趙二川，李紅梅，任智晶，何宇晴，王明珠，葉震旋，周雯婧，張 華△

(1.貴州醫(yī)科大學臨檢教研室，貴陽 550004；2.貴州省人民醫(yī)院檢驗科，貴陽 550002；3.貴陽護理職業(yè)學院檢驗系，貴陽 550081)

CD4+T細胞中IL-18激活的NF-κB信號通路與PBC發(fā)病機制的相關性研究*

趙二川1，李紅梅2，任智晶2，何宇晴2，王明珠3，葉震旋2，周雯婧2，張 華2△

(1.貴州醫(yī)科大學臨檢教研室，貴陽 550004；2.貴州省人民醫(yī)院檢驗科，貴陽 550002；3.貴陽護理職業(yè)學院檢驗系，貴陽 550081)

目的 探討白細胞介素(IL)-18及其活化的CD4+T細胞中核轉錄因子kappa B(NF-κB)信號通路與原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)發(fā)病機制的相關性。方法 采用熒光定量PCR、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、流式細胞術、免疫磁珠分選及細胞培養(yǎng)、Western bolt等方法，分別檢測貴州省人民醫(yī)院32例PBC患者(PBC組)及32名健康人(健康對照組)外周血單個核細胞IL-18 mRNA、血漿IL-18、CD4+T細胞表面IL-18Rα、CD4+T細胞增殖率及其NF-κB信號通路中IκBα及NF-κB p65蛋白。結果 PBC組血漿中IL-18水平明顯高于健康對照組(P<0.05)；PBC組IL-18 mRNA的相對表達量較健康對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。PBC組表達IL-18R的CD4+T細胞百分率高于健康對照組(P<0.05)。經IL-18刺激PBC組CD4+T細胞增殖率明顯高于健康對照組(P<0.01)。給予IL-18刺激后，各組中IκBα蛋白相對表達量相均有所下降、NF-κB p65蛋白相對表達量均有所上調，且PBC組更加明顯(P<0.01)。結論 IL-18通過激活CD4+T細胞中NF-κB信號通路參與PBC的發(fā)病。

肝硬化，膽汁性；T淋巴細胞；抗原，CD4；白細胞介素18；原發(fā)性膽汁性肝硬化；NF-κB信號通路

原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是自身免疫性肝病(autoimmune liver diseases，AILD)中最常見的一種，以肝臟門脈周圍淋巴細胞浸潤、膽管上皮細胞特異性損傷及血清中出現(xiàn)高滴度抗線粒體抗體(anti-mitochondrial antibody，AMA)為特征。其病因及發(fā)病機制尚不完全清楚，可能與遺傳易感性及環(huán)境等因素有關[1]。熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)是惟一被美國肝病學會、食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準的用以治療PBC的藥物，可以延長疾病早期患者的生存期，但仍有約40%的患者對其應答欠佳[2]，最終需要肝移植。白細胞介素(IL)-18是一種來源于單核巨噬細胞的細胞因子，為IL-1家族成員，通過與IL-18受體(IL-18R)結合發(fā)揮其生物學功能[3]，IL-18Rα亞單位在應答中起關鍵作用。研究表明，IL-18參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎、原發(fā)性干燥綜合征等自身免疫病的發(fā)病，但IL-18與PBC發(fā)病機制的研究國內尚鮮見報道[4-5]。IL-18在體內可激活多條細胞信號轉導途徑，核轉錄因子kappa B(NF-κB)信號通路就是其中之一。NF-κB信號通路被報道證實與多種自身免疫病的發(fā)病機制相關，但其是否與PBC的發(fā)病機制有關聯(lián)目前暫未見報道。本課題擬通過檢測PBC患者外周血IL-18相關指標，并通過檢測IL-18刺激PBC患者CD4+T細胞的增殖變化及NF-κB信號通路的激活狀態(tài)，探討IL-18介導的免疫炎癥反應及其相關NF-κB信號通路在PBC發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年11月至2016年3月貴州省人民醫(yī)院門診及住院PBC患者32例為PBC組，其中男9例，女23例，符合美國肝病學會(AASLD)于2009年推薦的診斷標準[6]。選擇2014年11月至2016年3月期間該院體檢健康人32例為健康對照組，其中男8例，女24例。年齡、性別與PBC組相匹配。排除標準：肝內外局灶性病變或梗阻，原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)或自身免疫性肝炎(AIH)，病毒性、酒精性、藥物性或妊娠相關性肝病，合并其他自身免疫性、系統(tǒng)性疾病致肝臟受累等疾病。所有患者均知情同意。

1.2 材料與試劑 逆轉錄試劑盒及Tiangen SYBR GreenⅠ染料試劑盒購自北京天根公司；PCR引物由上海生工合成；Anti-Human CD4-FITC購自美國BD公司；IL-18Rα及IgG1κ抗體購自eBsicence公司；IL-18 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自聯(lián)科生物技術有限公司；抗人CD4T細胞磁珠、磁珠分選(MACS)分選柱及緩沖液購自德國Miltenyi Biotec公司；胎牛血清及IL-18重組蛋白購自美國Gibco公司；細胞培養(yǎng)試劑盒(CCK-8) 購自日本Dojindo公司細胞，核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒購自上海生物工程公司；Tubulin抗體購自江蘇碧云天公司；兔抗人多克隆IkBa蛋白抗體及鼠抗人NF-κB p65單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.3 方法

1.3.1 收集外周血血漿及單個核細胞 取患者乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝外周血2 mL，3 500 r/min離心5 min，每管500 μL，收集兩管離心分離的血漿；其余全血采用人外周血淋巴細胞分離液，并用Ficoll法分離外周血單個核細胞(PBMC)。

1.3.2 熒光定量PCR檢測IL-18 mRNA相對表達量 采用Trizol法提取細胞RNA，紫外分光光度計檢測其純度及濃度，取1 μg逆轉錄為cDNA進行PCR反應。根據GeneBank中人IL-18序列(Gene ID:3606)設計引物，IL-18(153 bp)：上游引物5′-TCA AGA CCA GCC TGA CCA ACA T-3′；下游引物5′-GCT CAC CAC AAC CTC TAC CTC C-3′。以β-actin作為內參，β-actin(185 bp)：上游引物5′-GCC AAC ACA GTG CTG TCT-3′；下游引物5′-CAC ATC TGC TGG AAG GTG-3′。采用SYBR Green染料，通過2-ΔΔCT法分析IL-18 mRNA相對表達量。每個樣本做3個復孔，擴增條件：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 cycle。

1.3.3 流式細胞術檢測IL-18R 每份標本設置同型對照管和檢測管，均加入乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝外周靜脈血50.0 μL；兩管同時加入CD4-FITC抗體5.0 μL，漩渦混合器充分混勻，室溫避光孵育15 min；兩管同時加入紅細胞裂解液1 000.0 μL，充分混勻，室溫避光孵育10 min，至全血透亮；兩管均加入磷酸鹽緩沖液(PBS)1 000.0 μL，充分混勻，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，重復本次操作1次。檢測管加入IL-18Rα抗體5.0 μL，同型對照管加入IgG1κ抗體2.5 μL，充分混勻，室溫避光孵育15 min。兩管均加入PBS 1 mL，充分混勻，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，重復本次操作1次。棄去上清液，加入PBS 2 mL，充分混勻，上機檢測。

1.3.4 ELISA法檢測血漿IL-18 嚴格按照IL-18 ELISA試劑盒說明書進行檢測，酶標儀450 nm/630 nm波長測定光密度(OD)值。

1.3.5 CD4+T細胞分選、培養(yǎng)及增殖試驗 分離出PBMC后，利用人工磁性分選方法及抗人CD4+T細胞磁珠進一步分選出人外周血CD4+T細胞，并通過流式細胞術檢測細胞分選純度。以細胞數(shù)1×105/孔接種于96孔板，每組設3個復孔，每孔100 μL。設置空白組：不含細胞的RPMI 1640培養(yǎng)液+PHA(5.00 μg/mL)+IL-2(0.01 μg/mL)；對照組：含有細胞的RPMI 1640培養(yǎng)液+PHA(5.00 μg/mL)+IL-2(0.01 μg/mL)；試驗組：含有細胞的RPMI 1640培養(yǎng)液+PHA(5.00 μg/mL)+IL-2(0.01 μg/mL)+IL-18(100 ng/mL)進行細胞增殖，試驗組在加入IL-18前，37 ℃，5%CO2預培養(yǎng)1 d；加入IL-18后，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)3 d；其余組相同條件下培養(yǎng)4 d，加入CCK-8試劑孵育4 h后用酶標儀檢測各組OD值。

1.3.6 Western blot檢測 按上1.3.5所示進行分組細胞培養(yǎng)，試驗組在加入IL-18前，37 ℃，5%CO2預培養(yǎng)1 d；試驗組加入IL-18后，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)30 min，收集各組細胞。以核蛋白/漿蛋白抽提試劑盒分別提取細胞胞質蛋白及細胞核蛋白，以二喹啉甲酸法(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(增強型)檢測蛋白濃度，每個樣本選取等量蛋白(35 μg)，依次進行電泳、轉膜、封閉、抗體孵育等步驟，最終利用電化學發(fā)光(ECL)發(fā)光液顯色，采用Image J軟件對圖像進行分析，檢測IκBα和NF-κB p65蛋白表達情況。

2 結 果

2.1 IL-18及IL-18 mRNA的檢測結果 PBC組血漿中IL-18的水平明顯高于健康對照組(P<0.05)；PBC組IL-18 mRNA的相對表達量較健康對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1A～B。

2.2 CD4+T細胞純度及百分率并行細胞計數(shù)的結果 PBC組表達IL-18Rα的CD4+T細胞百分率高于健康對照組(P<0.05，圖1C)。經流式細胞術檢測，可以看出經磁珠分選后的細胞純度高且分選完全(圖2)。經磁珠分選后細胞計數(shù)，1 mL全血中CD4+T細胞計數(shù)，PBC組中的CD4+T細胞量與健康對照組相比明顯升高(P<0.05)，見圖1D。

A：兩組血漿中IL-18表達水平；B：兩組PBMC中IL-18 mRNA的表達情況；C：表達IL-18Rα的CD4+T細胞百分率；D：磁珠分選后，1 mL全血中CD4+T細胞計數(shù)。

圖1 兩組IL-18和CD4+細胞檢測結果

A：磁珠分選前PBMC中CD4+T細胞百分數(shù)；B：磁珠分選后細胞濾液中CD4+T細胞百分數(shù)；C：磁珠分選CD4+T細胞純度。

圖2 流式細胞術檢測結果

A：IL-18刺激前PBC組CD4+T 細胞；B:IL-18刺激后PBC組CD4+T 細胞。

圖3 鏡下IL-18刺激前后CD4+T細胞的增殖(×200)

2.3 CD4+T細胞增殖率 磁珠分選并培養(yǎng)CD4+T細胞，經IL-18刺激后PBC組CD4+T細胞均被刺激增殖，PBC組增殖率明顯高于健康對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1、圖3。

2.4 Western blot檢測IκBα、NF-κB p65蛋白表達水平 未給予IL-18刺激時，PBC組IκBα蛋白表達量明顯低于健康對照組，NF-κB p65蛋白表達量明顯高于健康對照組(P<0.01)。給予IL-18刺激后，各組中IκBα蛋白相對表達量相均有所下降、NF-κB p65蛋白相對表達量均有所上調，且PBC組更加明顯(P<0.01)，見表2，圖4。

表1 IL-18對CD4+T細胞增殖的影響

IL-18(-)：未經IL-18刺激；IL-18(+)：經IL-18刺激后；a：P<0.01，與健康對照組比較。

表2 各組蛋白經IL-18刺激前后表達相對灰度值

IL-18(-)：未經IL-18刺激；IL-18(+)：經IL-18刺激后；a：P<0.05，與健康對照組比較。

圖4 兩組Western blot條帶

3 討 論

PBC是一種以肝內小膽管漸進性破壞導致慢性膽汁淤積、匯管區(qū)炎癥、纖維化并可能導致肝硬化最終發(fā)展為肝衰竭為特征的AID[7]。其可能是環(huán)境因素與遺傳因素相互作用的結果[1,8]。UDCA作為唯一被美國FDA批準的用以治療PBC的藥物可以防止門脈高壓、食管靜脈曲張并延遲需要肝移植的時間[9]，對于處于第1或第2階段的患者，經UDCA治療，其生存率與年齡相一致的健康者相接近[10]，但并非對所有的患者都有效[11]，最終需要肝移植。需要指出的是，經國內外專家取得共識，如經早期診斷及規(guī)范化治療，大部分患者不一定會發(fā)展至肝硬化，然而“肝硬化”的名字會給患者在工作及生活上帶來較大精神壓力，建議將“原發(fā)性膽汁性肝硬化”更名為“原發(fā)性膽汁性膽管炎”[12]。

本研究分別檢測了PBC組PBMC中IL-18 mRNA相對表達量、表達IL-18Rα的CD4+T細胞百分率及血漿中IL-18水平，結果顯示其各項指標表達水平較健康對照組均明顯升高，提示IL-18與PBC的發(fā)病相關且其可能通過CD4+T細胞介導PBC的發(fā)病。IL-18是1995年發(fā)現(xiàn)的具有誘導干擾素γ(IFN-γ)高水平表達作用的細胞因子，其可通過多種途徑促進Th1型免疫反應，如誘導Th1細胞和NK細胞產生IFN-γ，與IL-12具有協(xié)同作用，誘導Th1細胞產生IFN-γ[13-14]。IL-18還可促進新生CD4+T細胞的增殖，并誘導CD4+T細胞極化為Th1細胞，進一步分泌IFN-γ。研究表明，PBC患者血清中的細胞因子以Th1細胞分泌的IL-2、IFN-γ、腫瘤壞死因子α(TNF-α)升高為主，而作為炎性細胞因子的IFN-γ介導的炎癥反應是PBC肝臟病理損傷的原因之一。而IL-18能誘導CD4+T細胞增殖、極化為Th1細胞并分泌IFN-γ。因此，IL-18在增強Th1型免疫應答上起著重要調節(jié)作用。另據Joshi等[15]的研究，浸潤于肝組織匯管區(qū)的T淋巴細胞以CD4+T細胞居多，且原位雜交分析PBC患者匯管區(qū)表達IFN-γ mRNA明顯增加，并總結了PBC肝浸潤淋巴細胞中以Th1為主。而有關IL-18在PBC中的研究卻很少報道。Yamano等[16]雖然對PBC患者血清中的IL-18做了相關研究，本研究結果與其相符合，但其并沒有深入到基因水平，也沒有對其相關信號通路進行研究，而本研究恰好彌補了這方面的不足，更加全面。IL-18R可表達于Th1細胞表面而Th2細胞不表達，由α、β兩個亞單位組成。研究報道，IL-18R的α-亞單位缺失的小鼠不能與IL-18產生反應，表明受體α-亞單位在應答反應中起關鍵作用[17-18]。結合PBC患者CD4+T細胞中以Th1型細胞占主導作用的免疫學特點及IL-18在T細胞免疫中的生物學作用，提示IL-18與CD4+T細胞表面IL-18Rα結合，從而發(fā)揮其增殖T細胞功能并促進其極化為Th1細胞，介導Th1型細胞免疫，從而攻擊膽管上皮細胞發(fā)生炎癥壞死，并導致肝內膽汁淤積，造成肝臟的病理損傷。

在細胞增殖實驗中，運用免疫磁珠分選法對外周血PBMC中的CD4+T細胞進行分離，用流式細胞術對分選后的細胞進行純度測定，結果顯示磁珠分選的細胞純度高并且分選完全，為后續(xù)實驗奠定基礎。運用CCK-8法進行預實驗時，在未添加IL-2和植物血凝素(PHA)的情況下，細胞不僅不增殖而且存活率低、病死率高，在細胞培養(yǎng)基內加入PHA及IL-2可有效促進細胞的增殖、分化。使用PHA和IL-2誘導T淋巴細胞增殖是科研實驗中最常用的免疫學方法。目前研究表明，IL-2信號轉導依靠Janus激酶-信號轉導子和轉錄激活子(JAK-STAT)信號轉導途徑。IL-2與其受體結合后，通過活化蛋白酪氨酸激酶JAK1及JAK3激活信號轉導及轉錄激活因子STAT5，活化的STAT5進入細胞核后可促使細胞進入分裂周期[19]。IL-2信號轉導途徑與本實驗研究IL-18激活CD4+T細胞NF-κB信號途徑并不一致，未對本實驗造成干擾。以IL-18重組蛋白對經IL-2及PHA作用后的CD4+T細胞進行體外刺激實驗，結果表明，相對于未經IL-18刺激而言，PBC組與健康對照組CD4+T細胞均增殖，提示IL-18可以促進CD4+T細胞的增殖。PBC組增殖更為明顯，且前期實驗證實PBC患者外周血中表達IL-18Rα的CD4+T細胞增多，進一步證實PBC患者外周血中存在大量增殖能力強、對IL-18刺激敏感度高的CD4+T細胞。

IL-18可以通過NF-κB通路、JAK/STAT通路、C-Jun氨基末端激酶(JNK)通路等多條信號轉導通路發(fā)揮其促炎作用。其中NF-κB是機體內重要的核轉錄因子，參與多種生理病理過程，由p50和p65兩個多肽鏈單位組成異源二聚體，其中p65是抑制蛋白IκB的結合部位，參與轉錄的起始調節(jié)。在細胞的細胞質中，p65與IκB穩(wěn)定結合，被外來因素刺激后，IκB磷酸化降解，NF-κB隨即被活化進入細胞核內。IκB家族為NF-κB抑制蛋白，IκBα作為IκB家族9個成員中最為經典的成員[20]，在NF-κB活化過程中是作用最強的負反饋因子。靜息狀態(tài)下，其能夠與NF-κB p65穩(wěn)定結合，接受刺激沖動時能快速活化與之解離，故IκBα是研究NF-κB信號通路激活狀態(tài)的最佳指標。因此，本試驗選擇與IκB可以穩(wěn)定結合的NF-κB p65及IκBα作為NF-κB信號通路是否活化的檢測指標。對未經IL-18刺激的各研究組細胞質蛋白IκBα和核蛋白NF-κB p65進行Western blot檢測，結果顯示PBC組細胞質蛋白IκBα明顯低于健康組、核蛋白NF-κB p65明顯高于健康組，提示PBC患者CD4+T細胞中NF-κB信號通路處于相對較高的激活狀態(tài)。外源性給予IL-18刺激后，PBC組CD4+T細胞胞質蛋白IκBα表達進一步降低，胞核蛋白NF-κB p65表達進一步增高，證實在PBC患者CD4+T細胞中NF-κB信號通路可以被IL-18高度激活。因此，本研究推測在PBC患者體內，由于IL-18的增高導致CD4+T細胞中NF-κB信號通路的高度激活，產生大量炎性因子，這些因子共同作用引起肝內膽管上皮細胞的損傷，肝內膽汁淤積癥狀逐漸加重，最終引起PBC的發(fā)生。

總的來說，本研究進一步證實了IL-18與PBC發(fā)病的相關性，并表明其可以通過介導CD4+T細胞的NF-κB信號通路的激活參與PBC的細胞免疫炎癥反應，這提示IL-18的干預有可能成為PBC有效治療新的靶點。介于其發(fā)病機制的復雜性且仍有約1/3患者對UDCA應答欠佳而最終需要進行肝移植[21]，對PBC研究十分必要，有關其與信號傳導通路及天然免疫的關系，需進一步研究。

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Correlation analysis of NF-κB signaling pathway activated by IL-18 in CD4+T cells and the pathogenesis of PBC*

ZhaoErchuan1,LiHongmei2,RenZhijing2,HeYuqing2,WangMingzhu3,YeZhenxuan2,ZhouWenjing2,Zhanghua2△

(1.ClinicalLaboratory,GuizhouMedicalUniversityGuiyang,Guizhou550004,China;2.DepartmentofMedicalLaboratory,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550002,China; 3.DepartmentofMedicalLaboratory,GuiyangNursingVocationalCollege,Guiyang,Guizhou550081,China)

Objective To explore the correlation between NF-κB signaling pathways activated by IL-18 in CD4+T cells and the pathogenesis of PBC.Methods We detected the expression of IL-18 mRNA in PBMCs,IL-18 level in plasma,receptor IL-18R on surface of CD4+T cell,proliferation rate of CD4+T cell and its NF-κB signaling pathway protein IκBα and NF-κB p65 by qRT-PCR,ELISA,flow cytometry,MACS and Western blot on 32 cases of patients with PBC (PBC group) and 32 healthy people (control group) in Guizhou provincial people′s hospital.Results The level of IL-18 in PBC group was significantly higher than that in control group (P<0.05). The relative expression of IL-18 mRNA in PBC group was significantly higher than that in control group (P<0.05). The percentage of CD4+T cells expressing IL-18Rα in PBC group was higher than that in control group (P<0.05). The proliferation rate of CD4+T cells stimulated by IL-18 in PBC group was significantly higher than that in healthy control group (P<0.01). The relative expression levels of NF-κB p65 protein were up-regulated in IL-18,and the expression of IκBα protein in each group was significantly increased，especially in PBC group (P<0.01).Conclusion IL-18 can activate NF-κB signal pathway in CD4+T cells and participate in the pathogenesis of primary biliary cirrhosis.

liver cirrhosis,biliary;T-lymphocytes;antigens,CD4;interleukin-18;primary biliary cirrhosis;nuclear factor-kappa signaling pathway

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.007

貴州省科學技術廳項目(黔科合LH字[2014]7008號)。 作者簡介：趙二川(1989-)，在讀碩士，主要從事臨床檢驗診斷學方面研究。△

，E-mail：780837482@qq.com。

R446.6

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1671-8348(2017)14-1892-05

2016-11-26

2017-01-16)