李 穎，楊佳雯，蘇春陽，余 輝，劉佩勇

(東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院，沈陽 110169)

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土壤中可降解LDPE菌株的分離誘變及相關(guān)研究

李 穎，楊佳雯，蘇春陽，余 輝，劉佩勇

(東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院，沈陽 110169)

聚乙烯塑料由于經(jīng)濟(jì)方便及穩(wěn)定性良好，被廣泛應(yīng)用于國民經(jīng)濟(jì)和人類生活的各個(gè)方面，同時(shí)其也帶來了嚴(yán)重的“白色污染”。本次實(shí)驗(yàn)主要通過采集垃圾場(chǎng)不同深度的塑料袋周圍土壤，并從中分離提取出可降解低密度聚乙烯(LDPE)的菌株，再進(jìn)行誘變處理，經(jīng)過初篩、復(fù)篩后，以特制的堆肥裝置檢驗(yàn)其降解LDPE的能力，最終篩選出降解能力最強(qiáng)的菌株。本次實(shí)驗(yàn)有望發(fā)現(xiàn)并改造出降解LDPE的新型微生物，以期為建設(shè)綠色生態(tài)型社會(huì)提供一定參考。

生物降解；LDPE；土壤菌株；誘變育種；相關(guān)研究

聚乙烯塑料為人類生活中最常見的材料之一，但由于塑料對(duì)化學(xué)試劑和自然環(huán)境中生物攻擊的不敏感性[1]，導(dǎo)致了塑料垃圾的堆積及海洋環(huán)境與土壤環(huán)境的污染[2-4]，帶來了嚴(yán)重危害生態(tài)環(huán)境的“白色污染”。廢棄的聚乙烯得不到有效處理，長期堆積造成的多樣危害性主要體現(xiàn)在“視覺污染”和“潛在污染”上[5]。

長久以來，世界各國都在致力于對(duì)聚乙烯類塑料廢品處理方式的研發(fā)，其中生物降解塑料的研發(fā)更是解決環(huán)境污染問題的關(guān)鍵所在[6]?，F(xiàn)階段，對(duì)生物降解聚乙烯高分子材料的研發(fā)方向重點(diǎn)朝四個(gè)方面拓展[7]。為了更好地處理聚乙烯制品，本實(shí)驗(yàn)研究了具有LDPE降解活力的土壤菌株，并成功從土壤中分離出了兩種可降解LDPE菌株，進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化和突變育種，最終篩選出降解能力最優(yōu)的菌株。這對(duì)于有效處理廢棄聚乙烯高分子材料、實(shí)現(xiàn)碳的循環(huán)利用及改善生態(tài)環(huán)境具有十分重要的意義。

1 材料和方法

1.1 低密度聚乙烯

1.2 土壤樣品采集及土壤稀釋液的制備

從沈陽老虎沖垃圾場(chǎng)取塑料袋表面土層、距土壤表面10 cm、20 cm、30 cm深處的土層一共4份土樣(每個(gè)土層的土樣取3份之后混合)，標(biāo)記深度不同的土樣，用40目的土壤篩處理后，去除雜質(zhì)放入冰箱中保存?zhèn)溆?。取每個(gè)土層的新鮮土樣10 g，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5系列5個(gè)濃度梯度的稀釋液并放于4 ℃的冰箱中保存待用。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理

將LDPE粉末紫外殺菌3 h后，挑取少量滅菌的粉末分別接入牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基中，在37 ℃下培養(yǎng)2 d (28 ℃下培養(yǎng)7 d)檢驗(yàn)消滅真菌的徹底性[8]。

1. 4 可降解聚乙烯土壤菌株的篩選

1.4.1 選擇培養(yǎng)

用三角靶接種四個(gè)土層、10-1～10-5五個(gè)梯度稀釋液在基礎(chǔ)無碳源瓊脂固體培養(yǎng)基[9]，其中每份培養(yǎng)基(pH 7.3)含有0.1 g LDPE粉末(Mw=2 000)，每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)，在37 ℃下培養(yǎng)2 d。選出2個(gè)長勢(shì)較好的菌株，接種到含0.1 g LDPE粉末的基礎(chǔ)無碳源液體培養(yǎng)基中在37 ℃、150 r·min-1下振蕩培養(yǎng)2 d，得到混合液I和II。將混合液I于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 馴化培養(yǎng)

用三角靶蘸取混合液II中的菌液接種于基礎(chǔ)無碳源瓊脂固體培養(yǎng)基(pH 6.0)上，每份培養(yǎng)基中加入0.1 g LDPE粉末，在37 ℃下恒溫培養(yǎng)2 d。再挑取長出的若干菌落分別接種于基礎(chǔ)無碳源液體培養(yǎng)基(pH 6.3)中，每份培養(yǎng)基含0.2 g LDPE粉末，在37 ℃、150 r·min-1的轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)2 d，得到混合液。將所有上面培養(yǎng)得到的混合液統(tǒng)稱為混合液A。蘸取混合液I、混合液A中的菌液接種于基礎(chǔ)無碳源瓊脂固體培養(yǎng)基上，于37 ℃下培養(yǎng)2 d。再在基礎(chǔ)無碳源瓊脂固體培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離純化不同菌株，直至每個(gè)平板上長出單一的優(yōu)勢(shì)菌株。

1.4.3 二次馴化培養(yǎng)

將分離純化后的菌株分別接種于含0.2 g LDPE粉末的50mL基礎(chǔ)無碳源液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下靜置培養(yǎng)2 d，在此期間持續(xù)補(bǔ)充新鮮無菌的培養(yǎng)液。隨后蘸取菌液接種于含0.2 g粉末的基礎(chǔ)無碳源瓊脂培養(yǎng)基中，在37 ℃培養(yǎng)2 d。最后挑取培養(yǎng)基上的菌落接種在馬丁氏瓊脂培養(yǎng)基斜面上，在4 ℃下冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 可能對(duì)菌種產(chǎn)生影響的誘變方式

1.5.1 紫外誘變

紫外誘變需在黑暗中進(jìn)行，其他的操作均在紅光下進(jìn)行。取3 mL二次馴化培養(yǎng)所得的菌懸液于培養(yǎng)皿內(nèi)，照射時(shí)間分別為：10 s、20 s、30 s、40 s、50 s、60 s、70 s、80 s(照射距離20 cm)，每照射10 s后將菌液攪勻，照射時(shí)間累計(jì)。將誘變后的菌懸液避光放置1 h，將放置后的菌液涂布進(jìn)行初篩和復(fù)篩[10]。

1.5.2 微波誘變

誘變時(shí)將二次馴化培養(yǎng)所得的菌懸液試管插入盛有適量冰水的三角瓶里。在無菌條件下，取3 mL菌懸液裝入事先滅菌的試管中并加塞防菌，將盛有冰水的三角燒瓶移入微波爐中進(jìn)行誘變實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)研究誘變功率為700 W的不同誘變時(shí)間(40 s、70 s、100 s、130 s、190 s、250 s)作用下微波對(duì)菌懸液的誘變效果。

1.5.3 鹽酸羥胺誘變

稱取水浴滅菌的鹽酸羥胺，配制0.2 g· L-1、0.4 g· L-1、0.6 g· L-1、0.8 g· L-1、1.0 g· L-1濃度的鹽酸羥胺溶液。取3 mL二次馴化培養(yǎng)所得的菌懸液接入有1%含量的鹽酸羥胺PE液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，利用分光光度計(jì)測(cè)量此培養(yǎng)液在OD260處的光密度值，觀察菌的生長量，確定鹽酸羥胺最佳誘變濃度。

1.5.4 復(fù)合誘變

在確定了單因子誘變的最佳誘變劑量后，先后進(jìn)行鹽酸羥胺-微波復(fù)合誘變、鹽酸羥胺-紫外復(fù)合誘變、微波-紫外復(fù)合誘變。為研究微波誘變和鹽酸羥胺誘變兩種誘變劑作用順序不同對(duì)菌株生長情況的影響，以相同的劑量改變誘變劑作用順序，確定最優(yōu)誘變順序?？紤]到紫外誘變光復(fù)活的可能性較大，故未先進(jìn)行紫外誘變。

1.6 LDPE粉末的降解實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)后的堆肥裝置進(jìn)行LDPE粉末降解能力的測(cè)試。在原有裝置[12]的基礎(chǔ)上，改造成密閉裝置，通過水柱液面變化指示結(jié)束時(shí)間，解決了原裝置堆肥時(shí)間不易確定、CO2來源不明、需要進(jìn)行額外的滴定操作等問題，直接以土壤質(zhì)量的減少量表征篩選菌株對(duì)LDPE粉末的生物降解能力。

準(zhǔn)確稱取滅菌LDPE塑料粉末樣品30 g，按干重比為1∶7加入滅菌后的土壤，加入3 mL二次馴化菌懸液后，混勻裝入容積為500 mL的棕色瓶中，將其置于28 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行堆肥實(shí)驗(yàn)。整個(gè)密閉裝置(見圖1)靠中間的錐形瓶連通，菌株在右側(cè)的土壤中生長繁殖釋放出的CO2用第二個(gè)瓶內(nèi)的NaOH來吸收，進(jìn)而使裝置內(nèi)氣壓減小，左側(cè)導(dǎo)管內(nèi)液面上升，堆肥一定天數(shù)后，觀察到左側(cè)細(xì)口瓶導(dǎo)管中液面無明顯變化即可進(jìn)行取樣分析，回收洗滌聚乙烯粉末，干燥后稱重。

圖1 改進(jìn)后堆肥環(huán)境檢測(cè)菌株對(duì)LDPE粉末的降解能力Fig.1 Degradation ability of improved composting environment detection strains on LDPE powder注：裝置從右至左依次是：500 mL棕色廣口瓶、250 mL錐形瓶和250 mL細(xì)口瓶，均用塞子進(jìn)行密封。其中分別裝有待測(cè)菌懸液及含LDPE土壤、2 mol·L-1NaOH、200 mL無菌水。

2 結(jié)果與分析

2. 1 菌種的提取

經(jīng)過選擇培養(yǎng)、馴化培養(yǎng)和二次馴化培養(yǎng)，初步得到四個(gè)土層、五個(gè)濃度中的菌株在以LDPE粉末為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上的生長情況。經(jīng)過重復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)許多菌株在不同土層和不同濃度均有生長。考慮到菌落的生長情況及分離的難易程度，實(shí)驗(yàn)組選擇從距地表20 cm深處的塑料袋附近土壤樣品分離出的菌株進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，且大部分菌株在土壤懸液稀釋度為10-5時(shí)較易分離提取。

2.2 可降解LDPE土壤菌株的性狀特征

本實(shí)驗(yàn)從土壤樣品中分別成功分離出可在以LDPE粉末為唯一碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長的四種細(xì)菌XA-綠、XA-灰、XI-綠、XI-黑(圖2～圖5)和三種真菌ZI-黑、ZI-粉、ZI-褐(圖6～圖8)。經(jīng)過綜合對(duì)比降解能力后，擇優(yōu)對(duì)其中的兩種菌株(XA-綠菌株及ZI-粉菌株)進(jìn)行研究。

圖2 XA-綠菌株*Fig.2 XA-green strain*

圖3 XA-灰菌株Fig.3 XA-gray strain

圖4 XI-綠菌株Fig.4 XI-green strain

圖5 XI-黑菌株Fig.5 XI-black strain

圖6 ZI-黑菌株Fig.6 ZI-black strain

圖7 ZI-粉菌株*Fig.7 ZI-powder strain*

圖8 ZI-褐菌株Fig.8 ZI-brown strain注：*為所綜合對(duì)比降解能力后，擇優(yōu)選出的菌種。

XA-綠菌株為革蘭氏陽性菌株，菌落呈灰綠色，鏡下觀察營養(yǎng)菌絲產(chǎn)生發(fā)育良好而不易斷裂的有分枝的菌絲體，由氣生孢子發(fā)芽而繁殖。纖細(xì)，為多核菌絲。分離時(shí)菌落分散成地衣狀，發(fā)育后期呈絨毛狀。具有分生孢子梗和孢子的產(chǎn)生。ZI-粉菌株為革蘭氏陽性菌株，菌落表面較干燥前期呈白色，后期呈粉色乃至褐色，有孢子產(chǎn)生。兩種菌株均在28 ℃避光條件下對(duì)LDPE粉末具有降解能力。

2.3 菌株初步鑒定

通過對(duì)菌落形態(tài)以及顯微鏡下對(duì)菌絲和菌絲體形態(tài)的觀察，同時(shí)結(jié)合《伯杰細(xì)菌手冊(cè)》[11]和《真菌鑒定手冊(cè)》[12]的相關(guān)描述，初步確定XA-綠菌株為細(xì)菌界、放線菌門、放線菌綱、放線菌目中的鏈霉菌科中的鏈霉菌屬；ZI-粉菌株為真核生物界、真菌門、子囊菌綱、半子囊菌亞綱中的酵母目。

2.4 誘變對(duì)菌株生長情況的影響

2.4.1 紫外誘變對(duì)菌株生長情況的影響

表1為不同時(shí)間紫外誘變下的菌株生長狀況，由表1可知，ZI-粉菌在紫外誘變40 s和80 s時(shí)所長出的菌落個(gè)數(shù)最多，即生長情況最佳，故初步確定40 s和80 s為ZI-粉菌株最佳紫外誘變劑量，而XA-綠菌株并未見到有菌落生長。

2.4.2 微波誘變對(duì)菌株生長情況的影響

進(jìn)行微波誘變并培養(yǎng)72 h后觀察到結(jié)果如表2所示，分析可知，ZI-粉菌株和XA-綠菌株在微波誘變250 s時(shí)所長出的菌落個(gè)數(shù)最多，即生長情況最佳，故確定250 s為菌株最佳微波誘變劑量。

表1 不同時(shí)間紫外誘變下的菌株生長狀況 培養(yǎng)時(shí)間：72 hTab.1 Growth status of strains under UV induction at different times Culture time:72 h

注:“0、1、2、3”表示長有菌株的培養(yǎng)皿個(gè)數(shù)。

表2 不同時(shí)間微波誘變下的菌株生長狀況 培養(yǎng)時(shí)間:72 hTab.2 Growth status of strains under microwave induction at different times Culture time:72 h

注:“0、1、2、3”表示長有菌株的培養(yǎng)皿個(gè)數(shù)。

2.4.3 鹽酸羥胺誘變對(duì)菌株生長情況的影響

將進(jìn)行鹽酸羥胺誘變后的菌液培養(yǎng)72 h，以其在260 nm處的吸光度值反映菌株的生長情況。由圖9可知，ZI-粉菌株和XA-綠菌株在0.03 g· L-1鹽酸羥胺誘變下的OD260最大，即生長情況最佳，故確定0.03 g· L-1鹽酸羥胺為最佳誘變劑量。同時(shí)分析得出，在0.03 g· L-1鹽酸羥胺誘變下，XA-綠菌株生長狀況優(yōu)于ZI-粉菌株。

圖9 不同濃度鹽酸羥胺誘變下的菌株生長狀況Fig.9 Growth status of strains at different concentrations of hydroxylamine hydrochloride

2.4.4 復(fù)合誘變對(duì)菌株生長情況的影響

根據(jù)單因子誘變所得的生長最優(yōu)菌株，進(jìn)行復(fù)合誘變。以吸光度表征突變株生長情況。由表3可知，先經(jīng)0.03 g· L-1鹽酸羥胺誘變、后經(jīng)250 s微波誘變的ZI-粉菌株和先經(jīng)250 s微波誘變、后經(jīng)0.03 g· L-1鹽酸羥胺誘變的XA-綠菌株OD260值較大，即生長狀況最佳。

表3 復(fù)合誘變吸光度的檢測(cè) 培養(yǎng)時(shí)間：72 hTab.3 Detection of complex induced absorbance Culture time:72 h

注：ND為沒有數(shù)據(jù)，因?yàn)樽贤庹T變下并無XA-綠菌株生長。

2.5 不同誘變方式產(chǎn)生的菌株對(duì)LDPE粉末的降解情況

以粉末的質(zhì)量減少[13]表征菌株對(duì)LDPE的降解能力，由表4可知，ZI-粉菌株比XA-綠菌株降解能力強(qiáng)。單因子誘變后篩選得到的菌株，降解能力只有小幅提升，而先經(jīng)0.03 g· L-1鹽酸羥胺誘變、后經(jīng)250 s微波誘變的XA-綠菌株，相同時(shí)間內(nèi)降解同樣質(zhì)量的LDPE效率提升為出發(fā)菌株的5.75倍。

表4 不同誘變劑處理后的菌株對(duì)LDPE粉末的降解量Tab.4 Degradation of LDPE powders by strains treated with different mutagens

注：1:對(duì)照組；2:紫外40 s；3:紫外80 s；4:微波250 s；5:0.03 g/L鹽酸羥胺；6:微波250 s+0.03 g/L鹽酸羥胺；7:0.03 g/L鹽酸羥胺+微波250 s。

ND為沒有數(shù)據(jù)，因?yàn)樽贤庹T變下并無XA-綠菌株生長。而復(fù)合誘變則根據(jù)菌株生長情況只對(duì)XA-綠菌株進(jìn)行了檢測(cè)，故沒有ZI-粉菌株的相關(guān)數(shù)據(jù)。

3 結(jié)論與展望

本次研究通過對(duì)低密度不含任何添加物的純聚乙烯粉末降解微生物的分離、篩選、鑒定以及其降解特性的研究，最終從垃圾場(chǎng)土壤中分離出了2株低分子量的聚乙烯降解菌，其中ZI-粉屬于真菌門，為真核微生物；XA-綠屬于放線菌門，為原核微生物。分別對(duì)其進(jìn)行誘變選育后，通過堆肥裝置篩選出了高效降解聚乙烯粉末的菌種。綜合比較單一誘變和復(fù)合誘變對(duì)LDPE降解能力的強(qiáng)弱，可知經(jīng)過復(fù)合誘變的XA-綠菌株對(duì)LDPE的降解效率最高，為出發(fā)菌株的5.75倍。

今后的研究中擬采用提取未知菌種基因組的方法，經(jīng)過PCR擴(kuò)增得到16SrRNA，通過16SrRNA測(cè)序，比對(duì)基因庫進(jìn)一步確定未知菌的種屬。此外，經(jīng)過誘變得到的菌株具有更高效的降解能力和區(qū)別于原菌株的形態(tài)學(xué)特征，有望經(jīng)過進(jìn)一步鑒定得到新的菌種。

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Isolation and mutation of degradable LDPE strain in soil and its correlative studies

LI Ying,YANG Jia-wen,SU Chun-yang,YU Hui,LIU Pei-yong

(College of Life Science and Health,Northeastern University,Shenyang 110169,China)

Polyethylene plastic is widely used in all aspects of national economy and human life due to its economic convenience and stability,which has also brought serious “white pollution”. This experiment mainly made the collection of garbage at different depths around the soil,and extracted from degradable low density polyethylene (LDPE) strains,and then made mutagenic treatment to test its ability on the degradation of LDPE with a special composting device,and finally screened the strain with strongest degradation ability. This experiment is expected to discover and transform the new type of microorganism to degrade LDPE,so as to provide some reference for the construction of green ecological society.

Biodegradation; LDPE; Soil strain; Mutagenic breeding; Related research

2016-01-17

本項(xiàng)目來源于東北大學(xué)第十屆大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目：土壤中可降解LDPE菌株的分離誘變及相關(guān)研究(161121)

劉佩勇(1975-)，女，東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院副院長，博士，副教授，e-mail:liupy@mail.neu.cn。

TQ325

A

1674-8646(2017)06-0174-05