成海平， 魏農(nóng)農(nóng). 微生物學(xué)檢查方法驗(yàn)證與評(píng)價(jià)要求[J]. 藥物評(píng)價(jià)研究， 2009， 32（1）： 6-9.