林建紅，李 軍，李 古，戴冰馨，施星雷，沈 潔，胡淵淵，吳家勝，宋麗麗

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300；2. 浙江省臨海市林木種子苗木管理站，浙江 臨海 317000）

鉛對榧樹幼苗生長及生理特性的影響

林建紅1，李 軍2，李 古1，戴冰馨1，施星雷1，沈 潔1，胡淵淵1，吳家勝1，宋麗麗1

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué)，浙江 臨安 311300；2. 浙江省臨海市林木種子苗木管理站，浙江 臨海 317000）

2013年，以2 年生無污染的榧樹實生苗為材料，以Pb(NO3)2的形式加入，設(shè)置0，700，1 400 mg·kg-13個處理濃度。處理60 d后，測定苗高、地徑、生物量及光合和生理指標(biāo)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，700 mg·kg-1的Pb處理促進榧樹幼苗生長，表現(xiàn)在總生物量、苗高和地徑等生長指標(biāo)均顯著高于對照組（P＜0.05）；幼苗葉片的凈光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和蒸騰速率（Tr）皆顯著高于對照（P＜0.05）；葉綠體超微結(jié)構(gòu)與對照相比無顯著差異，超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）活性較對照明顯下降（P＜0.05）。與對照相比，1 400 mg·kg-1的Pb處理則抑制榧樹幼苗生長，幼苗生物量、苗高和地徑以及Pn，Gs和Tr皆顯著低于對照（P＜0.05），且發(fā)生葉綠體超微結(jié)構(gòu)破壞，嗜鋨顆粒增多變大的現(xiàn)象；葉片的超氧陰離子（O2.-），過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）含量顯著上升，SOD，CAT，POD活性較對照明顯上升（P＜0.05），表明對榧樹幼苗產(chǎn)生了脅迫，抑制了生長和光合作用，導(dǎo)致活性氧自由基的積累、膜脂過氧化加劇和抗氧化酶活性的增加。

Pb；榧樹幼苗；生長指標(biāo)；光合參數(shù)；葉綠體超微結(jié)構(gòu)

鉛（Pb）作為一種毒性很大的重金屬，在環(huán)境中不能被生物降解，容易被植物吸收，進入食物鏈，最終危害人類的健康。隨著城鎮(zhèn)化、工業(yè)化、汽車尾氣排放以及有機農(nóng)藥的大量使用，Pb引起的大氣和土壤污染日益成為研究的熱點。土壤中Pb的過量積累對植物生長和代謝產(chǎn)生不利影響，干擾植物對營養(yǎng)素的吸收和轉(zhuǎn)運[1]，抑制光合，促進活性氧的形成而導(dǎo)致氧化脅迫[2]，改變酶活性[3]，破壞細胞膜的結(jié)構(gòu)和增加滲透性[4]，最終引起生長阻滯[5]。研究表明，Pb對植物生長的影響表現(xiàn)為一定的劑量效應(yīng)，超過一定濃度的重金屬抑制植物的營養(yǎng)生長。馬文麗等研究了不同濃度Pb脅迫下烏麥及普通小麥幼苗生長狀況，發(fā)現(xiàn)脅迫初期低濃度下的激活效應(yīng)，隨著脅迫時間的延長，轉(zhuǎn)而表現(xiàn)為抑制效應(yīng)[6]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，不同植物對Pb脅迫的敏感性和生理響應(yīng)也不同。500 ～ 1 000 mg·kg-1的 Pb對側(cè)柏幼苗的生長具有促進作用，而對國槐幼苗的生長具有明顯的抑制作用[7]。在600mg·kg-1Pb處理條件下，側(cè)柏的過氧化物酶（POD）活性高于金合歡，其抗Pb能力也強于金合歡[8]。因此，有必要深入研究不同植物對Pb脅迫的響應(yīng)機制。

香榧Torreya grandis cv. Merrillii為紅豆杉科Taxaceae榧樹屬Torreya常綠喬木，是野生榧樹的優(yōu)良變異類型經(jīng)人工嫁接培育而成的品種。香榧果實是我國南方重要特色珍稀干果，其營養(yǎng)價值高，富含優(yōu)質(zhì)脂肪酸、蛋白質(zhì)和多種微量元素[9]，栽培經(jīng)濟效益好，是集果用、油用、藥用、材用、綠化、觀賞為一體的多用途優(yōu)良經(jīng)濟樹種[10]。近年來隨著香榧果實價格大幅上升，林農(nóng)為追求經(jīng)濟效益，過量施用化肥、有機肥以及垃圾肥，雖然香榧產(chǎn)量明顯提高，但由于垃圾肥中的塑料、油漆含有Pb，造成Pb的累積，同時有機肥增施使得重金屬的有效性通過螯合作用得到提高，導(dǎo)致林地土壤Pb含量增加，但在香榧種子中卻未檢出[11]，這可能是香榧樹體對重金屬元素有選擇吸收的特性，對Pb有富集作用。目前仍然沒有榧樹幼苗對重金屬Pb耐受性的報道，榧樹幼苗對不同Pb處理下其生長和生理響應(yīng)的機理也未有涉及。

以榧樹幼苗為材料，研究不同濃度Pb處理對榧樹幼苗生長、光合和活性氧產(chǎn)生及清除酶活性的影響，為探討Pb對榧樹幼苗毒害的生理機制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

2013年6月，選用地徑、苗高一致、無污染和病蟲害的2年生實生榧樹苗（地徑為5±0.5 mm，苗高為35±2 cm）為供試材料，種子來源于同一棵樹，大小基本一致、無病菌。采用大棚盆栽土培控制（每盆1株）的試驗方法，盆栽容器選用內(nèi)徑16.5 cm，高18 cm，底部有孔的塑料盆，基質(zhì)為珍珠巖和石英砂（2.5 kg·盆-1）按照1:1（v/v）比例混合。8月開始，每3 d澆1次200 ml完全營養(yǎng)液（Hoagland），培養(yǎng)1個月，然后采用不同濃度Pb處理，以Pb(NO3)2鹽溶液的形式加入（處理前土壤中未檢出Pb），處理時先把Pb(NO3)2以干土重計算純Pb含量，并配成60 g·L-1的母液，然后進行稀釋，并均勻加入。Pb處理T1（0，CK），T2（700 mg·kg-1）和T3（1 400 mg·kg-1），Pb濃度選擇參照黃桂萍等人的報道[12]。T1，T2和T3處理液中除Pb含量不同以外，其余元素均保持平衡，施加的體積相同。處理期間每隔3 d澆1次，采用完全隨機分組試驗設(shè)計方法，共3個處理，每個處理3個重復(fù)，每個重復(fù)5株。處理時觀察生長狀況，60 d后對其苗高、地徑和生物量等生長指標(biāo)進行測定，其他光合和生理指標(biāo)選取苗木頂端的第3，第4片功能葉進行測定。

1.2 測定指標(biāo)與方法

1.2.1 生長勢 拍照記錄植株生長勢，觀察苗高與葉色，判斷苗木生長情況。

1.2.2 苗高、地徑和生物量測定 分別于處理前和處理后用卷尺測量所有受試苗木的苗高（根基部到頂芽），求得苗高增量（seeding height increment，SHI），精確到0.1 cm；分別于處理前和處理后用游標(biāo)卡尺測量所有受試苗木的地徑（每株苗十字交叉狀測量2次，取平均值），求得地徑增量（ground diameter increment，GDI），精確到0.02 mm；試驗處理結(jié)束后測定，將榧樹根（用水洗凈，涼干）和地上兩部分分別稱鮮重，然后取樣，105℃條件下殺青0.5 h，80℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，測定各部分干重。每個處理重復(fù)3次。

1.2.3 光合參數(shù)指標(biāo)測定 采用美國Licor公司生產(chǎn)的Li-6400便攜式光合測定系統(tǒng)測定當(dāng)年生已完全展開的榧樹葉片（葉片面積已達到最大）的光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）、胞間CO2濃度（Ci）和蒸騰速率（Tr）。測定時，光合有效輻射（PAR）設(shè)定為1 200 μmol·m-2·s-1，CO2濃度（Ca）為450 μmol·mol-1，流速為500 μmol·s-1，溫度設(shè)定為（29±1）℃。

1.2.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 選取當(dāng)年生的已完全展開葉片（葉片面積已達到最大）采用超便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨xMINI-PAM（WALZ，德國）測定其最小熒光產(chǎn)量（Fo）、最大熒光產(chǎn)量（Fm），算出可變熒光（Fv）。Fv /Fm表示PSII的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量。測定前，進行充足的暗適應(yīng)。

1.2.5 超氧陰離子（O2.-）產(chǎn)生速率、過氧化氫（H2O2）、丙二醛（MDA）和脯氨酸（Pro）含量測定 O2.-產(chǎn)生速率的測定采用羥胺氧化法[13]；H2O2含量的測定采用Patterson等的方法[14]；MDA含量測定采用硫代巴比妥酸法（TBA）[15]；Pro含量測定采用酸性茚三酮閉塞法[16]。

1.2.6 超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性測定 SOD活性用NBT法測定[17]。以單位時間內(nèi)抑制氮藍四唑光化還原50%為1個酶活性單位（U）。POD活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測定[18]，以每分鐘A470變化值表示酶活性大小。CAT活性采用紫外吸收法測定[19]，以每分鐘A240的變化值表示酶活力大小。不同處理從頂端下第一輪處各取5片葉片進行測定。

1.2.7 葉綠體超微結(jié)構(gòu)的觀察 選取當(dāng)年生的已完全展開的成熟葉片，用刀片切割成小方塊，放入 2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過夜后，用磷酸緩沖液（pH =7.0，0.1 mol·L-1）沖洗樣品3次，每次15 min，然后，1%的鋨酸溶液固定2 h，用50%，70%，80%，90%和95%的乙醇溶液清洗（每次15 min），再用100%乙醇清洗20 min，最后用純丙酮試劑清洗，20 min之后，用包埋劑與丙酮混合液（v/v=1:1）處理樣品1 h，再用包埋劑與丙酮混合液（v:v=3:1）處理樣品，3 h之后轉(zhuǎn)移入新的試管中，用純包埋劑滲透過夜，再將樣品轉(zhuǎn)移到eppendorf試管中，70℃加熱過夜。之后將樣品放在日立公司的JME-1230電子顯微下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2013和SPSS 16.0進行統(tǒng)計處理，所有數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤。采用SPSS 16.0，進行鄧肯氏多重差異分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pb處理對榧樹幼苗生長勢的影響

不同濃度Pb對榧樹幼苗生長有不同程度的影響。T2處理2個月后，榧樹幼苗的生長明顯高于對照，而T3處理的幼苗植株矮小、生長緩慢，同時葉片出現(xiàn)枯萎、掉落（圖1）。

2.2 Pb處理對榧樹幼苗生物量、苗高、地徑、根莖比的影響

2個月后，榧樹幼苗生物量、苗高、地徑和根莖比都出現(xiàn)了不同程度的增加，但不同處理之間仍然有很大差異。T2處理的總生物量、苗高、地徑和根莖比均顯著升高（P＜0.05），分別較T1（CK）增加了36.4%，8.5%，43.3%和23.4%。

圖1 不同濃度Pb處理對榧樹幼苗生長勢的影響Figure 1 Effect of different concentrations of Pb on the growth of T. grandis seedlings

表1 不同濃度Pb對榧樹幼苗生物量、苗高增量、地徑增量和根莖比的影響Table 1 Effect of different concentrations of Pb on dry weight, increments of seeding height and ground diameter and the ratio of root and shoot inTorreya grandis seedling

但T3處理的幼苗生物量、苗高和地徑與對照相比呈現(xiàn)明顯下降（P＜0.05），分別比對照降低了22.9%，14.2%和59.7%（P＜0.05），根莖比與對照相比則無顯著差異（P＞0.05），見表1。

2.3 Pb處理對榧樹幼苗光合參數(shù)的影響

T2處理下，榧樹幼苗葉片的Pn，Gs和Tr均顯著大于對照（P＜0.05），分別較對照升高了16.1%，23.7%和24.4%，Ci則顯著小于對照（P＜0.05），較對照降低了14.83%。T3處理下，葉片的Pn，Gs和Tr均顯著小于對照（P＜0.05），分別較對照降低了76.31%，72.66%和79.84%，Ci則顯著大于對照（P＜0.05），較對照增加了45.82%（圖2）。

圖2 不同濃度Pb處理對榧樹幼苗葉片光合參數(shù)的影響Figure 2 Effect of different concentrations of Pb on photosynthesis parameters in T grandis seedlings

2.4 Pb處理對榧樹幼苗熒光參數(shù)的影響

T2處理下，榧樹幼苗的 Fv/Fm顯著高于對照（P＜0.05），為對照的106.9%，表明在此Pb濃度下，榧樹幼苗葉片的原初光能轉(zhuǎn)化效率增加，而T3處理則使得葉片F(xiàn)v/Fm值顯著降低（P＜0.05）（圖3），表明此濃度的Pb下榧樹幼苗葉片的光合作用受到抑制。

2.5 Pb處理對榧樹幼苗MDA，Pro，H2O2含量和O2.-產(chǎn)生速率的影響

圖3 不同濃度Pb處理對榧樹幼苗葉片熒光參數(shù)的影響Figure 3 Effect of different concentrations of Pb on fluorescence parameters in Torreya grandis seedling

與對照相比，在T2處理下，H2O2，O2.-產(chǎn)生速率和MDA含量均明顯下降（P＜0.05），表明榧樹幼苗在此濃度未受到明顯的脅迫。而在T3處理下，葉片的H2O2含量，O2.-產(chǎn)生速率和MDA含量則明顯高于對照（P＜0.05），分別為對照的2.10，1.48和1.48倍，表明較高濃度的Pb處理導(dǎo)致了氧化脅迫。MDA是膜質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，是衡量細胞膜脂過氧化程度的重要指標(biāo)。植物體內(nèi)的脯氨酸含量作為植物細胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在一定程度上反映了植物的抗逆性。T3處理的榧樹苗體內(nèi)Pro大量積累，是對照的2.61倍（圖4）。

2.6 不同濃度Pb處理對榧樹幼苗抗氧化酶活性的影響

圖4 不同濃度Pb處理對榧樹幼苗葉片MDA,Pro, H2O2含量和O2.-產(chǎn)生速率的影響Figure 4 Effect of different concentrations of Pb on content of MDA, proline, H2O2and O2.-production rate in T. grandis seedlings

圖5 不同濃度Pb處理對榧樹幼苗葉片SOD，CAT和POD活性的影響Figure 5 Effect of different concentrations of Pb on SOD, CAT and POD activity in T. grandis seedlings

植物有很多種防御重金屬毒害的機制，其中一種是提高體內(nèi)抗氧化酶的活性，以抵抗重金屬脅迫引起的活性氧增加[26]。本試驗中，在1 400 mg·kg-1濃度的Pb處理下，葉片中Pro，MDA和H2O2含量以及O2.-的產(chǎn)生速率均增大，表明較高濃度的Pb處理導(dǎo)致了氧化脅迫，活性氧自由基大量產(chǎn)生，膜脂過氧化加劇，細胞質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞。同時，植物在受到脅迫時，通常會利用其復(fù)雜的抗氧化系統(tǒng)包括SOD，POD和CAT等，以限制活性氧自由基對細胞的損害[26]。隨著脅迫環(huán)境進一步加劇，活性氧物質(zhì)通常會對抗氧化酶產(chǎn)生嚴(yán)重的氧化損傷，導(dǎo)致其活性降低[27]。與對照相比，1 400 mg·kg-1濃度的Pb處理下，榧樹幼苗葉片POD，CAT和SOD三種抗氧化酶活性明顯提高（圖5），表明此種濃度Pb脅迫雖然對榧樹幼苗產(chǎn)生了一定程度的脅迫，但尚未達到較為嚴(yán)重的程度。本研究證明了榧樹幼苗對鉛有一定的耐受性。為了全面了解榧樹的抗Pb污染能力，還需進一步開展更高濃度Pb處理對榧樹幼苗以及不同年齡榧樹樹體影響的研究。

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Effect of Lead Stress on Growth and Physiological Properties in Torreya grandis Seedlings

LIN Jian-hong1，LI Jun2，LI Gu1，DAI Bing-xin1，SHI Xing-lei1，SHEN Jie1，HU Yuan-yuan1，WU Jia-sheng1，SONG Li-li1

（1. Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, China; 2. Linhai Forest Seed and Seedling Administration of Zhejiang, Linhai 317000, China）

Experiments were conducted on 2-year Torreya grandis seedlings treated by different concentrations of Pb namely 0(control), 700 and 1400 mg/kg in 2013. 60 days later, determinations were implemented on seedling height, ground diameter, biomass, photosynthetic and physiological parameters such as net photosynthetic rate(Pn), stomatal conductance(Gs), etc. The result showed that 700 mg·kg-1Pb treatment could significantly promote growth of seedlings, with more biomass, height growth and ground diameter than that of the control, as well as Pn, Gs and transpiration rate (Tr). Ultrastructure of chloroplast had no evident difference with that of the control, but activities of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT) decreased significantly. The treatment of 1400 mg/kg of Pb inhibited the growth, with less biomass, height growth and ground diameter than that of the control, and also Gs and (Tr). Ultrastructure of chloroplast was damaged, and superoxide anion (O2.-), H2O2and malondialdehyde (MDA) increased evidently, as well as SOD, POD and CAT, compared with that of the control.

plumbum; Torreya grandis seedling; growth; photosynthetic parameters; chloroplast ultrastructure

S791.53

A

1001-3776（2017）01-0033-08

10.3969/j.issn.1001-3776.2017.01.006

2016-09-14；

2016-12-19

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費（210504708）

林建紅，碩士研究生，從事經(jīng)濟林研究；E-mail：linkarlyou@qq.com。通信作者：宋麗麗，教授，博士，從事農(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工研究；E-mail：lilisong@zafu.edu.cn。