陳冠華，洪月琴，梅曉蕓，鄒雪梅，周佳偉

(江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

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膠束電動(dòng)色譜在線富集檢測(cè)苯氧酸除草劑殘留

陳冠華，洪月琴，梅曉蕓，鄒雪梅，周佳偉

(江蘇大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

為檢測(cè)糧食樣品中苯氧酸除草劑殘留，建立了一種采用極性轉(zhuǎn)換大體積進(jìn)樣方式的膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜新方法.研究了緩沖液、進(jìn)樣時(shí)間、分離和富集電壓對(duì)分離和富集的影響，優(yōu)化的緩沖液由20 mmol/L磷酸鹽和60 mmol/L SDS組成，pH為7.5；分離和富集電壓分別為20 kV和-20 kV；進(jìn)樣量為3.5 kPa×200 s.最佳條件下4種除草劑的富集倍數(shù)為510～620，方法檢出限為0.20～0.38 μg/kg，糧食樣品的加標(biāo)回收率80.6%～96.7%.方法可用于糧食樣品中苯氧酸除草劑殘留的檢測(cè).

苯氧酸除草劑；極性轉(zhuǎn)換；在線富集；膠束電動(dòng)色譜

自20世紀(jì)40年代合成出2,4-D以來(lái)，陸續(xù)有多種苯氧酸類(lèi)除草劑相繼得到開(kāi)發(fā)和應(yīng)用.該類(lèi)除草劑具有快速、廣譜和價(jià)廉等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于大宗糧食作物的除草作業(yè)中.違規(guī)施用可使其殘留進(jìn)入作物的可食部分，進(jìn)入人體后將會(huì)導(dǎo)致性激素比例失衡，影響人體內(nèi)正常的生理生化反應(yīng).許多國(guó)家和地區(qū)都規(guī)定了此類(lèi)除草劑在食品中的最大殘留限量(MRL)，歐盟規(guī)定小麥中毒莠定的MRL為0.05 mg/kg.

已報(bào)道的苯氧酸除草劑檢測(cè)方法主要有氣相色譜(GC)[1-2]、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)[3-4]、高效液相色譜(HPLC)[5-6]、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)[7-8]等.這些色譜類(lèi)的方法都具有檢測(cè)能力較強(qiáng)的特點(diǎn)，但是由于該類(lèi)除草劑揮發(fā)性差，采用GC和GC-MS方法檢測(cè)都需要進(jìn)行衍生化處理；為了防止對(duì)色譜系統(tǒng)的污染，采用HPLC和LC-MS方法檢測(cè)前通常要采用固相萃取等手段對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理，在利用反相色譜分離時(shí)還需要使用離子對(duì)試劑.

毛細(xì)管電泳(CE)適合于這類(lèi)有機(jī)酸類(lèi)化合物分離檢測(cè)，然而由于CE的進(jìn)樣量極低，限制了其在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中的應(yīng)用，已報(bào)道的CE檢測(cè)苯氧酸除草劑殘留的方法多采用了離線富集輔助手段[9-10].離線富集耗時(shí)，富集倍數(shù)有限.在線富集采用大體積進(jìn)樣后的反向推掃，可將樣品塞中的溶劑自毛細(xì)管入口推出，分析物同時(shí)得到充分濃縮，而后續(xù)的分離過(guò)程不會(huì)因樣品塞較大影響到分析物的分離.本文將建立的方法用于糧食中的苯氧酸除草劑殘留的檢測(cè).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

P/ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀(Beckman Coulter公司)；未涂層石英毛細(xì)管(邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司)，內(nèi)徑75 μm，總長(zhǎng)60 cm，有效柱長(zhǎng)50 cm；BS 124S 電子分析天平(賽多利斯公司)；B5500S-MT 超聲清洗機(jī)(上海必能信超聲有限公司)；pHS-2 型酸度計(jì)(上海第二分析儀器廠)；WH-2微型漩渦混勻儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；恒溫水浴振蕩器(江蘇金壇市中壇儀器廠)；HH-S8數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)；索式抽提器(華東器化玻)；WK-1000A高速藥物粉碎機(jī)(青州市精誠(chéng)機(jī)械有限公司)；均質(zhì)機(jī)(南京以馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司)；RE-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化學(xué)儀器廠).

乙腈、甲醇、丙酮、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)均為分析純，購(gòu)于上海國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司.2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D,95%)購(gòu)于湖北遠(yuǎn)成賽創(chuàng)科技有限公司；4-氯苯氧異丁酸(體積分?jǐn)?shù)98%)，購(gòu)于上海思域化工科技有限公司；二氯吡啶酸(體積分?jǐn)?shù)99%)、毒莠定(體積分?jǐn)?shù)99%)購(gòu)于利爾化學(xué)；大米、面粉、燕麥片購(gòu)于鎮(zhèn)江市旅游超市；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水，電阻率為182 kΩ·m.

1.2 樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取粉碎(面粉除外)至149 μm目的樣品5×4.0000 g，分置于5個(gè)50 mL聚四氟乙烯(PTFE)離心管中，分別加入15 mL乙腈-水(2∶1,體積比)、2.5 g氯化鈉，均質(zhì)5 min后于恒溫水浴振蕩器中振搖30 min.取上清液，向殘?jiān)性俑骷尤?5 mL乙腈-水(2∶1,體積比)重復(fù)上述操作，合并上清液于分液漏斗中振搖3 min，靜置后收集乙腈層于40 ℃下旋蒸至干，然后用少量乙腈溶解，以20 mmol/L磷酸鹽緩沖液定容至1 mL待用.

精密稱取的一定量的2,4-D、4-氯苯氧異丁酸、毒莠定、二氯吡啶酸分別溶解于少量乙腈中，用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液定容至1 mL，獲得質(zhì)量濃度為5～200 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列.

1.3 電泳條件

運(yùn)行緩沖液含20 mmol/L磷酸鹽，60 mmol/L SDS，pH為7.5；以3.5 kPa壓力進(jìn)樣200 s；富集電壓為-20 kV，當(dāng)電流恢復(fù)至分離電流的95%時(shí)，電壓轉(zhuǎn)為20 kV，開(kāi)始分離；分離溫度為25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm.

新毛細(xì)管使用前依次用甲醇、水、1 mol/L HCl、水、1 mol/L NaOH、水活化5 min.每天實(shí)驗(yàn)前依次用0.1 mol/L NaOH、水、運(yùn)行緩沖液洗10 min平衡毛細(xì)管.2次運(yùn)行間依次用0.1 mol/L NaOH、水、運(yùn)行緩沖液對(duì)毛細(xì)管平衡3 min.

2 結(jié)果

2.1 緩沖液參數(shù)的優(yōu)化

緩沖液pH可通過(guò)影響管壁與分析物的電荷而影響分析物的遷移行為，電解質(zhì)濃度則可通過(guò)影響EOF對(duì)分離產(chǎn)生影響.在pH 6.5～8.5、磷酸鹽濃度10～35 mmol/L內(nèi)的考察結(jié)果表明，在該pH范圍內(nèi)，其取值不影響分析物的基線分離，但磷酸鹽濃度低于20 mmol/L時(shí)2,4-D和4-氯苯氧異丁酸有部分重疊，在20～35 mmol/L內(nèi)都可基線分離；各苯氧酸除草劑的遷移時(shí)間則是在pH7.5時(shí)均最小，而隨磷酸鹽濃度的增加，遷移時(shí)間均逐步增加.綜合考慮，選擇pH7.5和20 mmol/L作為最優(yōu)的pH和磷酸鹽濃度.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SDS膠束的加入可有效改善4種除草劑的峰形，由于峰寬的減小而使其峰高增加.在20～100 mmol/L內(nèi)的考察結(jié)果顯示，在20～60 mmol/L內(nèi)各除草劑峰高隨SDS濃度增大而增加，超過(guò)60 mmol/L時(shí)，峰高基本不變.因此，選擇60 mmol/L為最佳SDS濃度.

2.2 分離電壓的確定

分離電壓可影響分離效率和遷移時(shí)間.在15～25 kV內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，遷移時(shí)間隨電壓升高而縮短，但基線噪聲亦會(huì)隨之增加.在20 kV下各除草劑均有較快分析速度和較大峰高，最終選定分離電壓為20 kV.

2.3 進(jìn)樣時(shí)間的選擇

進(jìn)樣量和壓縮后的樣品區(qū)帶長(zhǎng)度均可受到進(jìn)樣時(shí)間的影響，分離度和富集效果因此會(huì)受到影響.以3.5 kPa分別進(jìn)樣不同時(shí)間，以-20 kV電壓將注入的樣品反推至進(jìn)樣端后用上述優(yōu)化條件分離，結(jié)果如圖1所示.各除草劑峰高隨進(jìn)樣時(shí)間的加大而增加，在超過(guò)200 s后，各峰均出現(xiàn)一定程度的展寬，并且2,4-D和4-氯苯氧異丁酸出現(xiàn)部分重疊，故進(jìn)樣時(shí)間以200 s為宜.

2.4 反向富集電壓的影響

在上述優(yōu)化的進(jìn)樣和分離條件下，在-15～-25 kV內(nèi)考察了反向富集電壓各除草劑峰面積的影響.結(jié)果表明，在-15～-20 kV，各峰面積基本不變；在-20 kV以外，各峰面積隨電壓數(shù)值增加而下降.此外，在考察范圍內(nèi)，隨反向電壓數(shù)值下降，各除草劑出峰時(shí)間逐漸推后.綜合考慮，-20 kV被確定為最優(yōu)的富集電壓.

2.5 富集倍數(shù)

以優(yōu)化的方法分離質(zhì)量濃度均為0.01 mg/L的4種除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)得其各自峰面積為Si；以3.5 kPa×3 s的進(jìn)樣量注射質(zhì)量濃度為30 mg/L的4種除草劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在相同分離條件測(cè)得各自的峰面積為si；富集倍數(shù)fi=(Si/si)/(30/0.01).由此計(jì)算出2,4-D、4-氯苯氧異丁酸、毒莠定、二氯吡啶酸的富集倍數(shù)分別為620、531、569、510.

2.6 工作曲線和方法參數(shù)

在最佳條件下分析了空白樣品溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，4種苯氧酸除草劑在5～200 μg/kg內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系.在1 d內(nèi)重復(fù)5次測(cè)定50 μg/kg的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在3 d內(nèi)分別重復(fù)測(cè)定同樣濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，所得RSD分別為日內(nèi)精密度和日間精密度.標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性動(dòng)態(tài)范圍(LDR)、3S/N的檢出限(LOD)、日內(nèi)和日間精密度如表1所示.

表1 工作曲線,線性范圍,檢出限和精密度Tab.1 Calibration curves,LDRs,LODs and precisions

2.7 樣品及加標(biāo)回收率的測(cè)定

對(duì)市售大米、面粉和燕麥片進(jìn)行了測(cè)定，均未檢出苯氧酸除草劑殘留.為檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性，對(duì)3種糧食樣品分別進(jìn)行了4種除草劑的加標(biāo)回收率測(cè)定，結(jié)果如表2所示.大米樣品和50 μg/kg加標(biāo)大米樣品的電泳圖如圖2所示.加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果表明，方法可滿足中國(guó)、美國(guó)、歐盟、日本等規(guī)定的苯氧酸除草劑MRL要求，可用于糧食中苯氧酸除草劑殘留的測(cè)定.

1. 2,4-D；2. 4-氯苯氧異丁酸；3. 毒莠定；4. 二氯吡啶酸.圖1 進(jìn)樣時(shí)間的影響Fig.1 Effect of injection time

1. 2，4-D；2. 4-氯苯氧異丁酸；3. 毒莠定；4. 二氯吡啶酸.圖2 大米(a)和加標(biāo)大米(b)電泳Fig.2 Electropherography of rice (a) and spkied rice (b)

表2 加標(biāo)樣品回收率

3 討論

4種苯氧酸除草劑在運(yùn)行緩沖液條件下均帶負(fù)電荷.在極性轉(zhuǎn)換大體積樣品推掃毛細(xì)管電泳法中，樣品被盡可能多地注入毛細(xì)管中，然后在毛細(xì)管兩端施加反向電壓，帶負(fù)電的分析物在電場(chǎng)作用下電泳方向朝向檢測(cè)端，但其速率小于電滲流(EOF)，合成運(yùn)動(dòng)朝向進(jìn)樣端.同時(shí)，在EOF的作用下樣品塞中溶劑被朝向進(jìn)樣端的EOF逐步推出毛細(xì)管.當(dāng)電流示值為正常分離電流的95%時(shí)，表明樣品區(qū)帶中的溶劑已基本被排出毛細(xì)管，分析物則在樣品區(qū)與緩沖液區(qū)界面處被膠束推掃而聚集，實(shí)現(xiàn)了在線富集.此時(shí)電壓轉(zhuǎn)向，對(duì)分析物進(jìn)行分離檢測(cè).該富集方法能在保證正常分離的情況下，使毛細(xì)管中容納的樣品量大大增加，有效改善了濃度檢出限，其分離過(guò)程相當(dāng)于以正常小體積進(jìn)樣方式將濃縮了的樣品注入毛細(xì)管后的普通分離模式.加標(biāo)樣品的電泳圖充分展示了本方法優(yōu)勢(shì)，并展現(xiàn)了其在糧食樣品檢測(cè)中的應(yīng)用潛力.

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(責(zé)任編輯：梁俊紅)

Detection of phenoxy acid herbicide residues by micellar electrokinetic chromatography with online preconcentration

CHEN Guanhua,HONG Yueqin,MEI Xiaoyun,ZOU Xuemei,ZHOU Jiawei
(College of Food and Bioengineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

A new micellar electrokinetic capillary chromatography with polarity switching and large sample size was developed to determine phenoxy acid herbicides remained in cereals.The effects of buffer,injection time,separation and enrichment voltage on separation and preconcentration were studied.The optimum buffer was 20 mmol/L phosphate and 60 mmol/L SDS at pH7.5.The separation and enrichment voltages were 20 kV and -20 kV.Sample size was 3.5 kPa×200 s.The enrichment factors were 510-620 and limits of detection 0.20-0.38 μg/kg.The recoveries of spiked cereals were 80.6%-96.7%.The assay can be applied to detect phenoxy acid herbicides remained in cereals.

phenoxy acid herbicide;polarity switching;online enrichment;micellar electrokinetic chromatography

2016-08-20

江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20151338 )；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目

陳冠華(1956- )，男，山西萬(wàn)榮人，江蘇大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，主要從事食品安全檢測(cè)研究. E-mail: chengh@ujs.edu.cn

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.03.004

O657.8

A

1000-1565(2017)03-0243-05