董海鵬，王 石，劉程偉，徐桂超，金 松

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科，黑龍江 佳木斯 154003)

大鼠腹主動(dòng)脈瘤中早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1mRNA表達(dá)水平的研究①

董海鵬，王 石，劉程偉，徐桂超，金 松

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院血管外科，黑龍江 佳木斯 154003)

早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子-1；腹主動(dòng)脈瘤；q-PCR

早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子-1 (Earlygrowthresponse1，Egr-1)是重要的核轉(zhuǎn)錄因子。在調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、發(fā)育、增殖、炎性反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用，并且參與多種動(dòng)脈疾病的發(fā)生和發(fā)展[1,2]。本研究旨在建立大鼠腹主動(dòng)脈瘤(abdominalaorticaneurysm，AAA)灌注模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用q-PCR技術(shù)檢測(cè)Egr-1在正常動(dòng)脈及動(dòng)脈瘤組織中的表達(dá)，以探討其在腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型

雄性SD大鼠20只(遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供)，體重250～300g，動(dòng)物隨機(jī)分為2組：對(duì)照組(正常大鼠腹主動(dòng)脈)，實(shí)驗(yàn)組(彈力蛋白酶灌注)，每組10只。所有的動(dòng)物都根據(jù)中國(guó)現(xiàn)行法律對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理及保護(hù)原則進(jìn)行試驗(yàn)。大鼠經(jīng)3%戊巴比妥鈉麻醉(40mg/kg，腹腔注射)，然后固定在手術(shù)臺(tái)上。切開皮膚及腹壁各層，顯露游離腎下腹主動(dòng)脈和下腔靜脈，于左腎靜脈下方游離長(zhǎng)約1cm的腹主動(dòng)脈主干，與左腎動(dòng)脈開口下方阻斷血流，經(jīng)左側(cè)髂總動(dòng)脈插入導(dǎo)管直至腹主動(dòng)脈上部，結(jié)扎腹主動(dòng)脈分叉上方使其成為一個(gè)內(nèi)含導(dǎo)管的密閉管腔，灌注1mL(20u)彈力蛋白酶持續(xù)灌注 30min。14d后收集標(biāo)本，將標(biāo)本剪碎放入1mLTrizoL并放入-80℃中保存。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

取灌注后的腹主動(dòng)脈用Trizol試劑提取總RNA(Invitrogen)，測(cè)定RNA的純度及濃度用NanoDrop1000 (NanoDrop,Wilmington,DE)。用PrimeScriptTMRT試劑盒，將樣品總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)采用SYBRGreenPCRMasterMix(takara)在ABI7500Real-TimePCRSystem(AppliedBiosystems)中進(jìn)行實(shí)時(shí)定量。循環(huán)參數(shù)如下：95℃變形30s，95℃ 5s，60℃ 30s順序循環(huán)40次。在PCR中使用的引物 ，Egr-1引物：上游引物5’-CAGGAGTGATGAACGCAAGA-3’,下游引物5’-GGGGATGGGTAGGAAGAGAG-3’；β-actin引物：上游引物5’-TGTCACCAACTGGGACGATA-3’，下游引物5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’。測(cè)定目標(biāo)基因的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參，用2-△△CT法測(cè)定目標(biāo)基因的表達(dá)。每個(gè)樣本做三次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠腹主動(dòng)脈瘤模型的建立

腹主動(dòng)脈瘤是指腹主動(dòng)脈呈瘤樣擴(kuò)張，通常直徑增大50%以上定義為動(dòng)脈瘤。根據(jù)測(cè)量腹主動(dòng)脈直徑得出實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物模型均已達(dá)到腹主動(dòng)脈瘤診斷標(biāo)準(zhǔn)(對(duì)照組：1.400±0.033, 實(shí)照組：2.950±0.171,每組10只，P<0.05)。見圖1。

2.2Egr-1mRNA的表達(dá)在腹主瘤中表達(dá)升高

可以看出在腹主動(dòng)脈瘤組中Egr-1mRNA的表達(dá)水平明顯升高，而正常腹主動(dòng)脈中Egr-1mRNA的表達(dá)很低(對(duì)照組：1.026±0.122, 實(shí)驗(yàn)組：6.177±0.721，P<0.05)。見圖2。

圖1 大鼠灌注前后腹主動(dòng)脈瘤的直徑注：對(duì)照組為正常腹主動(dòng)脈直徑，實(shí)驗(yàn)組為灌注后14d直徑P<0.05。

圖2 q-PCR檢測(cè) Egr-1 mRNA的表達(dá)

注：對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(彈力蛋白酶灌注組)(P<0.05)。

3 討論

腹主動(dòng)脈瘤(AbdominalAorticAneurysm,AAA)的發(fā)生發(fā)展過程一直是血管外科研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。許多學(xué)者根據(jù)近年來對(duì)腹主動(dòng)脈瘤發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí),想通過建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,誘導(dǎo)產(chǎn)生與人類腹主動(dòng)脈瘤形成機(jī)理相似的動(dòng)物模型,對(duì)其發(fā)病原因、發(fā)病機(jī)理等表現(xiàn)進(jìn)行進(jìn)一步研究,并進(jìn)一步探索藥物預(yù)防及治療的方法。1990年Aindjar[3]等研究發(fā)現(xiàn)人腹主動(dòng)脈瘤組織中彈力蛋白明顯減少,從而創(chuàng)立了大鼠腎下腹主動(dòng)脈加壓灌注彈力蛋白酶的方法,建立腹主動(dòng)脈瘤動(dòng)物模型。因其具有與人類腹主動(dòng)脈瘤形成有相似的發(fā)病機(jī)制和病理特點(diǎn),現(xiàn)已被廣泛接受。彈力蛋白酶灌注腹主動(dòng)脈瘤的特點(diǎn)是主動(dòng)脈壁的炎癥反應(yīng)炎并產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞和因子如巨噬細(xì)胞，腫瘤壞死因子(TNF-α)[4]，白細(xì)胞介素1(IL-1b),轉(zhuǎn)換生長(zhǎng)因子(TGF-b)，基質(zhì)金屬蛋白酶[5]等。中層平滑肌細(xì)胞減少[6]，細(xì)胞外基質(zhì)的破壞和降解導(dǎo)致動(dòng)脈管腔逐漸擴(kuò)張。

早期生長(zhǎng)反應(yīng)因子1，是一種鋅指狀的早期轉(zhuǎn)錄因子。Egr-1 參與多種病理生理過程如細(xì)胞增殖、分化及凋亡[7]，炎癥反應(yīng)[8]、血栓形成、細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解等。我們的研究結(jié)果表明Egr-1mRNA在腹主動(dòng)脈瘤中表達(dá)升高，可能是Egr-1參與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，細(xì)胞外基質(zhì)降解，平滑肌細(xì)胞的遷移等。Harja[9]研究表明不同周齡的apoE-/-小鼠血管壁中Egr-1表達(dá)情況，而Egr-1的下游炎癥因子的表達(dá)也同步上調(diào)。此外，apoE、Egr-1雙敲除小鼠血管壁中炎性因子明顯減少，提示Egr-1 可能通過調(diào)控其下游炎癥基因的表達(dá)而影響AAA的發(fā)生和發(fā)展。多種因素可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞Egr-1 表達(dá)上調(diào)，不僅促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞自身的增殖分化及遷移，還促使細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶，而細(xì)胞增殖分化和遷移也會(huì)破壞血管壁正常結(jié)構(gòu)促進(jìn)腹主動(dòng)脈瘤的形成。Egr-1還能夠激活MMP-2，與MT1-MMP的表達(dá)相關(guān)，Egr-1可以結(jié)合到MT1-MMP的結(jié)合位點(diǎn)[10]，這些因子的表達(dá)都受Egr-1的調(diào)控，而MMP在細(xì)胞外基質(zhì)的破壞，降解和炎癥反應(yīng)中起重要作用[11]，尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)[12]和基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)[5]。這些因素都可能促進(jìn)腹主動(dòng)脈瘤的形成。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Egr-1mRNA在大鼠腹主動(dòng)脈瘤中大量表達(dá)使Egr-1成為參與腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生發(fā)展過程，說明其與腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，使Egr-1成為防治AAA的新靶點(diǎn)，但其通過何種機(jī)制發(fā)揮作用，尚需進(jìn)一步探討。

[1]LongoGM,XiongW,GreinerTC,etal.Matrixmetalloproteinases2and9workinconcerttoproduceaorticaneurysms[J].JClinInvest, 2002, 110(5): 625-632

[2]CheyouER,YourevaV,SrivastavaAK.Involvementoftheearlygrowthresponseprotein1invascularpathophysiology:anoverview[J].IndianJBiochemBiophys, 2014, 51(6): 457-466

[3]AnidjarS,SalzmannJL,GentricD,etal.Elastase-inducedexperimentalaneurysmsinrats[J].Circulation, 1990, 82(3): 973-981

[4]楊福義,高涵,趙梓涵.TNF-α和sICAM-1在顱內(nèi)動(dòng)脈瘤的表達(dá)[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2016,39(3):53-54

[5]劉傳玉,劉程偉,袁魁,等.MMP_9_TIMP_1在曲張大隱靜脈中的表達(dá)及意義[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2014,37(4)：18-19

[6]LiuY,WangTT,ZhangR,etal.Calorierestrictionprotectsagainstexperimentalabdominalaorticaneurysmsinmice[J].JExpMed, 2016, 213(11): 2473-2488

[7]PagelJI,DeindlE.Earlygrowthresponse1--atranscriptionfactorinthecrossfireofsignaltransductioncascades[J].IndianJBiochemBiophys, 2011, 48(4): 226-235

[8]WangNP,PangXF,ZhangLH,etal.Attenuationofinflammatoryresponseandreductionininfarctsizebypostconditioningareassociatedwithdownregulationofearlygrowthresponse1duringreperfusioninratheart[J].Shock, 2014, 41(4): 346-354

[9]HarjaE,BucciarelliLG,LuY,etal.Earlygrowthresponse-1promotesatherogenesis:micedeficientinearlygrowthresponse-1andapolipoproteinEdisplaydecreasedatherosclerosisandvascularinflammation[J].CircRes, 2004, 94(3): 333-339

[10]HaasTL,StitelmanD,DavisSJ,etal.Egr-1mediatesextracellularmatrix-driventranscriptionofmembranetype1matrixmetalloproteinaseinendothelium[J].JBiolChem, 1999, 274(32): 22679-22685

[11]PafiliK,Gouni-BertholdI,PapanasN,etal.Abdominalaorticaneurysmsanddiabetesmellitus[J].JDiabetesComplications, 2015, 29(8): 1330-1336

[12]王海嬌,李麗疆,宋漢君,等.基質(zhì)金屬蛋白酶-2與2型糖尿病大血管病變的研究進(jìn)展[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué),2013,36(1):83-84

Expression of early growth response factor-1 mRNA in rat abdominal aortic aneurysm (AAA) pathogenesis

DONGHai-peng,WANGShi,LIUCheng-wei,XUGui-chao,JINSong

(Department of Vascular Surgery，The First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi 154003, China)

Egr-1; abdominal aortic aneurysm; Quantitative real-time polymerase chain reaction (q-PCR)

1.國(guó)家自然科學(xué)基金 ，編號(hào)：30801123, 81070254；2.教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金，編號(hào)：教外司留【2014】1685 號(hào)。

董海鵬(1990～)男，黑龍江尚志人，在讀碩士研究生，醫(yī)師。

劉程偉(1976～)男，黑龍江佳木斯人，博士，副主任醫(yī)師，副教授，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：liucwcw@163.com。

R

A

1008-0104(2017)02-0001-02

2016-07-20)