康 巖 李志杰 王麗娜 郭玉卿 劉 璠 張 潔

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，石家莊050031)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離鑒定及在糖尿病大鼠腎臟保護(hù)中的機(jī)制研究①

康 巖 李志杰 王麗娜 郭玉卿 劉 璠 張 潔

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，石家莊050031)

目的：觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、鑒定方法及在糖尿病大鼠腎臟保護(hù)中的機(jī)制。方法：取大鼠31只，1只大鼠采用貼壁培養(yǎng)法分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，Real-time PCR檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞表面分子量。30只大鼠采用鏈脲佐菌素腹腔注射構(gòu)建糖尿病大鼠模型。根據(jù)處理方法不同分為對(duì)照組(n=15)和干細(xì)胞治療組(n=15)。對(duì)照組大鼠采用胰島素聯(lián)合普羅布考治療，干細(xì)胞治療組植入干細(xì)胞治療，治療前、后檢測(cè)2組大鼠空腹血糖、24 h尿蛋白排泄、肌酐清除率、腎重比體重；采用PAS染色觀察2組腎組織情況；采用Western blot檢測(cè)腎臟組織相關(guān)基因和蛋白水平。結(jié)果：原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)24 h后換液時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞分布不均勻，在培養(yǎng)瓶呈分片聚集，形態(tài)不規(guī)則。培養(yǎng)7 d后細(xì)胞集落多，細(xì)胞規(guī)則，呈長(zhǎng)梭形、橢圓形，折光性強(qiáng)，細(xì)胞間相互融合鋪滿瓶底；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)均一，呈長(zhǎng)梭形，輪廓清除，折光性強(qiáng)，生長(zhǎng)迅速，部分細(xì)胞呈漩渦狀；Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示：SH2、CD44、CD31呈陽(yáng)性表達(dá)，CD34呈陰性表達(dá)；觀察組治療后空腹血糖、24 h尿蛋白排泄、肌酐清除率、腎重比體重，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；干細(xì)胞治療組大鼠腎臟組織PAS染色結(jié)果顯示：腎小球結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)規(guī)則，腎小球內(nèi)細(xì)胞排列規(guī)則，基底膜和包曼氏囊清晰。對(duì)照組大鼠腎小球體積增大，系膜區(qū)增寬，基質(zhì)明顯增多；干細(xì)胞治療組治療后Bcl-2蛋白水平得到顯著提高，Bax和Caspase-3蛋白水平得到顯著下降。對(duì)照組Bcl-2蛋白水平得到顯著降低，Bax和Caspase-3蛋白水平得到提高(P<0.05)。2組治療前氧化應(yīng)激ROS、MDA、SOD指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干細(xì)胞治療組治療后氧化應(yīng)激ROS、MDA、SOD指標(biāo)，低于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論：利用貼壁培養(yǎng)法能分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并利用綠色熒光蛋白進(jìn)行體外標(biāo)記，植入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能保護(hù)機(jī)體腎臟，抑制糖尿病腎臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

糖尿病腎??；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；腎臟保護(hù)；相鏈脲佐菌素；PAS染色；Real-time PCR法；Western blot

糖尿病腎病(Diabetic nephropathy，DN)屬于糖尿病主要微血管并發(fā)癥，在糖尿病患者中具有較高的發(fā)病率和病死率。目前的治療手段主要是嚴(yán)格控制血糖、血壓，這些方法雖然能改善患者癥狀，但是不能消除DN的發(fā)生、發(fā)展[1]。因此臨床上尋找積極有效地方法延緩甚至阻斷DN進(jìn)展的新治療策略具有重要的意義。文獻(xiàn)報(bào)道顯示[2]：慢性炎癥在DN的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，而巨噬細(xì)胞則是介導(dǎo)腎臟炎癥的關(guān)鍵炎癥細(xì)胞。相關(guān)學(xué)者研究顯示[3]：在糖尿病動(dòng)物和糖尿病患者腎臟組織中均會(huì)出現(xiàn)巨噬細(xì)胞的明顯增加，并且細(xì)胞數(shù)量與腎損傷的進(jìn)展和腎功能的下降關(guān)系密切。因此，采取有效的措施直接或間接抑制巨噬細(xì)胞發(fā)生浸潤(rùn)能有效地防止或改善糖尿病腎臟損傷[4]。

氧化應(yīng)激屬于DN重要的發(fā)病機(jī)制，它主要由機(jī)體活性氧(Reactive oxygen species，ROS)成分產(chǎn)生增加，從而能引起抗氧化系統(tǒng)之家的平衡，當(dāng)機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激時(shí)，容易造成機(jī)體中蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物甚至DNA發(fā)生氧化[5]。在人體中糖是ROS產(chǎn)生的主要原料，機(jī)體持續(xù)高糖下能進(jìn)一步誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生ROS，從而能引起TGF-β及細(xì)胞外機(jī)制蛋白水平上調(diào)，而外源性H2O2或由葡萄糖氧化酶連續(xù)催化引起的H2O2則能上調(diào)系膜細(xì)胞中的TGF-β及FN表達(dá)。因此，加強(qiáng)糖尿病患者血糖控制能降低氧化應(yīng)激反應(yīng)[6]。文獻(xiàn)報(bào)道顯示：降低機(jī)體內(nèi)血糖水平能減少GLUT膜定位，從而能實(shí)現(xiàn)機(jī)體腎臟保護(hù)[7]。大量研究顯示：間充質(zhì)干細(xì)胞能降低機(jī)體血糖，減少尿蛋白，改善腎小球損傷。但是，其具體機(jī)制尚不完全知曉[8]。從間充質(zhì)干細(xì)胞功能來(lái)說(shuō)，細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)功能，能有效地抑制T細(xì)胞增殖，從而能影響DC細(xì)胞功能，抑制B細(xì)胞的增殖和終末分化等[9]。研究結(jié)果顯示：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞在一系列疾病中發(fā)揮了重要作用[10]。但是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在糖尿病腎臟保護(hù)中的機(jī)制尚不完全知曉。

于2014年12月～2016年6月在河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)，成功分離鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并完成大鼠糖尿病模型建立，探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、鑒定方法及在糖尿病大鼠腎臟保護(hù)中的機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 主要儀器和試劑 為了保證試驗(yàn)的順利完成，采用的主要儀器和試劑主要有細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)(美國(guó)Thermo Fisher)、移液器(德國(guó)Eppendorf公司)、離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)、倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)及DMEM/F12(美國(guó)Gibco公司)等。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計(jì) 細(xì)胞分離鑒定及動(dòng)物對(duì)比試驗(yàn)。時(shí)間及地點(diǎn)：31只大鼠，雌雄隨機(jī)，體重200～250 g，平均(231±6)g，所選動(dòng)物均由河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)大鼠飼養(yǎng)、處理均符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)下意見(jiàn)》相關(guān)規(guī)則[11]。31只大鼠中，1只用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離，根據(jù)處理方法不同分為對(duì)照組(n=15)和干細(xì)胞治療組(n=15)。

1.2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng) ①骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離及原代培養(yǎng)：取1只大鼠，頸椎脫臼處死，采用濃度為75%乙醇進(jìn)行10 min消毒，從股骨干、脛骨干兩端間斷，利用PBS完成骨髓腔沖洗，利用200目不銹鋼過(guò)濾篩去除大塊細(xì)胞后充分吹打制備細(xì)胞懸液[12]。采集細(xì)胞懸液將其轉(zhuǎn)入15 ml離心管中進(jìn)行5 min離心，速度1 000 r/min。向細(xì)胞懸液中加入濃度為10.0%FBS的α-MEM培養(yǎng)重懸，調(diào)整細(xì)胞密度1×106/cm2接種在25 cm2的培養(yǎng)瓶上，5%CO2，37℃下進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)，每2 d半量換液1次[13]；②骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞融合80.0%～90.0%時(shí)，去除培養(yǎng)基，采用 PBS進(jìn)行3次沖洗，去除培養(yǎng)品中的混雜細(xì)胞，加入2 ml濃度為0.25%胰蛋白酶進(jìn)行4 min消化，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞脫落時(shí)采用完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，利用吸管吸取培養(yǎng)基細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)入15 ml離心管中，1 000 r/min 離心10 min，去除上層清夜，加入濃度為10.0%FBS的α-MEM培養(yǎng)重懸，根據(jù)1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)[14]。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定：流式鑒定第三代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，用胰酶進(jìn)行消化收集，細(xì)胞計(jì)數(shù)后根據(jù)1×106/管的密度分裝到流式管中，采用PBS緩沖液進(jìn)行2次沖洗，將獲得的沉淀移入焦碳酸二乙酯處理過(guò)的Eppendorf管，采用Tsizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA作為模板，加入FITC標(biāo)記的CD44、CD34、CD31及SH2標(biāo)記的抗體標(biāo)本，同時(shí)設(shè)置一管為空白對(duì)照組。采用PBS進(jìn)行兩次洗滌，10 min離心，速度為1 500 r/min，去除上層清夜，加入200 μl PBS吹打制備細(xì)胞懸液，對(duì)擴(kuò)展產(chǎn)物進(jìn)行1.2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，拍照[15]。糖尿病大鼠模型建立：本研究中共有30只大鼠參加糖尿病模型建立。入選大鼠均進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁食12 h后稱重并經(jīng)尾靜脈采血測(cè)定基礎(chǔ)血糖值，采用STZ用檸檬酸緩沖液進(jìn)行溶解，根據(jù)25 mg/kg的劑量腹腔注射到大鼠中，STZ應(yīng)事先溶解在pH4.2～4.5的檸檬酸緩沖液中，避光保存，配置后30 min內(nèi)使用完畢，注射時(shí)必須速度要快。72 h后開(kāi)始尾靜脈采血測(cè)定大鼠血糖，連續(xù)測(cè)定3 d，對(duì)于測(cè)定血糖>16.77 mmol/L、IPGTT和HOMA-IR值提示大鼠存在胰島素抵抗視為糖尿病大鼠造模成功。建模2周后，對(duì)照組大鼠采用胰島素聯(lián)合普羅布考治療，干細(xì)胞治療組植入干細(xì)胞治療方法：經(jīng)尾靜脈注射1×106cm2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，每周注射1次，連續(xù)注射12周[16-17]。

1.2.3 觀察指標(biāo) ①細(xì)胞形態(tài)。觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代形態(tài)及傳代培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)；②生化指標(biāo)檢測(cè)。每周檢測(cè)2組空腹血糖、24 h尿蛋白排泄、肌酐清除率、腎重比體重。采用日立7600-020全自動(dòng)生化分析儀及血糖測(cè)定儀檢測(cè)空腹血糖、24 h尿蛋白排泄、肌酐清除率、腎重比體重[18]。③大體情況。觀察2組大鼠大體情況，包括：癥狀、精神、反應(yīng)等。④PAS染色。治療12周后殺死大鼠，切片脫蠟，采用過(guò)碘酸水溶液進(jìn)行10 min氧化，Schiff試劑染色30 min，流水清洗10 min，蘇木精復(fù)染5 min，中性樹(shù)膠封固，光鏡下觀察并拍照[19]。⑤腎臟組織相關(guān)基因和蛋白水平。從液氮中取出組織剪碎，加入裂解液，混合均勻后利用RT-PCR檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞表面分子Bcl-2蛋白、Bax和Caspase-3蛋白水平，相關(guān)操作步驟必須嚴(yán)格遵循儀器、試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行[20]。⑥氧化應(yīng)激指標(biāo)測(cè)定。觀察2組大鼠治療前、治療后氧化應(yīng)激ROS、MDA、SOD指標(biāo)變化情況，采用ELISA法進(jìn)行測(cè)定，血液采集后2 h內(nèi)進(jìn)行10 min 離心，速度3 000 r/min，相關(guān)操作步驟必須嚴(yán)格遵循儀器、試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析 參加的30只大鼠，30大鼠全部進(jìn)行結(jié)果分析數(shù)量，中途無(wú)脫落。

2.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代形態(tài)學(xué)觀察 原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)24 h后換液時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞分布不均勻，在培養(yǎng)瓶呈分片聚集，形態(tài)不規(guī)則(圖1A)。培養(yǎng)7 d后細(xì)胞集落多，細(xì)胞規(guī)則，呈長(zhǎng)梭形、橢圓形，折光性強(qiáng)，細(xì)胞間相互融合鋪滿瓶底(圖1B)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞傳代培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)均一，呈長(zhǎng)梭形，輪廓清除，折光性強(qiáng)，生長(zhǎng)迅速，部分細(xì)胞呈漩渦狀，見(jiàn)圖2。

圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞原代形態(tài)學(xué)觀察(×100)Fig.1 Bone marrow mesenchymal stem cells in primary morphology (× 100)Note: A.Bone marrow mesenchymal stem cells cultured 24 h morphology;B.For bone marrow mesenchymal stem cells cultured 7 d cell morphology.

圖2 傳代后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)(×100)Fig.2 Biography generations mesenchymal stem cell morphology (× 100)

2.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定 利用RT-PCR檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞表面分子SH2、CD44、CD34、CD31表達(dá)情況，結(jié)果顯示：SH2、CD44、CD31呈陽(yáng)性表達(dá)，CD34呈陰性表達(dá)，見(jiàn)圖3。

2.4 2組糖尿病大鼠大體情況 干細(xì)胞治療組治療后大鼠精神良好，反應(yīng)敏捷，毛發(fā)光澤鮮艷，多食、多飲、多尿等癥狀得到改善；對(duì)照組大鼠表現(xiàn)為多食、多飲、多尿，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，伴有消瘦癥狀。

2.5 2組大鼠治療前、后生化指標(biāo)檢測(cè)水平比較 2組治療前空腹血糖、24 h尿蛋白排泄、肌酐清除率、腎重比體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；觀察組治療后空腹血糖、24 h尿蛋白排泄、肌酐清除率、腎重比體重，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.6 2組大鼠氧化應(yīng)激ROS、MDA、SOD指標(biāo)比較2組治療前氧化應(yīng)激ROS、MDA、SOD指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干細(xì)胞治療組治療后氧化應(yīng)激ROS、MDA、SOD指標(biāo)，低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表2。

圖3 細(xì)胞表面分子SH2、CD44、CD34、CD31表達(dá)情況Fig.3 Cell surface molecule SH2,CD44,CD34,CD31 expressionNote: 1.Blank control;2.β-actin;3.SH2;4.CD44;5.CD31;6.CD34.

2.7 2組大鼠PAS染色結(jié)果比較 干細(xì)胞治療組大鼠腎臟組織PAS染色結(jié)果顯示：腎小球結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)規(guī)則，腎小球內(nèi)細(xì)胞排列規(guī)則，基底膜和包曼氏囊清晰。對(duì)照組大鼠腎小球體積增大，系膜區(qū)增寬，基質(zhì)明顯增多，見(jiàn)圖4。

2.8 2組大鼠腎臟組織相關(guān)基因和蛋白水平比較 干細(xì)胞治療組治療后Bcl-2蛋白水平得到顯著提高，Bax和Caspase-3蛋白水平得到顯著下降。對(duì)照組Bcl-2蛋白水平得到顯著降低，Bax和Caspase-3蛋白水平得到提高(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖4 2組大鼠PAS染色結(jié)果(×200)Fig.4 2 groups of rats PAS staining(×200)Note: A.The result of PAS staining in renal tissue of rats treated with stem cells；B.The result of PAS staining in control group.

GroupsTimeGLU(mmol/L)24hurinaryalbuminexcretion(mg/d)Creatinineclearancerate[ml/(min·kg)]Kidneyweightthanweight(g/kg)StemcelltreatmentgroupBeforetreatment7.18±1.2210.31±0.836.14±1.057.01±1.02Aftertreatment6.19±1.31)2)6.36±0.591)2)4.04±0.951)2)6.12±0.981)2)ControlgroupBeforetreatment7.21±1.2910.29±0.796.15±1.117.03±1.03Aftertreatment6.93±1.412)8.42±0.912)5.24±1.252)6.57±1.022)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with before treatment,2)P<0.05.

GroupsTimeROS(U/ml)MDA(nmol/ml)SOD(ng/ml)StemcelltreatmentgroupBeforetreatment493.91±141.816.80±2.12132.21±35.31Aftertreatment351.09±198.601)2)4.67±2.801)2)163.91±41.651)2)ControlgroupBeforetreatment475.21±121.576.78±2.11128.39±31.24Aftertreatment440.93±140.192)6.00±2.112)142.75±31.472)

Note：Compared with the control group,1)P<0.05;compared with before treatment,2)P<0.05.

圖5 2組大鼠腎臟組織相關(guān)基因和蛋白水平比較Fig.5 Comparison of two groups of rats kidney tissue related genes and protein levels

3 討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是一類特殊的細(xì)胞，除了具有參與構(gòu)成血管微環(huán)境外，還具備多項(xiàng)分化潛能，在特定的條件下能分化為較多中胚層細(xì)胞、內(nèi)胚層細(xì)胞等[21]。目前，對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)方法相對(duì)較多，如：貼壁法、密度梯度離心法、流式細(xì)胞儀分選法等，這些方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，均能獲得一定濃度的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞[22,23]。傳統(tǒng)的貼壁篩選法獲得的原代細(xì)胞雖然純度較低，但是骨髓中可以分泌出滋養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞因子，能促進(jìn)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)[24]。本研究主要利用貼壁培養(yǎng)法能分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得的原代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)24 h后換液時(shí)可見(jiàn)細(xì)胞分布不均勻，在培養(yǎng)瓶呈分片聚集，形態(tài)不規(guī)則。培養(yǎng)7 d后細(xì)胞集落多，細(xì)胞規(guī)則，呈長(zhǎng)梭形、橢圓形，折光性強(qiáng)，細(xì)胞間相互融合鋪滿瓶底，細(xì)胞傳代培養(yǎng)后細(xì)胞形態(tài)均一，呈長(zhǎng)梭形，輪廓清除，折光性強(qiáng)，生長(zhǎng)迅速，部分細(xì)胞呈漩渦狀。骨髓細(xì)胞主要分為兩類，即：造血干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞占大部分[25]。由于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞并非造血類細(xì)胞，因此細(xì)胞分離后不會(huì)在細(xì)胞表面表達(dá)相關(guān)抗原，如：CD14、CD11a、CD38等，但是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)與骨髓中纖維細(xì)胞十分類似[26]。為了完成對(duì)細(xì)胞的鑒定，研究中采用RT-PCR檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞表面分子SH2、CD44、CD34、CD31表達(dá)情況，結(jié)果顯示：SH2、CD44、CD31呈陽(yáng)性表達(dá)，CD34呈陰性表達(dá)。由此看出：制備的細(xì)胞為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。

糖尿病腎病屬于糖尿病中最為常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，該疾病相對(duì)隱匿，起初主要以微量白蛋白為主。當(dāng)機(jī)體微量白蛋白發(fā)生變化后將會(huì)引起腎臟受損，部分患者甚至出現(xiàn)蛋白外漏?；颊吲R床上一旦發(fā)生蛋白尿時(shí)，腎功能將會(huì)出現(xiàn)急劇惡化并難以逆轉(zhuǎn)，患者需要采用腎臟透析或腎移植等維持生命，增加患者家庭及社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[27]。從病理角度來(lái)說(shuō)[28]：DN患者發(fā)病后主要表現(xiàn)為腎臟容積和體積的增大，導(dǎo)致腎小球率過(guò)濾升高，從而引起毛細(xì)血管基底膜增厚，最終演變?yōu)槟I小球硬化，引起腎衰竭。本研究中，干細(xì)胞治療組治療后大鼠精神良好，反應(yīng)敏捷，毛發(fā)光澤鮮艷，多食、多飲、多尿等癥狀得到改善；對(duì)照組大鼠表現(xiàn)為多食、多飲、多尿，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，伴有消瘦癥狀。目前，普遍認(rèn)為引起DN細(xì)胞凋亡的途徑有三種：死亡受體途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線粒體途徑。將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞植入DN大鼠體內(nèi)后將會(huì)抑制機(jī)體組織細(xì)胞發(fā)生凋亡，能抵抗多種形式的細(xì)胞死亡刺激，促進(jìn)細(xì)胞生存，從而能實(shí)現(xiàn)對(duì)大鼠腎臟的保護(hù)[29]。本研究中，觀察組治療后空腹血糖、24 h尿蛋白排泄、肌酐清除率、腎重比體重，顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。由此看出：干細(xì)胞的植入能有效地抑制機(jī)體組織細(xì)胞的產(chǎn)生、增殖，充分發(fā)揮細(xì)胞刺激作用，能降低機(jī)體炎性反應(yīng)，改善機(jī)體癥狀，緩解病情。

足細(xì)胞是構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)膜屏障的重要成分，相鄰的足突之間又規(guī)則的指狀交叉，并以裂孔膈膜相互連接，屬于腎小球?yàn)V過(guò)的最后屏障。文獻(xiàn)報(bào)道顯示：DN在發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中會(huì)引起足細(xì)胞凋亡、數(shù)目的減少，從而出現(xiàn)蛋白尿。由此看出：足細(xì)胞凋亡在DN的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用。本研究中， 2組治療前氧化應(yīng)激ROS、MDA、SOD指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；干細(xì)胞治療組治療后氧化應(yīng)激ROS、MDA、SOD指標(biāo)，低于對(duì)照組(P<0.05)。當(dāng)機(jī)體植入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后細(xì)胞能減少高糖對(duì)足細(xì)胞固有分子結(jié)構(gòu)的損傷，能保護(hù)足細(xì)胞，從而能抑制Caspase-3蛋白活化，從而能發(fā)揮大鼠腎臟保護(hù)作用[30]。本研究中，干細(xì)胞治療組大鼠腎臟組織PAS染色結(jié)果顯示：腎小球結(jié)構(gòu)清晰，形態(tài)規(guī)則，腎小球內(nèi)細(xì)胞排列規(guī)則，基底膜和包曼氏囊清晰。對(duì)照組大鼠腎小球體積增大，系膜區(qū)增寬，基質(zhì)明顯增多；干細(xì)胞治療組治療后Bcl-2蛋白水平得到顯著提高，Bax和Caspase-3蛋白水平得到顯著下降。對(duì)照組Bcl-2蛋白水平得到顯著降低，Bax和Caspase-3蛋白水平得到提高(P<0.05)。

綜上所述，利用貼壁培養(yǎng)法能分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，采用STZ一次性付清內(nèi)注射建立糖尿病大鼠，并植入骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能保護(hù)機(jī)體腎臟，降低其血糖，抑制糖尿病腎臟的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

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[收稿2016-10-27 修回2016-12-07]

(編輯 許四平)

Mesenchymal stem cell isolation,identification and protection mechanism in kidney of diabetic rats

KANGYan,LIZhi-Jie,WANGLi-Na,GUOYu-Qing,LIUPan,ZHANGJie.

TheFirstAffiliatedHospitolofHebeiMedicalUniversity,Shijianzhuang05031,China

Objective:To observe the bone marrow mesenchymal stem cell isolation,identification methods and protection mechanisms in the kidney of diabetic rats.Methods: Thirty-one rats were used to isolate bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) by adherent culture method.Cell morphology was observed by phase contrast microscope.The surface molecular weight of cultured cells was detected by Real-time PCR.30 rats were induced by intraperitoneal injection of streptozotocin to establish diabetic rat model (n=15).And stem cell treatment group (n=15) according to the different treatment methods.Rats in the control group were treated with insulin combined with probucol.Stem cell treatment group was implanted with stem cells.Before and after treatment,fasting blood glucose,24 h urinary protein excretion,creatinine clearance rate and kidney weight were measured.PAS staining.And the renal tissue was detected by Western blot.Results: The primary bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) were cultured for 24 hours,and the cells were irregularly distributed in the culture flask.After 7 days of culture,the cells were regular,elongated,elliptical,and strong refraction,and the cells were fused with each other.The morphology of BMSCs was uniform and showed a long fusiform shape,CD44,CD31 and CD34 were observed by RT-PCR.The levels of fasting blood glucose,24 h urine protein excretion and creatinine clearance rate in the observation group were significantly higher than those in the control group (P<0.05).The results of PAS staining showed that the glomerular structure was clear,the morphology was regular,the arrangement rules of glomerular cells,the basement membrane and the encapsulation of the glomerular membrane were significantly higher than those of the control group Man′s capsule clear (P<0.05).In the control group,the glomerular volume increased,the mesangial area widened and the stroma increased significantly.The Bcl-2 protein level and the Bax and Caspase-3 protein levels were significantly decreased in the stem cell treatment group.The levels of Bcl-2 and Bax and Caspase-3 protein in the control group were significantly decreased (P<0.05).The ROS,MDA and SOD levels in oxidative stress group were lower than those in control group (P<0.05).The difference of ROS,MDA and SOD between the two groups was not statistically(P>0.05).Conclusion: It is suggested that BMSCs can be isolated from rat bone marrow mesenchymal stem cells by using adherent culture method and labeled with green fluorescent protein in vitro.Bone marrow mesenchymal stem cells can protect the kidney and inhibit the oxidative stress of diabetic kidney.

Diabetic nephropathy;Bone marrow mesenchymal stem cells;Renal protection;Streptozotocin;PAS staining;Real-time PCR;Western blot

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.05.008

康 巖(1983年-)，女，碩士，主治醫(yī)師 ，主要從事糖尿病并發(fā)癥方面的研究。

R392

A

1000-484X(2017)05-0673-06

①本文為河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)科技研究計(jì)劃(160211K102)。