徐 博，李 妍，紀(jì)朋艷，齊 玲，路 倩，吳畏難，沈 楠△

(1吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林吉林 132013;2吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗學(xué)院,吉林吉林 132013;3吉林市中心醫(yī)院,吉林吉林 132011)

論著·基礎(chǔ)研究

萱草花黃酮對酒精性肝損傷氧化應(yīng)激及肝細(xì)胞凋亡機制的探討*

徐 博1，李 妍2，紀(jì)朋艷1，齊 玲1，路 倩1，吳畏難3，沈 楠1△

(1吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林吉林 132013;2吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗學(xué)院,吉林吉林 132013;3吉林市中心醫(yī)院,吉林吉林 132011)

目的 探討萱草花黃酮對急性酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。方法 40只小鼠分為4組，分別為空白對照組、模型對照組和萱草花黃酮低、高劑量組，每組各10只。連續(xù)灌胃給藥7 d，末次給藥1 h后，造模組小鼠一次性灌胃50%乙醇12 mL/kg，空白對照組給予同體積蒸餾水。測定各組小鼠血清中天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)活性；肝組織勻漿超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)水平；HE染色觀察肝臟病理學(xué)改變；利用流式細(xì)胞儀檢測肝細(xì)胞懸液中細(xì)胞凋亡率；Western blot檢測肝細(xì)胞caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)。結(jié)果 萱草花黃酮各組可降低血清AST、ALT活性；還可降低肝組織勻漿MDA水平，提高SOD的活性；肝組織病理學(xué)檢查可見，萱草花黃酮高劑量組可使肝細(xì)胞變性、壞死的程度明顯減輕，緩解肝組織的病理學(xué)改變；與模型組比較，萱草花黃酮各組肝細(xì)胞的凋亡率均有明顯下降；Western blot結(jié)果顯示萱草花黃酮各組caspase-3蛋白水平降低，Bcl-2蛋白表達(dá)增加，而Bax蛋白表達(dá)減少，Bax/Bcl-2比值降低。結(jié)論 萱草花黃酮對小鼠急性酒精性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用并且能夠抑制肝細(xì)胞凋亡，其作用機制可能與其抗氧化作用及調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bcl-2和Bax的表達(dá)有關(guān)。

萱草花黃酮；肝疾病,酒精性；抗氧化；細(xì)胞凋亡

目前，酒精依賴與酒精濫用已經(jīng)成為我國乃至世界備受關(guān)注的重大問題。長期大量或短期過量飲酒可導(dǎo)致酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD) 的發(fā)生，此病初期通常表現(xiàn)為脂肪肝，進(jìn)而依次發(fā)展為酒精性肝炎、肝纖維化及肝硬化，嚴(yán)重酗酒時可誘發(fā)廣泛肝細(xì)胞壞死甚至肝衰竭[1-2]。多項實驗研究表明，肝細(xì)胞凋亡是ALD發(fā)生發(fā)展的一項重要原因[3]。萱草花的主要藥理作用是鎮(zhèn)靜安神,也具有抗抑郁等作用[4]，但其中萱草花黃酮對急性酒精性肝損傷的研究卻少見報道。本文擬探討萱草花黃酮是否對小鼠急性酒精性肝損傷肝細(xì)胞的凋亡具有干預(yù)作用，為中醫(yī)中藥防治急性ALD的臨床應(yīng)用提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物 清潔級健康小鼠40只,雌雄各半，購于吉林大學(xué)實驗動物中心，許可證號SCXK(吉)：2010-0005。飼料充足，飲水不限，室溫20～25 ℃，適應(yīng)環(huán)境3 d后使用。

1.2 材料及設(shè)備 萱草花黃酮(濃度為1.816 mg/mL,由吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院提取)、無水乙醇(純度99.7%，天津市永大化學(xué)試劑有限公司，批號：20130902)，使用時用生理鹽水溶解至相應(yīng)濃度?？捡R斯亮藍(lán)試劑盒、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(中國南京建成生物工程研究所)，Annexin-V-GFP 凋亡檢測試劑盒(南京基凱生物技術(shù)有限公司)，β-Actin、caspase-3、Bcl-2和Bax抗體(北京中杉公司)。BA300數(shù)碼生物顯微鏡(中國麥克奧迪實業(yè)集團(tuán)有限公司)，TD5A臺式低速離心機(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司)，722可見光分光光度計(上海欣茂儀器有限公司)，流式細(xì)胞儀為EPICS-XL型(美國貝克曼公司)。

1.3 方法[5-7]

1.3.1 動物分組與處理 清潔級小鼠40只，體質(zhì)量20～30 g，將其分為空白對照組(A組)、模型組(B組)、萱草花黃酮低劑量(0.908 mg/mL)組(C組)、萱草花黃酮高劑量(1.816 mg/mL)組(D組)各10只。灌胃給藥預(yù)處理7 d，末次給藥1 h后，B、C、D組小鼠給予50%乙醇12 mL/kg一次性灌胃制備肝損傷模型，A組給予同體積蒸餾水，各組灌胃體積均為0.1 mL/10 g。在全部小鼠末次給藥禁食禁水12 h后采集標(biāo)本。

1.3.2 指標(biāo)測定 小鼠造模12 h后摘眼球取血，每只小鼠約取血0.8～1.0 mL，分離血清，-80 ℃凍存。小鼠經(jīng)斷髓處死后，迅速取肝臟，冷生理鹽水中洗凈血液，將肝左葉用濾紙吸干后在同一部位取下并置于10%中性福爾馬林中固定，待做病理。取肝組織50 mg，加入9 倍量的冷生理鹽水中制成10%肝組織勻漿，離心后取上清液待測。按試劑盒說明書進(jìn)行ALT、AST、SOD、MDA檢測。

1.3.3 肝臟病理檢測 上述肝組織經(jīng)10%甲醛溶液固定后，石蠟包埋，切片厚5 μm。常規(guī)HE染色后于顯微鏡下觀察、拍照。

1.3.4 細(xì)胞凋亡分析 將肝組織研碎，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌2次，用結(jié)合緩沖液調(diào)至濃度為3×108/mL的細(xì)胞懸液，取200 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入 5 μL Annexin-V-GFP 工作液，室溫下避光30 min；結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞 2 次，300 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后，加入碘化丙啶(PI)溶液5 μL混勻，隨后立即用流式細(xì)胞儀分析。

1.3.5 Western blot 檢測肝組織中caspase-3、Bcl-2和Bax表達(dá) 取肝組織,勻漿、提取總蛋白。加入 SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜,封閉，抗caspase-3、Bcl-2和Bax的一抗分別1∶1 000稀釋,4 ℃孵育過夜,HRP 二抗孵育1 h,洗膜3次后曝光顯影,實驗組的表達(dá)水平與對照組相比為相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 萱草花黃酮對酒精性肝損傷小鼠血清中ALT、AST活力的影響 結(jié)果表明，B組ALT、AST 的酶水平與A組相比均明顯升高(P<0.01)，說明肝細(xì)胞受損，顯示造模成功。C、D組血清 ALT、AST 水平與B組相比均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠血清中ALT、AST水平比較

a：P<0.01，與A組比較；b：P<0.05，與B組比較。

2.2 萱草花黃酮對酒精性肝損傷小鼠肝組織勻漿中MDA、SOD水平的影響 結(jié)果表明，造模后B組肝臟SOD水平顯著低于A組，MDA水平高于A組(P<0.05)，提示造模成功。C、D組小鼠肝臟的SOD水平較B組顯著增加，MDA水平明顯遞減(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 各級小鼠肝勻漿中MDA、SOD水平比較

a：P<0.05，與A組比較；b：P<0.05；c：P<0.01，與B組比較。

2.3 萱草花黃酮對酒精性肝損傷肝臟病理形態(tài)的影響 光鏡下，A組小鼠肝小葉和胞核結(jié)構(gòu)較清晰；B組肝小葉內(nèi)肝竇變窄，大部分肝細(xì)胞發(fā)生水腫變性，并可見點狀壞死及炎細(xì)胞浸潤；與B組比較，C、D組肝細(xì)胞水腫、變性、壞死減輕，病理改善明顯，以D組為著，見圖1。

2.4 萱草花黃酮對酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀分析見圖2，左下和右下象限分別代表活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞的百分率。結(jié)果表明，A、B、C、D組早期肝細(xì)胞凋亡率(%)分別為：1.57±0.52、16.86±1.99、4.05±0.11、3.38±0.15。與A組比較，B組發(fā)生明顯凋亡(P<0.01)，與B組比較，C、D組可明顯抑制細(xì)胞凋亡(P<0.01)。

A:A組；B:B組；C:C組；D:D組。

圖1 各組小鼠肝臟病理形態(tài)的影響(×200)

A:A組；B:B組；C:C組；D:D組。

圖2 各組小鼠肝細(xì)胞凋亡的影響

a：P<0.01，與A組比較；b：P<0.05，c：P<0.01，與B組比較。

圖3 各組小鼠肝細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

2.5 萱草花黃酮對急性酒精性肝損傷小鼠肝細(xì)胞凋亡蛋白caspase-3、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響 Western blot可見(圖 3、4),B組caspase-3和Bax表達(dá)顯著增加(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少;與B組相比,D組caspase-3和Bax表達(dá)顯著降低 (P<0.01)，Bcl-2表達(dá)明顯升高(P<0.05)，Bax/Bcl-2比值顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 各組小鼠肝細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)(Western blot)

3 討 論

飲酒時間長或過量飲酒均可導(dǎo)致ALD的發(fā)生。乙醇進(jìn)入體內(nèi)后主要在肝臟代謝，可引起肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，使肝細(xì)胞膜及細(xì)胞器結(jié)構(gòu)遭到破壞從而引起代謝和功能方面的障礙[8-9]。如何能利用我國中藥資源開發(fā)解酒保肝的藥物及保健品已受到廣泛關(guān)注。本實驗采用一次性給予大量乙醇灌胃的方法建立小鼠急性酒精性肝損傷模型，與人類一次性大量飲酒導(dǎo)致的肝損傷類似。

ALT與AST是肝細(xì)胞損害的敏感指標(biāo)，也是乙醇所致肝損傷最敏感的標(biāo)志。當(dāng)肝細(xì)胞受損傷時，存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)的ALT與AST可進(jìn)入血中，引起血清中二者水平升高，可認(rèn)為其水平反映了肝細(xì)胞損傷程度[10-12]。在本研究中，乙醇灌注造模導(dǎo)致AST和ALT迅速增加，這表明肝細(xì)胞膜受到損傷。萱草花黃酮各組均能抑制乙醇引起的血清中AST、ALT的上升(表1)，從而減輕小鼠肝細(xì)胞的損傷程度,這表明其對肝細(xì)胞膜有保護(hù)、修復(fù)和穩(wěn)定作用。

由肝組織勻漿指標(biāo)的比較可見，模型組小鼠肝臟MDA水平顯著高于正常對照組，SOD活力明顯降低，表明肝臟損傷時肝內(nèi)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強而抗氧化反應(yīng)酶活性減低;而給予萱草花黃酮的高、低兩個劑量組肝功能指標(biāo)均有不同程度的改善，其中D組在對MDA的抑制作用方面和SOD活力升高方面尤其明顯(表2)，可見萱草花黃酮可以顯著提高肝臟SOD活性，降低MDA水平，增強機體清除自由基的能力，減輕其對小鼠肝臟的損害[13]，但仍需實驗進(jìn)一步證實。

病理實驗結(jié)果顯示，模型組小鼠肝小葉內(nèi)肝竇變窄，大部分肝細(xì)胞發(fā)生水腫變性，并可見點狀壞死及炎細(xì)胞浸潤，可能是酒精對肝組織造成了一定的肝損傷;與B組比較，各給藥組病理改善明顯，細(xì)胞水腫、變性、壞死程度明顯減輕，以D組改善顯著(圖1)。

凋亡是指在生理或病理信號刺激下，細(xì)胞啟動自身凋亡基因發(fā)生的主動自殺行為，涉及一系列基因的激活與表達(dá)，近期研究表明乙醇是肝細(xì)胞的一種凋亡誘導(dǎo)劑，細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是引發(fā)ALD的主要機制[14]。caspase是一個在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用的酶家族，在本研究中對caspase-3的活性進(jìn)行了檢測,它是內(nèi)源性和外源性凋亡信號通路共同活化的關(guān)鍵酶[15]。實驗結(jié)果顯示,與A組相比,乙醇灌胃12 h后，caspase-3活性明顯升高,即反映了肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bcl-2和Bax是主要的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因，Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡，Bax促發(fā)細(xì)胞凋亡，Bcl-2與Bax的比例決定細(xì)胞凋亡是否發(fā)生[16-17]。本實驗結(jié)果顯示(圖2、3和表3)，與A組比較，模型小鼠出現(xiàn)了明顯的肝組織損傷和細(xì)胞凋亡。與B組比較，D組都能顯著減少肝細(xì)胞早期凋亡百分?jǐn)?shù)和caspase-3、Bax蛋白的表達(dá)(P<0.01)；顯著增加小鼠肝細(xì)胞Bcl-2蛋白的表達(dá)(P<0.05)；Bax/Bcl-2比值顯著降低(P<0.05)。提示萱草花黃酮對減輕肝細(xì)胞變性、壞死等損傷性變化，減少肝細(xì)胞凋亡具有重要作用，其抗凋亡機制可能與上調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達(dá)，下調(diào)促凋亡蛋白Bax蛋白，降低Bax/Bcl-2二者的比值，抑制caspase-3等途徑有關(guān)[18-21]，從而降低了乙醇對細(xì)胞的促凋亡作用。結(jié)果表明，D組對乙醇所致小鼠急性肝損傷具的保護(hù)作用機制可能與調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白caspase-3、Bcl-2和Bax的表達(dá)有關(guān)。

本研究進(jìn)一步證明氧化應(yīng)激和肝細(xì)胞凋亡與急性酒精性肝損傷的發(fā)病機制有關(guān)，并且也說明萱草花黃酮具有增強內(nèi)源性氧自由基清除系統(tǒng)和抑制肝細(xì)胞凋亡的功能，它對乙醇導(dǎo)致的急性肝損傷具有保護(hù)作用。

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Study on mechanism of total flavonoids from hemerocallis fulva on oxidative stress and hepatocyte apoptosis in alcoholic liver injury*

XuBo1,LiYan2,JiPengyan1,QiLing1,LuQian1,WuWeinan3,ShenNan1△

(1.BasicMedicalCollegeofJilinMedicalCollege,Jilin,Jilin132013,China;2.CollegeofClinicalLaboratory,JilinMedicalCollege,Jilin,Jilin132013,China;3.JilinMunicipalCentralHospital,Jilin,Jilin132011,China)

Objective To study the influence of total flavonoids of hemerocallis fulva(TFHF) on hepatocyte apoptosis and related protein expression in mice with alcoholic hepatic injury.Methods A total of 40 mice were randomly divided into four groups:blank control,model control and small and high dose TFHF groups,10 cases in each group.The mice were given the continuous gavage administration for 7 d.Then the model group was given once gavage by 50% ethanol 12.0 mL/kg after 1 h of the last administration.The blank control group was given the equal volume of distilled water.The activity levels of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in serum as well as the superoxide dismutase(SOD) activity and malondialdehyde (MDA) content in liver tissue hemogenate were detected.Hematoxylin and Eosin(HE) staining was performed for observing the pathological changes of the liver tissue.The flow cytometer was used to test the apoptosis ratio in hepatocyte suspension.The expressions of caspase-3,Bcl-2 and Bax protein were detected by Western blot.Results The various TFHF groups could decrease the activities of ALT and AST in serum (P<0.05),while could decrease the MDA content in liver tissue hemogenate (P<0.01) and increased the SOD activity ;the liver tissue pathological examination showed that the high dose TFHF group could make the liver cell degeneration,alleviated the necrosis degree and relieved the pathological change of hepatic tissue;compared with the model group,the hepatocyte apoptosis rate in each TFHF group was decreased significantly;Western blotting results showed that the caspase-3 protein level in each TFHF group was decreased,expression of Bcl-2 protein was increased,whereas which of Bax protein was decreased and Bax/Bcl-2 ratio was reduced.Conclusion TFHF has obvious protective effect on mice acute hepatic injury induced by ethanol,and can inhibit the hepatocyte apptosis,its action mechanism may be related to its antioxidation and regulation of caspase-3,Bcl-2 and Bax expression.

flavonoids of hemerocallis fulva;liver disease,alcoholic;antioxidation;apoptosis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.10.003

吉林省教育廳基金資助課題(2013359)；吉林省科技廳發(fā)展計劃項目(20140203012YY)。 作者簡介：徐博(1984-)，實驗師，碩士，主要研究領(lǐng)域為中藥藥理學(xué)。△

，E-mail：86027640@qq.com。

R285.5

A

1671-8348(2017)10-1304-04

2016-11-18

2017-01-22)