李 蕊 王 威 趙海濱 王 昀 張 晗 吳羿姍

（北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029）

·研究報告·

通腑化痰法對急性腦出血肝損害大鼠Kupffer細胞NF-κB、TNF-α表達的影響*

李 蕊 王 威 趙海濱 王 昀 張 晗 吳羿姍

（北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029）

目的 觀察星蔞承氣湯對急性腦出血肝損害大鼠Kupffer細胞中核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達的影響。方法 大鼠尾狀核注射膠原酶法建立腦出血模型，制備血清，提取SD大鼠Kupffer細胞，隨機分為正常對照組、腦出血模型組、葡醛內(nèi)酯組和通腑化痰組，每組分為6、12、24 h 3個時間亞組。EMSA檢測NF-κB活性，Western blot檢測NF-κB蛋白表達，ELISA法檢測TNF-α水平。結(jié)果 與正常對照組相比，Kupffer細胞NF-κB、TNF-α表達在大鼠急性腦出血肝損害后6、12、24 h均明顯升高（P＜0.05）；通腑化痰組和葡醛內(nèi)酯組TNF-α、NF-κB表達均較腦出血模型組降低（P＜0.05），但較正常對照組高，且通腑化痰組TNF-α、NF-κB較葡醛內(nèi)酯組低（P＜0.05）。結(jié)論 NF-κB、TNF-α在介導(dǎo)急性腦出血肝損害內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要作用，是腦出血后繼發(fā)肝損傷的重要因素，通腑化痰法能夠抑制kupffer細胞中NF-κB的活化和TNF-α的釋放，對腦出血肝損害具有一定的保護作用。

通腑化痰法 急性腦出血 Kupffer細胞 核轉(zhuǎn)錄因子κB 腫瘤壞死因子

急性腦出血（ACH）是臨床的常見病和多發(fā)病，且其致死率、致殘率居高不下［1］。腦出血肝損害具有高發(fā)性和隱蔽性的特點，是核心靶器官遭受嚴重應(yīng)激損傷，引起和加重原發(fā)病并致死的關(guān)鍵性因素。其主要原因之一是肝細胞死亡受體通路紊亂，內(nèi)毒素（LPS）誘導(dǎo)Kupffer細胞等過度激活，合成釋放核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性細胞因子，引發(fā)急、慢性肝損傷［2］。Kupffer細胞主要存在肝血竇中，占巨噬細胞細胞的80%～90%，具有啟動免疫應(yīng)答、吞噬清除病原、促進肝細胞再生等功能［3］。本課題在前期中醫(yī)藥干預(yù)腦出血肝損害研究基礎(chǔ)上［4］，已經(jīng)證實通腑化痰法通過調(diào)控白細胞介素受體相關(guān)激酶（IRAKs）細胞因子的轉(zhuǎn)錄和表達，影響LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而發(fā)揮急性腦出血繼發(fā)肝損害的保護作用。本研究擬在體外培養(yǎng)肝Kupffer細胞中進一步研究NF-κB活性及TNF-α表達水平，并觀察急性腦出血應(yīng)激性肝損害發(fā)生發(fā)展和變化，探討中醫(yī)通腑化痰法對其的干預(yù)機理，揭示該法對腦出血肝損害的保護機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康雄性成年SD大鼠96只，體質(zhì)量（300±20）g，由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK（京）2012-0001。隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常對照組、腦出血模型組、葡醛內(nèi)酯組和通腑化痰組，每組再分為6、12、24 h 3個時相亞組，每個時間點8只。分籠飼養(yǎng)，術(shù)前12 h禁食不禁水。

1.2 試劑與儀器 星蔞承氣湯，藥物組成：大黃6 g，芒硝6 g，膽南星12 g，瓜蔞12 g，枳實8 g，丹參18 g，配成復(fù)方顆粒劑，由北京康仁堂中藥有限公司提供。Ⅶ型膠原酶（Sigma）；RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco）；20%胎牛血清（FBS，Hyclone）；山羊抗兔 IgG（H+L），HRP（天德悅，S004）；山羊抗小鼠IgG（H+L），HRP（天德悅，S001）；蛋白抽提試劑（CWBIO）；BCA蛋白定量試劑盒（CWBIO）；引物合成（Invitrogen）；NF-κB EMSA檢測試劑盒（Thermo，89880）；核蛋白提取試劑盒（凱基生物，KGP150）；蛋白酶抑制劑（Roche，11697498001）；TNF-α ELISA試劑盒（欣博盛，ERC102a.96）；電泳儀（Bio-Rad）；濕轉(zhuǎn)電泳槽（Cavoy）。

1.3 造模及血清制備 參照文獻［5］，并根據(jù)實驗要求做一定改進，本課題組在前期國家自然科學(xué)基金研究中［6-7］，采用大鼠尾狀核注射Ⅶ型膠原酶法成功建立腦出血模型。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，頭部丁字切口暴露顱骨，以前囟為原點，橫坐標向右開4 mm，縱坐標向后1 mm，牙科鉆鉆顱約5 mm深度，注射0.5 UⅦ型膠原酶，縫合切口。通腑化痰組：復(fù)制腦出血模型，于腦出血造模手術(shù)前2 d開始灌胃給藥，每天1次，手術(shù)前2 h加灌1次，手術(shù)后每天灌胃1次，各時相點處死前2 h加灌1次，給藥量按《藥理實驗方法學(xué)》所示劑量換算法計算［8］：200 g大鼠計量（g/kg）＝人的劑量［1 g/（kg·d）］×0.018。葡醛內(nèi)酯組：復(fù)制腦出血模型，灌服葡醛內(nèi)酯，灌胃方法及次數(shù)同通腑化痰組。正常對照組：不做造模處理。末次給藥40 min后腹主動脈采血10 mL，收集血清于無菌離心管中，于-80℃冰箱備用。

1.4 Kupffer細胞的分離及培養(yǎng) 按文獻［9］的改進方法采用酶消化法、密度梯度離心以及選擇貼壁法提取Kupffer細胞。采用臺盼藍拒染實驗測定細胞活性，計數(shù)顯示活細胞數(shù)量在90%以上；吞噬墨汁實驗測定細胞性質(zhì)，顯示絕大部分細胞內(nèi)充斥有碳素顆粒，平均約為95%。將純化后的Kupffer細胞接種于6孔板中（1× 106/L），用含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。1）正常對照組：在培養(yǎng)基上清液中加入正常大鼠血清。2）腦出血模型組：上清液中加入正常血清和模型大鼠血清。3）葡醛內(nèi)酯組：上清液中加入模型大鼠血清和葡醛內(nèi)酯血清。4）通腑化痰組：上清液中加入模型大鼠血清和滌痰通瘀血清。置于CO2培養(yǎng)箱，分別培養(yǎng)6、12、24 h后，收集上清液，-70℃保存。

1.5 標本采集與檢測

1.5.1 EMSA檢測NF-κB活性 1）核蛋白抽提：按說明書操作，提取上清即為胞核蛋白。2）按照NF-κB EMSA試劑盒，配制6%的TBE膠，100V預(yù)電泳1 h。3）NF-κB探針與核蛋白結(jié)合反應(yīng)：在反應(yīng)體系中，依次加入2 μL 10×Binding Buffer，1 μL 1 μg/μL Poly（dI. dC），1 μL 50%Glycerol，1 μL 100 mmol/L MgCl2，1 μL 1%NP-40，5 μg Protein Extract及3 μL Biotin-DNA（30 fmol）。加超純水至20 μL，混勻后，室溫靜置20 min。4）電泳、轉(zhuǎn)膜及交聯(lián)：新?lián)Q緩沖液，20 μL/孔，100 V，直到溴酚藍移至膠的2/3處停止；濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜；將膜至于254 nm的紫外交聯(lián)儀下，交聯(lián)15 min后封閉15 min。5）抗體孵育、曝光顯影：Streptavidin-HRP以1∶300稀釋，將膜完全浸沒，室溫輕搖，15 min，洗膜5次，每次5 min。ECL加到膜上后反應(yīng)2 min，膠片曝光5 min，顯影、定影。膠片在室溫下干燥，掃描圖像。

1.5.2 Western blot檢測NF-κB蛋白水平 采用蛋白免疫印跡法（Western blot），提取不同組別Kupffer細胞胞漿和胞核蛋白，BCA法蛋白定量檢測，加入樣品緩沖液最終質(zhì)量濃度為4 mg/mL，煮沸變性5 min。根據(jù)目的蛋白分子量，配制12%的分離膠，濃縮膠濃度為5%。取20 μg/孔蛋白樣品凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，封閉：將膜完全浸沒3%BSA-TBST中室溫輕搖30 min。一抗孵育：用3%BSA-TBST稀釋一抗，室溫孵育10 min，放4℃過夜。TBST洗膜5次，每次3 min。二抗孵育：用5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗，山羊抗兔IgG（H+L）HRP，1∶20000，室溫輕搖40 min。洗膜：TBST洗膜6次，每次3 min。ECL加到膜上后反應(yīng)3～5 min，膠片曝光，顯影2 min，定影。圖像分析軟件測定條帶灰度值，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值反映胞核NF-κB蛋白表達情況。

1.5.3 Elisa法檢測TNF-α水平 提取Kupffer細胞總蛋白，并進行定量檢測，按照ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。結(jié)果以（±s）表示。組間比較方差齊采用方差分析，方差不齊采用非參，兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠Kupffer細胞NF-κB DNA結(jié)合活性的檢測 見圖1。各組Kupffer細胞培養(yǎng)12 h后，檢測到特異的蛋白和NF-κB DNA交聯(lián)的滯后帶，如圖1所示，正常對照組蛋白滯后條帶不明顯，腦出血模型組細胞核蛋白組出現(xiàn)明顯滯后條帶，通腑化痰組及葡醛內(nèi)酯組Kupffer細胞核內(nèi)NF-κB DNA結(jié)合活性均較腦出血模型組低，且通腑化痰組Kupffer細胞核內(nèi)NF-κB DNA結(jié)合活性低于于葡醛內(nèi)酯組。

圖1 各組Kupffer細胞NF-κB活性

2.2 各組大鼠Kupffer細胞NF-κB表達水平的比較

見表1。Western blot檢測結(jié)果作灰度值分析顯示，腦出血模型組NF-κB表達顯著高于正常對照組、通腑化痰組和葡醛內(nèi)酯組（P＜0.05），通腑化痰組明顯低于葡醛內(nèi)酯組（P＜0.05），但高于正常對照組，提示通腑化痰法可以降低NF-κB的活化，抑制炎癥因子的表達。

2.3 各組大鼠Kupffer細胞TNF-α含量的比較 見表2。腦出血模型組Kupffe細胞上清TNF-α表達顯著高于正常對照組（P＜0.05），通腑化痰組和葡醛內(nèi)酯組TNF-α顯著低于腦出血模型組（P＜0.05），但高于正常對照組，且通腑化痰組TNF-α顯著低于葡醛內(nèi)酯組（P＜0.05）。

表1 各組大鼠Kupffer細胞NF-κB表達水平的比較（±s）

表1 各組大鼠Kupffer細胞NF-κB表達水平的比較（±s）

與同時間點對照組比較，*P＜0.05；與同時間點模型組比較，#P＜0.05；與同時間點葡醛內(nèi)酯組比較，△P＜0.05。下同。

組別6 h 12 h 24 h正常對照組 0.2750±0.0224腦出血模型組 1.9653±0.1680*葡醛內(nèi)酯組 1.2783±0.0962#0.2817±0.0276 0.2863±0.0231 1.6580±0.1022*1.8325±0.1491*0.9733±0.0335#1.1452±0.1136#通腑化痰組 0.8219±0.0146#△0.6842±0.0285#△0.7184±0.0243#△

表2 各組大鼠Kupffer細胞TNF-α含量的比較（±s）

表2 各組大鼠Kupffer細胞TNF-α含量的比較（±s）

組別6 h 12 h 24 h正常對照組 1.23±0.11腦出血模型組 51.57±8.20*葡醛內(nèi)酯組 40.10±7.06#1.09±0.08 1.14±0.12 35.68±8.13*43.94±7.72*20.46±7.65#35.06±6.58#通腑化痰組 28.37±3.24#△11.71±2.05#△19.05±2.71#△

3 討 論

急性腦出血繼發(fā)的肝損害，主要原因之一是機體在應(yīng)激性內(nèi)源或外源性損傷侵襲下，內(nèi)毒素（LPS）促進合成分泌細胞因子及炎性介質(zhì)，大量氧自由基、細菌等移位，可通過血運途徑進入門脈系統(tǒng)，LPS激活肝內(nèi)Kupffer細胞發(fā)生瀑布式連鎖反應(yīng)，活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，導(dǎo)致TNF-α等一系列炎癥細胞因子基因的轉(zhuǎn)錄和表達［2］，從而造成肝臟功能受損。肝臟是人體內(nèi)各種營養(yǎng)代謝和儲存的總樞紐，是機體調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)的核心。一旦肝臟受損，Kupffer細胞等單核巨噬細胞系統(tǒng)功能減弱，引起細菌和LPS“逃逸”，發(fā)生內(nèi)毒素血癥，細菌移位加劇［10］，從而進一步加重肝損傷，形成惡性循環(huán)。因此，如何在早期積極進行干預(yù)，抑制Kupffer細胞激活NF-κB，阻止TNF-α釋放，保證機體對內(nèi)毒素的清除功能，是阻止或延緩急性腦出血后肝損傷甚至多器官臟器功能衰竭（MODS）發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。

Kupffer細胞來源于骨髓及血液中的單核細胞，是肝臟炎癥反應(yīng)的效應(yīng)細胞，可產(chǎn)生多種細胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6等。其主要存在于肝竇內(nèi)，具有吞噬清除病原、參與免疫反應(yīng)、維持內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)態(tài)的功能［3］。NF-κB是Rel家族的主要核轉(zhuǎn)錄因子，以非活化狀態(tài)，存在于多種細胞類型中，參與調(diào)控機體應(yīng)激、免疫、炎癥等反應(yīng)，其中最主要的功能是對編碼炎性分子基因的轉(zhuǎn)錄［11-12］。TNF-α是機體創(chuàng)傷后較早釋放的重要促炎細胞因子，具有廣譜生理和病理效應(yīng)，肝臟中的TNF-α主要由Kupffer細胞分泌［13］。NF-κB與TNF-α是Kupffer細胞中LPS介導(dǎo)的發(fā)生炎性級聯(lián)反應(yīng)的主要致病細胞因子，TNF-α是NF-κB的靶基因，可以通過激活NF-κB正反饋通路［14］，致使炎癥瀑布效應(yīng)持續(xù)放大。且已有研究表明［15］，TNF-α能夠直接損害肝細胞引起肝損傷。任曉玲等［16］報道NF-κB與TNF-α呈直線相關(guān)。因此，以NF-κB、TNF-α為潛在靶點研究，可能是解決炎癥反應(yīng)失控的突破點之一。

本實驗在前期研究基礎(chǔ)上［4，6-7］，建立了腦出血大鼠模型并體外培養(yǎng)Kupffer細胞，分別給予西藥葡醛內(nèi)酯及中藥通腑化痰湯干預(yù)，EMSA結(jié)果表明，腦出血模型組出現(xiàn)明顯滯后條帶，說明Kupffer細胞核內(nèi)NF-κB DNA結(jié)合活性最強，通腑化痰組及葡醛內(nèi)酯組NF-κB DNA結(jié)合活性較腦出血模型組低，且以通腑化痰組更低，說明通腑化痰組可以抑制核轉(zhuǎn)錄因子活化，從而阻斷 NF-κB DNA結(jié)合反應(yīng)。Western blot及ELISA結(jié)果顯示，腦出血模型組NF-κB及TNF-α表達在各個時間點均較正常對照組增高，葡醛內(nèi)酯組及通腑化痰組均能夠降低NF-κB及TNF-α表達，且以通腑化痰組作用最為明顯。提示通腑化痰法能夠發(fā)揮腦出血肝損害的保護作用，其機制可能與抑制Kupffer細胞炎癥蛋白NF-κB活化，進而阻止下游炎癥因子的合成與釋放有關(guān)。

中風(fēng)總屬本虛標實，急性期標實為主，氣血逆亂，風(fēng)火相煽，痰熱內(nèi)阻，中焦氣機紊亂，且火熱內(nèi)熾，消爍津液，而致痰熱腑實。故可見神識昏蒙、鼻鼾痰鳴；邪毒橫竄，諸臟受伐，變證諸起，終致臟腑衰竭。在治療上，“急則治其標”，以祛邪為主。本研究以通腑化痰立法，立意于《中醫(yī)內(nèi)科學(xué)》中星蔞承氣湯。方中大黃、芒硝通腑瀉熱，蕩滌腸胃，借通降瀉下之力，迅速有效排出腸道痰熱毒邪；同時急下存陰，膽南星、瓜蔞清熱滌痰、潤燥滑腸；枳實破氣除痞，化痰消積；丹參活血祛瘀，養(yǎng)血安神，藥簡力?！，F(xiàn)代研究表明，通腑化痰法治療急性期中風(fēng)病可以通過腦腸軸機制抑制炎性反應(yīng)，改善血液流變學(xué)，調(diào)節(jié)新陳代謝，從而保護機體在應(yīng)激狀態(tài)下免遭全身性炎性反應(yīng)侵害及其他靶器官受損的作用［17］。本研究結(jié)果顯示，通腑化痰組NF-κB及TNF-α的表達均較葡醛內(nèi)酯組低，說明通腑化痰法可以通過抑制LPS誘導(dǎo)的Kupffer細胞活化核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，減少TNF-α炎性因子的合成釋放，從而發(fā)揮對腦出血肝損害的保護作用。至于是否存在其他信號調(diào)控途徑，尚有待于進一步研究。

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Expression of TNF-αand NF-κB in Kupffer Cells caused by Hepatic StressInjury in Rats with Acute Cerebral Hemorrhage and Effects of Bowels-relaxing and Phlegm-resolving Method

LI Rui，WANGWei，ZHAO Hai-bin，WANG Yun，et al. The Third Affiliated Hospital of Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100029，China.

Objective：To investigate the changes of nuclear factor-κB（NF-κB）and tumor necrosis factor-α（TNF-α）in Kupffer cells（KCs）caused by hepatic stress injury in rats with acute cerebral hemorrhage and explore the protection mechanism of bowels-relaxing and phlegm-resolving method.Methods：Cerebral hemorrhage was induced by injecting collagenaseⅦinto the caudate nucleus of rats.With the serum was prepared well and healthy SD rats liver KCs were isolated，KCs were randomlly divided into 4 groups：blank control group，cerebral hemorrhage group，glucurolactone group and Tongfuhuatan group.Each group was further divided into 3 time-point sub-groups of 6，12，and 24 h.The activation of NF-κB in KCs was detected by electrophoresis mobility shift assays（EMSA），the protein of NF-κB was observed by Western blot，the expressions of TNF-α were determined by Enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）after drug administration.Results：The levels of NF-κB and TNF-α in KCs in cerebral hemorrhage group were more than that of blank control group at each time-point（P＜0.05）. Compared with cerebral hemorrhage group，it was increased significantly in both glucurolactone group and Tongfuhuatan group（P＜0.05），but it higher than blank control group.Further more，Tongfuhuatan group had markedly reduced（P＜0.05）.Conclusion：The expression of NF-κB and TNF-αplay important roles in the signal transduction induced by Lipopolysaccharide in KCs caused by hepatic injury with acute cerebral hemorrhage.Bowelsrelaxing and phlegm-resolving method could enhance the activity of NF-κB and release of TNF-α availably，which is an important way to exert its protective effects on treating hepatic stress injury caused by acute cerebral hemorrhage.

bowels-relaxing and phlegm-resolving method；Accused cerebral hemorrhage（ACH）；Kupffer cells；nuclear factor-κB（NF-κB）；tumor necrosis factor-α（TNF-α）

R285.5

A

1004-745X（2017）04-0604-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.04.012

2016-11-25）

北京中醫(yī)藥大學(xué)優(yōu)秀青年骨干教師專項計劃（2015-JYB-QNJSZX010）