梁 梅,郭述良,張紅梅

(1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 401120；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400016；3.重慶市第五人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 400062)

不同滴度噬菌體D29對(duì)氣道上皮細(xì)胞9HTE的生長(zhǎng)及功能影響研究*

梁 梅,郭述良2△,張紅梅3

(1.重慶市渝北區(qū)人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 401120；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶 400016；3.重慶市第五人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 400062)

目的 研究噬菌體D29不同滴度對(duì)氣道上皮細(xì)胞株9HTE的生長(zhǎng)及功能影響。方法 分別用高滴度(109PFU/mL)和低滴度(107PFU/mL)噬菌體D29及噬菌體緩沖液組作用于9HTE細(xì)胞株后，用四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況；用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法測(cè)量細(xì)胞上清液白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8水平；用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)mRNA的表達(dá)，用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 高、低滴度噬菌體D29作用氣道上皮細(xì)胞一段時(shí)間后，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活性、細(xì)胞因子IL-6、IL-8和ICAM-1 mRNA的表達(dá),以及細(xì)胞凋亡率的影響與噬菌體緩沖液組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 高、低滴度噬菌體D29對(duì)體外培養(yǎng)的氣道上皮細(xì)胞生長(zhǎng)及功能無(wú)明顯影響。

細(xì)菌噬菌體；氣管；白細(xì)胞介素類；血管細(xì)胞黏附分子1；氣道上皮細(xì)胞；安全性

當(dāng)前，結(jié)核病仍是全球最嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，2014年全球960萬(wàn)人患有結(jié)核病，其中150萬(wàn)人因感染結(jié)核而死亡，48萬(wàn)人為耐多藥結(jié)核病。結(jié)核病耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，而現(xiàn)有的治療方案無(wú)法達(dá)到令人滿意的效果，因此急需研發(fā)新的治療結(jié)核病的方法和制劑。噬菌體作為細(xì)菌病毒中的一種，能在感染細(xì)菌周期末期特異性裂解宿主菌,故可作為抗菌制劑而被用于研究[1]，特別是用于耐藥菌的治療[2]。噬菌體D29能裂解結(jié)核分枝桿菌，有望用于結(jié)核病的診斷和治療。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體D29能裂解巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌，使結(jié)核病模型豚鼠肝、脾臟器荷菌量減少，這為研制耐藥結(jié)核病治療用噬菌體制劑奠定了基礎(chǔ)[3]。且前期研究還發(fā)現(xiàn)噬菌體D29通過(guò)呼吸道給入后到達(dá)肺部的滴度比皮下、肌內(nèi)注射高，且維持時(shí)間長(zhǎng)，表明氣道給藥可能有利于治療肺結(jié)核[4]。但通過(guò)呼吸道給入噬菌體安全性如何還不得而知，本文通過(guò)對(duì)噬菌體D29對(duì)體外培養(yǎng)的氣道上皮的生長(zhǎng)和功能研究，以期了解噬菌體通過(guò)氣道給藥的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)材料：氣道上皮細(xì)胞株9HTE，由重慶市兒童醫(yī)院呼吸科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；噬菌體D29由中國(guó)藥品生物制品檢定所王國(guó)治教授惠贈(zèng)。試劑：DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，美國(guó)Gibco公司)，胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)，四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT，超純級(jí)，美國(guó)Amersco公司)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(美國(guó)R&D公司分裝)，Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(凱基公司)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNAiso、Plus、Tag酶、DNA Marker (上海寶生物公司)，引物序列由上海寶生物合成。

1.2 方法

1.2.1 9HTE細(xì)胞的培養(yǎng) 氣道上皮細(xì)胞9HTE用含10%的FBS DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含有4.0 mmol/L谷氨酰胺，4 500 mg/L葡萄糖)培養(yǎng)于50 mL培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d換液，待細(xì)胞于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于試驗(yàn)。

1.2.2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的9HTE細(xì)胞制成1×105/mL接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔150 μL，待過(guò)夜貼壁后換無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步化于G0期。取出培養(yǎng)板后棄去無(wú)血清培養(yǎng)基，給藥組加入噬菌體D29使得每孔終濃度分別為109、107PFU/mL(高滴度組、低滴度組)，每孔終體積均為200 μL，以噬菌體緩沖液(phage buffer)為陰性對(duì)照孔，均設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后，加入MTT(5 g/L)每孔20 μL后放入37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4 h，以800 r/min，離心5 min，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，輕輕振蕩10 min，使紫色結(jié)晶完全溶解后，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀于570 nm檢測(cè)吸光度(A)值，該試驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞存活率=(A給藥組-A空白組)/(A正常組-A空白組)×100%。其中給藥組為試驗(yàn)干預(yù)組，正常組為未做任何處理組，空白組為單純加入MTT細(xì)胞培養(yǎng)基組。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8分泌水平 接種處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的9HTE氣道上皮細(xì)胞懸液以1×105/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔500 μL待過(guò)夜貼壁后試驗(yàn)組加入噬菌體D29使每孔的最終濃度分別為109、107PFU/mL(高滴度組、低滴度組)，終體積為1 mL，均設(shè)置4個(gè)復(fù)孔；以phage buffer為陰性對(duì)照組，脂多糖(LPS，終濃度為10 mg/L)設(shè)置為陽(yáng)性對(duì)照組，置入37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 d后，收集細(xì)胞上清液，3 000 r/min，離心20 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，測(cè)上清液細(xì)胞因子IL-6、IL-8水平，該試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 RT-PCR半定量檢測(cè)氣道上皮細(xì)胞細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)mRNA的表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的氣道上皮細(xì)胞懸液以1×106/瓶接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞過(guò)夜貼壁后加入噬菌體D29使每孔的終濃度分別為109、107PFU/mL(高滴度組、低滴度組)，終體積為3 mL；以phage buffer為陰性對(duì)照組，置入37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 d后按照說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈，加入Tag酶及上、下游引物，在PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ICAM-1引物核苷酸序列：上游5′-GAG TCT GCT GGG AAT TTT CTG G-3′，下游5′-GAG GTG ACA GTG AAG TGT GAG G-3′，PCR循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 30 s變性，56 ℃ 30 s退火，共反應(yīng)30循環(huán)；β-actin上游5′-TCC TGT GGC ATC CAC GAA ACT-3′,下游5′-GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT-3′。PCR循環(huán)參數(shù)為：94 ℃ 30 s變性，58 ℃ 30 s退火，共反應(yīng)35循環(huán)，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳并掃描成像，計(jì)算機(jī)軟件分析電泳條帶灰度。

1.2.5 流式細(xì)胞儀對(duì)氣道上皮細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 臺(tái)盼藍(lán)記數(shù)細(xì)胞活力大于95%的氣道上皮細(xì)胞105/孔接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基24 h，使細(xì)胞同步于G0期。試驗(yàn)組加入噬菌體D29使每孔終濃度分別為109、107PFU/mL(高滴度組、低滴度組)，終體積為1 mL；陰性對(duì)照組加入phage buffer，均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，刺激48 h后，以無(wú)二乙胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶收集上清液和底壁細(xì)胞，以1 000 r/min離心5 min。用無(wú)菌PBS洗滌2次，沉淀以500 μL binding緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5 μL AnnexinV-FITC混勻后再加入5 μL碘化丙啶(PI)，室溫避光孵育10 min后立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 高、低滴度噬菌體D29對(duì)9HTE細(xì)胞生長(zhǎng)活性 高滴度和低滴度分別作用于氣道上皮細(xì)胞9HTE不同時(shí)間12、24、48 h后，各組存活率見(jiàn)表1。采用重復(fù)測(cè)量方差分析，作用時(shí)間對(duì)9HTE細(xì)胞無(wú)明顯影響(F=0.892,P=0.427)；高、低滴度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.506,P=0.619)；作用時(shí)間及濃度之間不存在交互作用(F=1.053,P=0.408)。

表1 MTT法檢測(cè)9HTE細(xì)胞增殖存活率結(jié)果

2.2 高、低滴度噬菌體D29對(duì)9HTE分泌細(xì)胞因子的影響

2.2.1 高、低滴度噬菌體D29對(duì)9HTE分泌IL-6的影響 用高、低滴度噬菌體D29作用于氣道上皮細(xì)胞9HTE 48 h后，各組細(xì)胞上清液IL-6水平較少，高滴度組[(1.185±0.114)ng/L]、低滴度組[(1.193±0.932)ng/L]與陰性對(duì)照組[(1.238±0.443)ng/L]及正常組[(1.210±0.101)ng/L]兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.257，P=0.855)；陽(yáng)性對(duì)照組[(3.788±0.048)ng/L]與正常組比較細(xì)胞因子水平明顯升高，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=46.123，P=0.000)。

2.2.2 高、低滴度分別對(duì)9HTE分泌IL-8的影響 高滴度組[(0.632±0.042)ng/L]、低滴度組[(0.596±0.163)ng/L]細(xì)胞上清液細(xì)胞因子IL-8水平與陰性對(duì)照組[(0.625±0.003)ng/L]及正常組[(0.609±0.025)ng/L]比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.568，P=0.248)；陽(yáng)性對(duì)照組[(0.817±0.016)ng/L]與正常組比較細(xì)胞因子水平升高明顯，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.064，P=0.000)。

2.2.3 高、低滴度噬菌體D29對(duì)9HTE細(xì)胞表達(dá)ICAM-1的mRNA影響 高滴度組(2.76±0.27)和低滴度組(2.75±0.30)各組間ICAM-1 mRNA表達(dá)量與陰性對(duì)照組(2.84±0.15)和正常組(2.49±0.35)均比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.695，P=0.581)，見(jiàn)圖1。

1:高滴度組；2:低滴度組；3:陰性對(duì)照組；4:正常組。

圖1 各組9HTE細(xì)胞ICAM-1 mRNA的表達(dá)

2.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 高滴度組[(9.82±0.59)%]、低滴度組[(9.98±0.34)%]與陰性對(duì)照組[(10.09±0.32)%]、正常對(duì)照組[(10.56±0.18)%]凋亡率兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.992，P=0.194)。

3 討 論

結(jié)核病耐藥問(wèn)題逐漸嚴(yán)重，故急需要開(kāi)發(fā)新的抗菌藥物，噬菌體D29裂解譜廣，抗原性較高，能裂解耐藥結(jié)核分枝桿菌，故有望用于肺結(jié)核病特別是耐藥結(jié)核病的治療[5]。結(jié)核病以肺部感染最多，通過(guò)課題組前期研究表明通過(guò)呼吸道給藥噬菌體到達(dá)肺部量最多，藥物量維持時(shí)間長(zhǎng)[4,6]，保證其有效性，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)噬菌體對(duì)氣道上皮的功能及安全性研究甚少。

氣道上皮細(xì)胞具有機(jī)械屏障作用，同時(shí)還有更重要的免疫炎癥防御作用[7]，氣道上皮細(xì)胞受刺激后可產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，募集炎性細(xì)胞，誘發(fā)異常炎癥反應(yīng)，造成病理?yè)p傷[8]。IL-6在正常氣道上皮細(xì)胞極少分泌，但在受刺激后分泌量增加，其主要功能是促進(jìn)T、B細(xì)胞增殖活化，參與炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)熱等，IL-8是一種化學(xué)趨化因子，可趨化并激活中性粒細(xì)胞到達(dá)炎癥部位，發(fā)揮作用[9]。而ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族成員之一，參與調(diào)解炎癥反應(yīng)，細(xì)胞和組織之間分化和發(fā)育、免疫反應(yīng)應(yīng)答及淋巴細(xì)胞歸巢和再循環(huán)等一些重要的生理功能[10]，也是大部分血清型鼻病毒、呼吸道合胞病毒等多種病毒的受體，受到相關(guān)病毒感染時(shí)，其ICAM-1表達(dá)上調(diào)[11-13]。

本試驗(yàn)研究結(jié)果提示：無(wú)論是高滴度或是低滴度噬菌體D29對(duì)氣道上皮細(xì)胞分泌的IL-6、IL-8及氣道上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)活性和ICAM mRNA 的分泌均無(wú)明顯影響，表明噬菌體D29本身不會(huì)刺激氣道上皮細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)，初步表明噬菌體D29對(duì)氣道上皮細(xì)胞具有較好的安全性，但本試驗(yàn)僅限于體外試驗(yàn)，對(duì)體內(nèi)試驗(yàn)是否安全需要進(jìn)一步動(dòng)物試驗(yàn)證明。

綜上所述，噬菌體D29作用于人氣道上皮細(xì)胞一段時(shí)間過(guò)后，對(duì)其生長(zhǎng)及功能均無(wú)明顯影響，表面噬菌體D29對(duì)氣道上皮細(xì)胞有較好的安全性，為今后噬菌體生物制劑通過(guò)呼吸道治療肺結(jié)核感染提供安全性依據(jù)。

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Effects of different titers of bacteriophage D29 on growth and function of airway epithelia cell 9HTE*

LiangMei1,GuoShuliang2△,ZhangHongmei3

(1.DepartmentofRespiratory,People′sHospitalofYubeiDistrict,Chongqing401120,China; 2.DepartmentofRespiratory,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 3.DepartmentofRespiratory,theFifthPeople′sHospitalofChongqing，Chongqing400062,China)

Objective To research the effects of different titers of bacteriophage D29 on growth and function of airway epithelial cell 9HTE.Methods Cell viability rates was analyzed after applying high(109PFU/mL) and low(107PFU/mL) titers of bacteriophage D29 and phage buffer respectively by MTT colorimetry.Additionally,the secretion levels of IL-6，IL-8 in cell culture supernatant were detected by ELISA.RT-PCR was performed to detect the expression of ICAM-1 mRNA.Cell apoptosis rate was analyzed by flow cytometry.Results There was no difference in cell growth,secretion levels of IL-6,IL-8,ICAM-1 mRNA and cell apoptosis rate between cells treated with high and low titers of D29 and phage buffer(P>0.05).Conclusion Neither high nor low titer of bacteriophage D29 exerts effect on growth and function of airway epithelial cell 9HTE invitro.

bacteriophages；trachea；interleukins；vascular cell adhesion molecule-1；airway epithelial cells；security

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.15.003

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81570010)。作者簡(jiǎn)介：梁梅(1984-)，住院醫(yī)師，碩士，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病方面研究?！?/p>

，E-mail:guosl999@sina.com。

R329.2

A

1671-8348(2017)15-2024-03

2016-11-21

2017-01-09)