孟慶哲，薛 宇，韓靜嬡，張芮瑞，薛 琳，姜婷婷，趙雨晴

(1.佳木斯大學口腔醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154002;2.佳木斯大學臨床醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154003)

阿那曲唑與格列本脲對子宮內(nèi)膜異位癥細胞凋亡的影響①

孟慶哲1，薛 宇1，韓靜嬡1，張芮瑞2，薛 琳2，姜婷婷1，趙雨晴1

(1.佳木斯大學口腔醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154002;2.佳木斯大學臨床醫(yī)學院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：阿那曲唑與格列本脲對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠細胞凋亡的影響和作用。方法：采用人工誘導建立子宮內(nèi)膜異位癥大鼠模型，實驗檢測阿那曲唑與格列本脲治療子宮內(nèi)膜異位癥大鼠前后病灶部位體積變化及雌性激素合成相關蛋白表達，子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠隨機分為阿那曲唑組與格列本脲組，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠子宮內(nèi)膜細胞提取體外培養(yǎng)，阿那曲唑與格列本脲不同濃度處理體外培養(yǎng)細胞觀察對增殖能力和細胞凋亡影響。運用ONN法檢測細胞增殖能力和流式細胞術分析細胞周期分布和凋亡情況。結(jié)果：阿那曲唑與格列本脲處理子宮內(nèi)膜異位癥大鼠后，病灶部位減小明顯，抑制雌激素相關蛋白表達，影響體外培養(yǎng)細胞增殖能力與周期及凋亡。結(jié)論：阿那曲唑比格列本脲對雌激素相關蛋白表達影響大；格列本脲比阿那曲唑?qū)毎芷谟绊懘蟆?/p>

阿那曲唑;格列本脲;子宮內(nèi)膜異位癥;細胞凋亡; 影響

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)是有活性內(nèi)膜細胞種植在子宮內(nèi)膜以外位置形成常見婦科疾病。子宮內(nèi)膜異位癥治療因病情輕重，患者年齡和生育情況有所不同[1]。常用治療方法有：1.藥物治療：①假孕療法。②假絕經(jīng)療法。2. 手術療法：①半保守手術。②根治性手術。③腹腔鏡手術和GnRHa藥物結(jié)合。子宮內(nèi)膜異位癥是一種依賴雌性激素疾病，由于子宮內(nèi)膜異位癥患者需要長期服用激素，對患者心理與生理造成較大影響，子宮內(nèi)膜異位癥近年來患病率呈上升趨勢[2]。子宮內(nèi)膜異位癥主要采用保守藥物治療，激素藥物降低患者雌性激素水平來進行治療。以往臨床傳統(tǒng)治療具有顯著療效是降低雌性激素水平，臨床上有出現(xiàn)嚴重不良反應病例，所以長期控制和治療建議不采用激素藥物方法[3]。子宮內(nèi)膜異位癥手術療法臨床觀察術后復發(fā)率有 47.65%。子宮內(nèi)膜異位癥臨床治療中迫切尋找不良反應少與復發(fā)率低且療效滿意治療手段。

阿那曲唑(AnastrozoleTablets)(瑞婷、瑞寧得)是非甾體類芳香化酶抑制劑。阿那曲唑主要是降低血漿雌激素水平，具有抑制乳腺腫瘤生長作用。臨床主要應用在絕經(jīng)后婦女輔助乳腺癌晚期治療[4]。

格列本脲主要應用非胰島素依賴型糖尿病針對飲食控制療效不滿意患者，患者β胰島細胞能分泌一定胰島素沒有嚴重并發(fā)癥，患者應用格列本脲可以降低空腹和餐后血糖。為了探索阿那曲唑和格列本脲對子宮內(nèi)膜異位癥藥理學作用機理，本研究應用EMS大鼠進行細胞體外培養(yǎng)實驗，探索研究阿那曲唑和格列本脲治療子宮內(nèi)膜異位癥的藥理學作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

主要試劑：阿那曲唑片(瑞婷)(規(guī)格：1mg，重慶華邦制藥有限公司，國藥準字H20020194)；格列本脲片(規(guī)格：2.5mg，山西云鵬制藥有限公司，國藥準字H14020780)。主要儀器：LSRFortessa流式細胞分析儀 ( 美國BDBiosciences)；PWT型電熱恒溫培養(yǎng)箱 (合肥華德利科學器材有限公司)；CTK120自動脫帽離心機 (湘儀離心機儀器有限公司)；RT-6000自動酶標儀(美國雷杜Rayto)[5]。

1.2 實驗動物模型制備及診斷 1.2.1 實驗動物

SPF級性成熟雌性未受孕大鼠 40 只，體質(zhì)量(200±20)g，佳木斯大學實驗動物中心提供。22～24℃、相對濕度50%～60%，飼養(yǎng)于佳木斯大學實驗動物中心動物飼養(yǎng)室。

1.2.2 子宮內(nèi)膜異位癥大鼠動物模型制備與診斷

①子宮內(nèi)膜異位癥大鼠動物模型制備:SPF級性成熟雌性未受孕大鼠40只，每日陰道涂片定時檢查，進行大鼠動情期規(guī)律統(tǒng)計，選擇有規(guī)則動情周期，且連續(xù)正常兩個動情周期大鼠，在第3個動情期參照文獻[6]方法人工誘導EMS大鼠模型，建模過程進行剖腹與移植及縫合。

②子宮內(nèi)膜異位癥大鼠動物模型診斷標準:人工建立大鼠模型后第4周在動情期第2次剖腹。EMS診斷標準：參照文獻[7]診斷標準：人工建模子宮內(nèi)膜移植部分明顯增大體積，呈結(jié)節(jié)狀或囊狀透明或半透明其內(nèi)部有液體，表面有增生結(jié)締組織并且有血管分布。

1.3 子宮內(nèi)膜異位癥大鼠分組及給藥

子宮內(nèi)膜異位癥動物模型大鼠40只，隨機分為格列本脲(1mg·kg-1) 組和阿那曲唑(1mg·kg-1)組，每組20只，均灌服阿那曲唑、格列本脲藥物，灌服3 周后頸動脈穿刺大鼠全部處死。阿那曲唑、格列本脲藥物治療前后，檢測阿那曲唑組和格列本脲組病灶體積、體外培養(yǎng)細胞增殖和凋亡等情況。

1.4 子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶組織細胞分離及藥物處理

①子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶組織細胞分離體外培養(yǎng):子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶組織位置選取，病灶組織提取細胞體外培養(yǎng)分離。選取子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶組織剪成若干小塊，應用胰蛋白酶溶液消化30min然后加入胎牛血清終止。采用離心機離心細胞沉淀收集，細胞培養(yǎng)在10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基放在細胞培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)過夜，24h后換新培養(yǎng)基。

②子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶組織體外培養(yǎng)細胞藥物處理:阿那曲唑組和格列本脲組兩組藥物處理分離體外培養(yǎng)細胞，阿那曲唑組和格列本脲組細胞分別用0、10、100、1000μmol·L-1阿那曲唑或格列本脲處理72h。MTT法在處理過程中檢測細胞活力。其中48h后細胞周期分布、凋亡、Bax(促凋亡蛋白)和Bcl-2(抑凋亡蛋白)表達用LSRFortessa流式細胞分析儀檢測。

1.5 子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶組織體外培養(yǎng)細胞周期檢測

阿那曲唑組和格列本脲組藥物處理72h后，收集阿那曲唑組和格列本脲組細胞。經(jīng)過PBS洗滌用細胞周期檢測試劑盒進行細胞染色，然后用LSRFortessa流式細胞分析儀進行細胞周期分布分析。

1.6 子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶組織體外培養(yǎng)細胞凋亡檢測

阿那曲唑組和格列本脲組藥物處理72h后，收集兩處理組細胞。細胞染色應用細胞凋亡檢測試劑盒，細胞凋亡分析用LSRFortessa流式細胞分析儀。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0 軟件進行數(shù)據(jù)計量資料計算，采用t檢驗，P<0.05具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 阿那曲唑和格列本脲治療子宮內(nèi)膜異位癥大鼠前后病灶體積比較

子宮內(nèi)膜異位癥大鼠癥狀主要表現(xiàn)為異位病灶病理性增殖，病灶體積改變表現(xiàn)在治療效果。經(jīng)過阿那曲唑(1mg·kg-1)、格列本脲(1mg·kg-1)治療3周后，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶體積比治療前均有減小，治療3周后與比治療前對比差異顯著(P<0.05)。阿那曲唑組對比格列本脲組差異不顯著。見表1。

表1 阿那曲唑與格列本脲對EMS大鼠治療 前后病灶平均體積

注：與治療前比較，△P<0.05。

2.2 阿那曲唑和格列本脲治療子宮內(nèi)膜異位癥大鼠體外培養(yǎng)細胞周期的影響

細胞周期分布運用LSRFortessa流式細胞分析儀分析，DNA合成前期細胞比例隨格列本脲濃度升高而上升，DNA合成期細胞比例隨格列本脲濃度升高而下降(P<0.05)。阿那曲唑?qū)NA合成前期細胞和DNA合成期細胞影響差異沒有統(tǒng)計學意義。

表2 阿那曲唑與格列本脲對EMS大鼠體外 培養(yǎng)細胞周期影響

注：與DNA合成前期比較△P<0.05;同濃度組間比較☆P<0.05。2.3 阿那曲唑和格列本脲治療子宮內(nèi)膜異位癥大鼠體外培養(yǎng)細胞凋亡的影響

細胞凋亡應用LSRFortessa流式細胞分析儀分析，體外培養(yǎng)細胞運用阿那曲唑和格列本脲處理，細胞凋亡比例呈現(xiàn)增加顯著，隨阿那曲唑和格列本脲處理濃度增加呈上升趨勢(P<0.05)。Bax和Bcl-2表達檢測結(jié)果顯示：阿那曲唑和格列本脲處理體外培養(yǎng)細胞后，Bax表達水平升高、Bcl-2表達水平降低(P<0.05) 。說明阿那曲唑和格列本脲促進子宮內(nèi)膜異位癥大鼠體外培養(yǎng)細胞凋亡。見表3。

表3 阿那曲唑與格列本脲對EMS大鼠體外 培養(yǎng)細胞凋亡影響

注：蛋白表達免疫印跡法測定。與 0μmol·L-1比較△P<0.05。

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)是婦產(chǎn)科臨床上常見病和多發(fā)病，子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病率近年來有逐漸升高趨勢。目前尚未完全明確子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病機制。世界衛(wèi)生組織目前普遍認為子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病可能與多種因素有關：①種植學說：月經(jīng)血或脫落子宮內(nèi)膜碎片經(jīng)過輸卵管流入腹腔，種植盆腔臟器表層產(chǎn)生EMs病灶；②化生內(nèi)膜：人體漿膜上皮在性腺激素、炎癥、機械因素刺激下轉(zhuǎn)化形成EMs病灶；③良性轉(zhuǎn)移：罕見的發(fā)病原因，主要通過血液循環(huán)或淋巴系統(tǒng)把子宮內(nèi)膜碎屑轉(zhuǎn)移停留在肺部、腦膜、心包、四肢及其他遠端的EMs病灶。④醫(yī)源性的內(nèi)膜移植：剖宮產(chǎn)、刮宮、會陰側(cè)切和人工流產(chǎn)術等人為造成使子宮內(nèi)膜移植到某些部位形成EMs病灶；⑤免疫防御功能缺陷：隨月經(jīng)血逆流至腹腔子宮內(nèi)膜激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)，大量免疫細胞及體液圍殲進行消除，如果此時體內(nèi)免疫功能缺陷會產(chǎn)生EMs病灶；⑥體質(zhì)及遺傳因素：肥胖、超重等體質(zhì)因素及家族遺傳等與EMs發(fā)生有密切關系[8]。

目前，對于子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)發(fā)病原因不明確，研究探討宮內(nèi)膜異位癥病因和機制成為婦科熱點。對于治療子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)過程減少不良反應降低治療后復發(fā)率，也是子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)治療研究中重要內(nèi)容[9]。

本研究以人工誘導大鼠子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS)為實驗模型，經(jīng)過阿那曲唑和格列本脲治療，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠病灶體積變小。阿那曲唑和格列本脲對子宮內(nèi)膜異位癥有療效，阿那曲唑和格列本脲藥物濃度對EMS大鼠內(nèi)膜體外培養(yǎng)細胞增殖能力抑制及凋亡作用呈正比。阿那曲唑有效抑制雌性激素合成雌性激素含量減少。格列本脲對雌性激素合成無影響，子宮內(nèi)膜異位癥大鼠內(nèi)膜體外培養(yǎng)細胞DNA合成期細胞比例和周期格列本脲可抑制。子宮內(nèi)膜異位癥大鼠內(nèi)膜體外培養(yǎng)細胞中凋亡促進蛋白格列本脲可使其增加，導致抑制凋亡蛋白減少。子宮內(nèi)膜異位癥大鼠內(nèi)膜體外培養(yǎng)細胞兩方面(增殖能力、凋亡作用)及抑制雌性激素合成阿那曲唑和格列本脲均有效。阿那曲唑可有效抑制雌性激素合成，格列本脲對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠內(nèi)膜體外培養(yǎng)細胞周期DNA合成期有效[10]。

本研究表明格列本脲和阿那曲唑?qū)τ谥委煷笫笞訉m內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS) 有良好治療效果，大鼠子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS) 細胞體外培養(yǎng)過程抑制作用均有效。阿那曲唑和格列本脲有望解決治療子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS) 過程中易發(fā)不良反應，并為長期預防子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS) 復發(fā)提供更多臨床解決方案。阿那曲唑和格列本脲在治療 子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMS) 臨床應用尚需進一步探討。

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1.黑龍江省大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃，編號：201610222084；2.佳木斯大學大學生科技創(chuàng)新項目，編號：xsyd2016-12；3.佳木斯大學科學技術重點項目，編號：12Z1201508；4.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院院級培育課題，編號：2014；5.黑龍江省教育廳項目，編號：12511570。

孟慶哲(1996～)男，黑龍江佳木斯人，在讀本科生。

薛宇(1988～)女，黑龍江佳木斯人，醫(yī)師。E-mail:xueyu@163.com。

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1008-0104(2017)02-0022-02

2017-01-04)