陳曉露，吳蓉宜，董玉潔△

(1.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，四川樂山 614000；2.四川省成都市第六人民醫(yī)院病理科 610051)

肺鱗癌細(xì)胞中PTHrP基因表達(dá)與性激素的相關(guān)性研究

陳曉露1，吳蓉宜2，董玉潔1△

(1.樂山職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，四川樂山 614000；2.四川省成都市第六人民醫(yī)院病理科 610051)

目的 研究人的雌性激素17β-雌二醇和雄性激素睪酮對肺鱗癌細(xì)胞中甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrP)基因表達(dá)的影響。方法 分別用17β-雌二醇和睪酮按不同的濃度梯度刺激肺鱗癌細(xì)胞的生長，利用EVA熒光實時定量PCR技術(shù)檢測各濃度雌雄性激素刺激作用后肺鱗癌細(xì)胞中PTHrP基因表達(dá)的情況。結(jié)果 肺鱗癌細(xì)胞中PTHrP基因相對表達(dá)量隨著睪酮濃度的增加而遞減，但是17β-雌二醇作用后，PTHrP基因相對表達(dá)量沒有明顯的增強和減弱的趨勢。結(jié)論 睪酮對肺鱗癌細(xì)胞中PTHrP基因表達(dá)起負(fù)調(diào)節(jié)作用，而17β-雌二醇對PTHrP基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用不明顯。

癌，鱗狀細(xì)胞；肺腫瘤；甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白質(zhì)；PTHrP；睪酮；17β-雌二醇

肺癌是最常見的肺部原發(fā)性惡性腫瘤，是癌癥死亡的主要原因之一。71%的肺癌患者都是由于吸煙導(dǎo)致[1-2]。有資料顯示，比起男性吸煙者，女性吸煙者更容易患上肺癌，但是女性患者預(yù)后較男性患者好，通常具有較長的生存期[3-4]。這表明性別可能是影響肺癌生長的潛在因素之一。甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrP)在男、女肺癌細(xì)胞中的表達(dá)存在著明顯的差異[5]。PTHrP最初是從與高鈣血癥相關(guān)的惡性腫瘤組織中分離出的一種在結(jié)構(gòu)上與甲狀旁腺激素PTH相類似的因子[6-7]。后期的研究表明，PTHrP同樣在延遲腫瘤的生長、延長患者的生存期方面具有很大的影響[8-11]。本研究中選用EvaGreen作為熒光指示劑做實時定量PCR，研究人的雌雄性激素對肺鱗癌細(xì)胞中PTHrP的基因表達(dá)調(diào)控影響，分析兩者之間的關(guān)系，為判斷男、女性肺癌患者臨床預(yù)后情況提供指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗細(xì)胞 肺鱗癌細(xì)胞株YTMLC由成都市第六人民醫(yī)院提供。

1.1.2 主要試劑及儀器 RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基為Hyclone公司產(chǎn)品；無酚紅1640細(xì)胞培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；無支原體特級胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；活性炭處理/透析特級胎牛血清為天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品；甲苯磺酰-L-苯丙氨酸氯甲基甲酮(TPCK)處理的胰酶為上海晶純公司產(chǎn)品；雄性激素睪酮testosterone和雌性激素17β-雌二醇17β-Estradiolum為Sigma公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)瓶及細(xì)胞培養(yǎng)6孔板均為Coring公司產(chǎn)品；RNApure 高純總RNA快速抽提試劑盒(離心柱型)為北京百泰克生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為MBI Fermentas公司產(chǎn)品；SoFast EvaGreen supermix熒光染料混合物為BIO-RAD公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)箱為美國熱電公司產(chǎn)品；普通PCR擴增儀及熒光實時定量PCR擴增儀均為BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 根據(jù)GenBank中獲得的人的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH,一種管家基因)、PTHrP基因序列，并按照實時定量PCR引物設(shè)計要求設(shè)計特異性引物，分別擴增基因序列中的一小段序列。本試驗中所用引物均由大連寶生物工程有限公司合成，序列見表1。

1.2.2 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng) 用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)YTMLC細(xì)胞，一般3～4 d，待細(xì)胞鋪滿細(xì)胞培養(yǎng)瓶后，按1∶4進(jìn)行傳代，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到所需用量時，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.2.3 性激素刺激YTMLC細(xì)胞 按常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，吸走原來的細(xì)胞培養(yǎng)基，用含有10%活性炭處理過血清的無酚紅1640培養(yǎng)基輕輕地清洗細(xì)胞面兩次，再加入2 mL上述培養(yǎng)基，并分別加入相應(yīng)濃度的17β-雌二醇或睪酮,混勻,使其終濃度分別呈0、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 nmol/L濃度梯度，于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h,48 h后進(jìn)行總RNA的抽提。

表1 引物序列

1.2.4 總RNA抽提 按照RNApure 高純總RNA快速抽提試劑盒中說明書的操作步驟進(jìn)行RNA抽提。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 總的反應(yīng)體系為20 μL。模板RNA 1.5 μg，隨機引物1 μL，補去nuclease H2O至12 μL，5×反應(yīng)緩沖液4 μL，RNase 抑制劑(20 U/μL)1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，M-MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/μL)1 μL，混勻。25 ℃ 5 min，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min在普通PCR儀中進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成好的cDNA可以直接進(jìn)行后續(xù)試驗或者凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 EvaGreen實時定量PCR

1.2.6.1 擴增反應(yīng)體系 總體系為25.0 μL。EvaGreen supermix 12.5 μL，cDNA 5.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，dH2O 5.5 μL。實際操作過程中，根據(jù)試驗需要可將各組分的比例做相應(yīng)的調(diào)整。加樣過程均在冰上進(jìn)行，加樣完成后，輕微振蕩混勻后置入實時定量PCR儀中進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)。擴增條件：首先95 ℃ 3 min,其次95 ℃ 15 s,57 ℃ 20 s,72 ℃ 30 s,82 ℃ 5 s,讀板，共45個循環(huán)。之后作熔解曲線，程序如下：95℃ 10 s，65 ℃ 5 s ，之后以0.1 ℃/s的速率緩慢增溫到95 ℃，讀板。每份樣本分別擴增內(nèi)參基因GAPDH和目的基因PTHrP,且均設(shè)兩個復(fù)孔。

1.2.6.2 PCR產(chǎn)物特異性鑒定 擴增反應(yīng)結(jié)束后，分析PCR熔解曲線，確定產(chǎn)物的特異性，如果出現(xiàn)一個峰，則PCR擴增產(chǎn)物特異，如果出現(xiàn)多峰，則PCR出現(xiàn)非特異性擴增。

1.2.6.3 分析基因表達(dá) 擴增反應(yīng)結(jié)束后，PCR儀自動計算出各孔的Ct值。本研究中主要采用△△Ct方法來計算2-△△Ct值，在目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的擴增效率相同的情況下，通過計算2-△△Ct值得出各樣本與對照之間的基因表達(dá)的相對倍數(shù)變化關(guān)系?！鳌鰿t=(Ct樣本目的基因-Ct樣本內(nèi)參基因)-(Ct對照目的基因-Ct對照內(nèi)參基因)。

2 結(jié) 果

2.1 實時熒光擴增曲線 用不同濃度的性激素刺激YTMLC細(xì)胞48 h，進(jìn)行熒光定量PCR，分別擴增內(nèi)參基因GAPDH中的一段和目的基因PTHrP中的一段，得到熒光擴增曲線見圖1、2。圖中顯示，各樣本擴增后，具有明顯的S型擴增曲線。且各個樣本內(nèi)參基因GAPDH的擴增曲線均在17個循環(huán)左右起峰，目的基因PTHrP的擴增曲線均在31個循環(huán)左右起峰。PCR儀顯示相同樣本的內(nèi)參基因GAPDH和目標(biāo)基因PTHrP的擴增效率基本一致。

圖1 17β-雌二醇刺激XWLC-05細(xì)胞后擴增曲線 圖2 睪酮刺激XWLC-05細(xì)胞后擴增曲線

圖3 17β-雌二醇刺激YTMLC后熔解曲線

圖4 17β-雌二醇刺激YTMLC后熔解峰

圖5 睪酮刺激YTMLC后熔解曲線

圖6 睪酮刺激YTMLC后熔解峰

2.2 實時熒光擴增熔解曲線和熔解峰 通過做熔解曲線，得到熔解曲線圖和熔解峰，見圖3～6。熔解峰顯示各反應(yīng)孔內(nèi)參基因GAPDH的Tm值均為82.5 ℃，各樣本目標(biāo)基因PTHrP的Tm值均為86.0 ℃。從圖中可見每條擴增曲線僅出現(xiàn)一個峰，證明PCR僅生成一種產(chǎn)物，并沒有受到引物二聚體的影響。

2.3 基因表達(dá)分析 擴增反應(yīng)結(jié)束后，熒光實時定量PCR儀讀出各反應(yīng)孔的Ct值，通過△△Ct方法來計算2-△△CT值，得到基因相對表達(dá)倍數(shù)圖譜。從圖7中可以明顯看出，受不同濃度17β-雌二醇刺激YTMLC 48 h后,PTHrP的表達(dá)相對于沒有受17β-雌二醇刺激的細(xì)胞來說，并無明顯變化。但是圖8顯示，YTMLC在受不同濃度的睪酮刺激作用48 h后，相對于沒有受睪酮刺激的細(xì)胞，PTHrP的表達(dá)倍數(shù)隨著睪酮濃度的升高而降低，10 nmol/L睪酮作用時，PTHrP的相對表達(dá)量只有沒受睪酮刺激細(xì)胞表達(dá)量的20%左右。

圖7 不同濃度的雌二醇刺激YTMLC后PTHrP基因的表達(dá)

圖8 不同濃度的睪酮刺激XWLC-05細(xì)胞后PTHrP基因的表達(dá)

3 討 論

PTHrP最早于1987年發(fā)現(xiàn)于惡性腫瘤伴發(fā)的高鈣血癥患者的血漿中，主要由腫瘤組織和細(xì)胞產(chǎn)生和分泌，包括鱗狀細(xì)胞癌，泌尿系統(tǒng)癌，乳腺癌，卵巢癌等組織和細(xì)胞都能產(chǎn)生PTHrP。正常組織和細(xì)胞僅能表達(dá)極少量的PTHrP，常規(guī)的檢測方法幾乎無法檢測得[12-13]。人的PTHrP由141個氨基酸組成，比PTH長2倍左右，相對分子質(zhì)量為16×103，其中N端的1-34個氨基酸與PTH N端地1-34個氨基酸序列和結(jié)構(gòu)相同，是與PTH受體結(jié)合并發(fā)揮類似PTH作用的部位[14]。目前普遍認(rèn)為PTHrP是引起惡性腫瘤高鈣血癥的主要致病因素，PTHrP作為骨吸收刺激因子(BRSF)的一種，能夠作用于成骨細(xì)胞，與PTH受體結(jié)合，通過激活腺苷酸環(huán)化酶，增加cAMP的產(chǎn)生，通過cAMP的介導(dǎo)作用間接促進(jìn)破骨細(xì)胞引起骨吸收，使鈣由骨入血[15]。此外，PTHrP還能促進(jìn)腎小管對Ca的吸收，綜合這些作用引起高鈣血癥。大量的研究工作已經(jīng)證實，PTHrP同樣是導(dǎo)致肺癌患者發(fā)生高鈣血癥的主要因素，但揭示其在肺癌的進(jìn)展或判斷預(yù)后方面的工作還很少。隨著人們對PTHrP認(rèn)識的深入，近年來，國外的一些研究結(jié)果提示，在肺癌中PTHrP的表達(dá)是一個有益的預(yù)后因子，它在延遲腫瘤的生長，延長患者的生存期方面具有重要影響，尤其是對于女性肺癌患者來說，PTHrP是一個非常有意義的預(yù)測指標(biāo)。由于肺鱗癌是肺癌中最為常見的一種臨床類型，它的發(fā)病率在各種肺癌中最高。因此本研究中選用肺鱗癌細(xì)胞作為研究對象，通過不同雌性激素17β-雌二醇和雄性激素睪酮分別作用于肺鱗癌細(xì)胞YTMLC，采用EVA熒光實時定量PCR技術(shù)檢測PTHrP的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，17β-雌二醇對肺鱗癌細(xì)胞中PTHrP的表達(dá)量并無明顯的調(diào)節(jié)作用，而睪酮對其起到明顯的負(fù)調(diào)節(jié)作用;隨著睪酮濃度的增加，PTHrP的表達(dá)量依次減少?？梢娦约に厮綄Ψ西[癌細(xì)胞中PTHrP基因表達(dá)的影響作用，監(jiān)測其水平可以作為判斷肺癌患者預(yù)后的依據(jù)。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.041

陳曉露(1977-)，副教授，本科，主要從事病理學(xué)方面研究?！?/p>

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R734.2

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1671-8348(2017)14-1988-03

2017-01-21

2017-03-09)