陳心，伍龍，張一橋，陳能，徐細(xì)明

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430060)

·論著·

膽固醇對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響及機(jī)制探討

陳心，伍龍，張一橋，陳能，徐細(xì)明

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430060)

目的 觀察膽固醇對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響，并探討其機(jī)制。方法 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29分為6組，A組不處理,B組加入膽固醇(終濃度1 μmol/L)處理48 h；C、D組和E、F組采用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染陰性siRNA-HiperFect復(fù)合物、膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1(ACAT1)基因siRNA-HiperFect復(fù)合物，轉(zhuǎn)染48 h后D、F組處理同B組。采用CFSE染色法通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，以Transwell小室觀察細(xì)胞侵襲和遷移能力，利用Real time PCR法檢測(cè)細(xì)胞中的ACAT1 mRNA。結(jié)果 B、D組細(xì)胞增殖率、侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)均高于其他組(P均﹤0.05)，其余組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。A、B、C、D、E、F組細(xì)胞中的ACAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.96±0.02、1.48±0.05、0.94±0.02、1.44±0.02、0.54±0.36、0.63±0.05；B、D組細(xì)胞中ACAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于其他組(P均﹤0.05)，E、F組細(xì)胞中ACAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于其他組(P均﹤0.05)，A組與C組、B組與D組、E組與F組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 膽固醇能提高人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移能力，其可能通過(guò)促進(jìn)ACAT1基因表達(dá)發(fā)揮作用。

結(jié)腸癌；膽固醇；膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1；細(xì)胞增殖；細(xì)胞侵襲；細(xì)胞遷移

結(jié)直腸癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，全球結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率分別位列所有癌癥的第3位和第4位。隨著我國(guó)人民生活水平的不斷提高，結(jié)直腸癌發(fā)病率和病死率逐年攀升，達(dá)到甚至超過(guò)了西方發(fā)達(dá)國(guó)家[1]。目前，結(jié)腸癌的治療方式以手術(shù)為主，但是術(shù)后復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是手術(shù)無(wú)法解決的問(wèn)題；對(duì)晚期或轉(zhuǎn)移不能手術(shù)者，放化療可改善患者生存情況，但療效有限。因此，研究結(jié)腸癌的發(fā)病機(jī)制，探索結(jié)腸癌治療的新藥物是改善患者預(yù)后的重要途徑。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，高膽固醇血癥可增加結(jié)直腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及死亡風(fēng)險(xiǎn)，且患者普遍存在糖耐量異常和膽固醇抵抗[2]。2016年1～12月，我們觀察了不同濃度膽固醇對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的影響，并通過(guò)抑制膽固醇代謝關(guān)鍵酶膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1 (ACAT1)基因的表達(dá)以探討其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29購(gòu)自武漢大學(xué)生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)，膽固醇(美國(guó)EMD Millipore 公司)，ACAT1 siRNA(美國(guó)Qiagen公司)；胎牛血清(美國(guó)Sigma 公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；Transwell小室(美國(guó)Corning公司)， Matrigel膠(美國(guó)BD公司)；羧基熒光素二乙酸琥珀酰亞胺酯(CFSE，美國(guó)賽默飛世爾科技公司)，F(xiàn)ACS Aria流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)；TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)，引物及Taqman探針合成(美國(guó)賽默飛世爾科技公司)，7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理 HT-29置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2、95%濕度條件下傳代培養(yǎng)。將細(xì)胞按1×105/孔接種6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合狀態(tài)時(shí)分為6組，均置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中；A組不處理,B組加入膽固醇(終濃度1 μmol/L)處理48 h；C、D組和E、F組采用Lipofectamine 2000分別轉(zhuǎn)染陰性siRNA-HiperFect復(fù)合物、ACAT1 siRNA-HiperFect復(fù)合物，轉(zhuǎn)染48 h后D、F組加入膽固醇(終濃度1 μmol/L)處理48 h。

1.2.2 各組細(xì)胞增殖能力觀察 采用CFSE標(biāo)記法。收集各組細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/mL。加入CFSE 至終濃度為5 μmol/L，置 37 ℃ 培養(yǎng)箱，溫育 10 min；然后加入等體積胎牛血清中和，離心；加入PBS洗滌2次，收集細(xì)胞；培養(yǎng)72 h后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)；用FlowJo V10軟件圈定目標(biāo)細(xì)胞群，根據(jù)分裂細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，計(jì)算細(xì)胞增殖率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 各組細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell實(shí)驗(yàn)。將Matrigel膠與無(wú)血清培養(yǎng)液按1∶3均勻地鋪在8 μm PCF細(xì)胞小室膜上，每孔50 μL；放入37 ℃ 培養(yǎng)箱中，孵育4～5 h使其凝結(jié)成膠狀。收集各組細(xì)胞，用無(wú)血清DMEM/F12洗3次，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至 5×105/mL。Transwell上層小室中加入200 μL細(xì)胞懸液(1×105/孔)，下層小室中加入500 μL含20% FBS的細(xì)胞上清，置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育24 h。取出Transwell小室，小心擦去小室底層膜和未穿膜的細(xì)胞；PBS沖洗小室膜3次，4 ℃下甲醇固定30 min，取出控干；加入結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下計(jì)算5個(gè)視野的腫瘤細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 各組細(xì)胞遷移能力觀察 采用Transwell實(shí)驗(yàn)，操作方法同1.2.3，不同在于上室中不鋪Matrigel基底膜。

1.2.5 各組細(xì)胞中ACAT1 mRNA檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)定量PCR法。取各組細(xì)胞，采用TRIzol一步法抽提細(xì)胞總RNA，使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA，采用SYBR Green I 熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。ACAT-1上游引物為5′-CAAGGCGCTCTCTCTTAGATGAAC-3′, 下游引物為5′-GATAAAGAGAATGAGGAGGGCAATAA-3′，引物長(zhǎng)度為89 bp。反應(yīng)條件: 94 ℃預(yù)變性 10 min； 94 ℃變性30 s, 55 ℃退火1 min, 72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。用β-actin 作內(nèi)參照，上游引物 5′-GAACGGTGAAGGTGACA-3′,下游引物5′-TAGAGAGAAGTGGGGTGG-3′，引物長(zhǎng)度 168 bp。反應(yīng)條件: 95 ℃預(yù)變性10 min； 95 ℃變性30 s, 57 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。在延伸的過(guò)程中搜集熒光信號(hào), 于每次擴(kuò)增的同時(shí)設(shè)置無(wú)cDNA的陰性對(duì)照。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析程序分析擴(kuò)增結(jié)果, 以2-ΔΔCt表示ACAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力比較 B、D組細(xì)胞增殖率、侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)均高于其他各組(P均﹤0.05)，其余組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力比較±s)

注：與A組比較，aP﹤0.01；與B、D組比較，bP﹤0.01。

2.2 各組細(xì)胞中ACAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 A、B、C、D、E、F組細(xì)胞中ACAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.96±0.02、1.48±0.05、0.94±0.02、1.44±0.02、0.54±0.36、0.63±0.05；B、D組細(xì)胞中ACAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量高于其他各組(P均﹤0.05)，E、F組細(xì)胞中ACAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于其他各組(P均﹤0.05)，A組與C組、B組與D組、E組與F組間兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。

3 討論

關(guān)于結(jié)腸癌的病因在世界各國(guó)做了大量研究，發(fā)現(xiàn)相對(duì)低發(fā)病地區(qū)的居民(如中國(guó)、日本、非洲等)移居到高發(fā)病率的西方國(guó)家后，結(jié)腸癌發(fā)病率隨之增高。研究各種環(huán)境因素后，發(fā)現(xiàn)生活方式和飲食在結(jié)腸癌的發(fā)展中起重要作用[3]。高發(fā)病率國(guó)家的居民飲食具有高脂肪、高動(dòng)物蛋白、少谷物、少蔬果，即西方化飲食的特點(diǎn)，其中高脂肪飲食的影響最明顯；而另一方面，以低膽固醇為特點(diǎn)的地中海飲食和素食則會(huì)降低結(jié)腸癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[4]。自上世紀(jì)90年代中期開(kāi)始，我國(guó)大城市居民膳食中的脂肪產(chǎn)熱比例由十幾年前的25%猛增到了40%；同時(shí)，結(jié)腸癌的發(fā)病率開(kāi)始不斷上升，每年遞增4.2%，比全球每年上升2%的平均數(shù)超出了近2倍。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，高脂肪飲食特別是動(dòng)物脂肪,與結(jié)腸癌發(fā)生危險(xiǎn)高度相關(guān)，脂肪攝入量高比攝入量低的人群患結(jié)腸癌的危險(xiǎn)性明顯增加。對(duì)日本人群飲食結(jié)構(gòu)的研究同樣發(fā)現(xiàn), 食用肉類和動(dòng)物脂肪多者，其結(jié)腸癌發(fā)病率明顯增加。大量研究已經(jīng)明確，超重、肥胖、高脂血癥和癌癥的發(fā)展與癌癥相關(guān)死亡有著直接的聯(lián)系[5，6]。然而，高脂飲食是如何影響結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展,其機(jī)制尚未完全明確，存在各種假說(shuō)，其中膽固醇的作用備受關(guān)注。

膽固醇是哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜的重要組成部分，其在細(xì)胞的生長(zhǎng)分裂、穩(wěn)定DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)和控制膜結(jié)合酶的活性中起著不可或缺的作用[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，高膽固醇水平在腫瘤發(fā)展中起著重要作用。已有研究證實(shí)，高膽固醇可以刺激腫瘤生長(zhǎng)。最新研究發(fā)現(xiàn)，膽固醇可以導(dǎo)致40余種基因的表達(dá)發(fā)生變化，而這些基因多與細(xì)胞的生長(zhǎng)或凋亡相關(guān)，PI3K和MAPK等信號(hào)通路涉及其中。盡管許多研究試圖了解膽固醇在腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，然而具體哪些基因和信號(hào)通路如何參與其中仍未可知。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)ACAT不僅與冠心病和阿爾茨海默病密切相關(guān)[9～11]，還與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[12，13]。在膽固醇的吸收代謝過(guò)程中，ACAT的作用至關(guān)重要。其催化的膽固醇酯化反應(yīng)無(wú)論在細(xì)胞水平還是個(gè)體水平的膽固醇代謝平衡中都發(fā)揮了極其重要的作用，是細(xì)胞內(nèi)已知的惟一一種催化游離膽固醇與長(zhǎng)鏈脂肪酸連接形成膽固醇酯的酶，是參與吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和貯存膽固醇的一種極其重要的酶，可直接影響血液中膽固醇水平[14]。ACAT存在兩種形式：ACAT1和ACAT2。ACAT1 在幾乎各種組織和細(xì)胞中都有表達(dá), 主要作用是維持細(xì)胞內(nèi)膽固醇的代謝平衡；ACAT2 則只在肝臟和小腸細(xì)胞中表達(dá)，主要參與膽固醇的吸收和脂蛋白的裝配[15]。研究發(fā)現(xiàn)，ACAT/膽固醇酯化信號(hào)可能是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲的一種新途徑。在淋巴母細(xì)胞系CEM-CCRF的增殖過(guò)程中膽固醇酯必不可少,而ACAT抑制劑會(huì)影響細(xì)胞的增殖；在分離自患者的淋巴母細(xì)胞性T細(xì)胞白血病細(xì)胞中，伴隨ACAT mRNA水平增加的膽固醇酯化與細(xì)胞生長(zhǎng)速率呈正相關(guān)[16]。在腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中，也觀察到ACAT抑制劑能明顯降低腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖與侵襲[17]。另一方面，高膽固醇可以導(dǎo)致ACAT表達(dá)升高。Pramfalk等[18]在膽固醇負(fù)荷和缺失的條件下，分析人肝癌細(xì)胞株(HuH7和HepG2)ACAT的基因表達(dá)、酶活性及細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量；發(fā)現(xiàn)在膽固醇負(fù)荷條件下ACAT2 mRNA的表達(dá)上調(diào)，ACAT2酶活性增加，細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量增加，并呈現(xiàn)濃度依賴性，從而證實(shí)ACAT2對(duì)膽固醇代謝的調(diào)節(jié)發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平。

在我們的前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，ACAT1在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)高于癌旁組織。為進(jìn)一步探討ACAT1與結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)與侵襲的關(guān)系，本研究以人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT-29為細(xì)胞模型，探討高膽固醇對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響及其作用機(jī)制。結(jié)果顯示，膽固醇可促進(jìn)HT-29細(xì)胞增殖，增加侵襲和遷移細(xì)胞的數(shù)量。通過(guò)siRNA抑制ACAT1基因的表達(dá)，則膽固醇促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移的作用得到抑制。結(jié)腸癌作為發(fā)病率、病死率迅猛上升的常見(jiàn)惡性腫瘤，不僅給患者帶來(lái)了巨大的痛苦，也給家庭和社會(huì)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本研究發(fā)現(xiàn)，ACAT1在膽固醇與結(jié)腸癌發(fā)生中的關(guān)鍵作用，今后將探尋參與其中的信號(hào)通路，為結(jié)腸癌預(yù)防和治療增加新的手段。

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文后參考文獻(xiàn)的著錄方法

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Effect of cholesterol on proliferation, invasion and migration of human colon cancer cells

CHENXin,WULong,ZHANGYiqiao,CHENNeng,XUXiming

(RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

Objective To observe the effect of cholesterol on the proliferation, invasion and migration of human colon cancer cells and to discuss the possible mechanism. Methods The human colon cancer cells HT-29 in the logarithmic growth phase were divided into 6 groups: group A without any treatment, group B which was added with cholesterol for 48 h (final concentration: 1 μmol/L), group C/D and E/F which were transfected by negative siRNA -HiperFect complexes and Acyl coenzyme A cholesterol acyltransferase 1 (ACAT1) gene siRNA-HiperFect complexes using Lipofectamine 2000, respectively. After 48 h, the cells in the groups D and F

the same treatment of group B. CFSE staining assay was used to evaluate the proliferation of cells. Transwell assay was used to evaluate the migration and invasion of cells. The expression of ACAT1 gene was detected by real-time PCR. Results The cell proliferation rate, the cell invasion and migration numbers in the group B and D were higher than those of the other groups (allP<0.05), and no statistically significant difference was found between any two of groups A, C, E and F. The relative expression of ACAT1 mRNA in the groups A, B, C, D, E and F was 0.96±0.02, 1.48±0.05, 0.94±0.02, 1.44±0.02, 0.54±0.36 and 0.63±0.05, the relative expression of ACAT1 mRNA in the groups B and D was higher than that of the other groups (all P<0.05), the relative expression of ACAT1 mRNA in the groups E and F was lower than that of the other groups (allP<0.05), and no statistically significant difference was found between group A/C, B/D and E/F.Conclusion Cholesterol can improve the proliferation, migration and invasion of human colon cancer cells by promoting ACAT1 gene expression.

colon carcinoma; cholesterol; cholesterol acyltransferase 1; cell proliferation; cell invasion; cell migration

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81302133)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)基金資助項(xiàng)目(2042014kf0149)；湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012FKC143)。

陳心(1981-)，女，博士,主治醫(yī)師,主要研究方向?yàn)榻Y(jié)直腸癌腫瘤的發(fā)病機(jī)制與防治。E-mail： whdxchenxin@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.18.001

R730.3

A

1002-266X(2017)18-0001-04

2016-12-31)