趙立民

（廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司研究院，廣東新興 527400）

籃式反應(yīng)器發(fā)酵PCV過程中連續(xù)收獲病毒的可行性研究

趙立民

（廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司研究院，廣東新興 527400）

應(yīng)用NBS籃式細(xì)胞反應(yīng)器高密度培養(yǎng)PK-15細(xì)胞，接種PCV病毒后，采取邊補(bǔ)加維持液邊收獲病毒液的方式，最終收獲相當(dāng)于反應(yīng)器約3倍體積的高滴度病毒抗原，生產(chǎn)效率明顯提升，證明該工藝具備可行性。

反應(yīng)器；片狀載體；PK-15細(xì)胞；PCV；連續(xù)收毒

豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus，PCV）屬圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，有PCV1和PCV2兩個(gè)血清型，其中 PCV1為非致病性的病毒，PCV2為致病性的病毒，是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）、仔豬先天性震顫（CT）、豬皮炎腎炎綜合征（PDNS）等多種疾病的主要病原[1]，成為當(dāng)前威脅我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的主要豬疾病病源之一。

目前國(guó)內(nèi)獸苗企業(yè)通常采用轉(zhuǎn)瓶或反應(yīng)器發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)PCV病毒抗原[2]，采用一次性收獲病毒的工藝，并使用氨基葡萄糖作為添加劑促進(jìn)病毒擴(kuò)繁。雖然該工藝均可獲得較高滴度的抗原，但是病毒液收獲量只相當(dāng)于細(xì)胞培養(yǎng)體積，產(chǎn)率不高[3]。

籃式生物反應(yīng)器是美國(guó)NBS公司產(chǎn)品，具有剪切力小、自動(dòng)控制精準(zhǔn)、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)[3]。與其配套使用的片狀載體內(nèi)部具有網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，可以為細(xì)胞生長(zhǎng)提供高生長(zhǎng)面積/容積比，1g載體可提供1200cm2的生長(zhǎng)面積，利于細(xì)胞高密度生長(zhǎng)[4]。PCV是典型的細(xì)胞外分泌型病毒，在病毒復(fù)制的過程中宿主細(xì)胞不會(huì)立即裂解死亡，本文根據(jù)PCV的這一特點(diǎn)，采用籃式反應(yīng)器與片狀載體大規(guī)模培養(yǎng)PK-15細(xì)胞，在收毒方法上進(jìn)行了連續(xù)收獲病毒液的嘗試。

1 材料和方法

1.1 材料

1·1·1 細(xì)胞系與病毒

PK-15細(xì)胞，購(gòu)自ATCC，100～150代；PCV2病毒，同業(yè)贈(zèng)送，經(jīng)特定處理后無致病性，120～180代。

1·1·2 細(xì)胞培養(yǎng)液

DMEM培養(yǎng)基（Gibco，高糖型），每升添加3.7gNaHCO3，用Millipore超純水溶解，稀HCl調(diào)節(jié)pH至7.2后，0.22um濾芯除菌過濾；使用時(shí)生長(zhǎng)液添加8%新生牛血清（Hyclone），維持液添加1%新生牛血清（Hyclone）。

1·1·3 試劑

葡萄糖檢測(cè)試劑盒（南京建成），ELISA試劑盒（SERELISA PCV2，SYNBIOTICS），自配0.1mol/L NaOH溶液（滅活病毒用）。

1·1·4 主要設(shè)備與儀器

美國(guó)NBS籃式反應(yīng)器（BIOFLO 510型，有效培養(yǎng)體積30～32L）及片狀載體（DISK），酶標(biāo)儀（Thermo），紫外分光光度計(jì)（國(guó)產(chǎn)美譜達(dá)），CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo 3111型），超凈工作臺(tái)（蘇凈安泰）。

1·1·5 器具

細(xì)胞培養(yǎng)瓶（康寧75cm2），細(xì)胞工廠（康寧5層），電動(dòng)移液器（Thermo）。

1.2 方法

先期采用細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法將PCV2病毒基因組導(dǎo)入PK-15細(xì)胞中，使之在培養(yǎng)瓶中能夠正常生長(zhǎng)傳代。細(xì)胞傳代培養(yǎng)后2天，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液PCV2抗原，確認(rèn)陽性后利用細(xì)胞工廠擴(kuò)大培養(yǎng)該細(xì)胞，作為反應(yīng)器發(fā)酵的細(xì)胞種，期間重復(fù)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液PCV2抗原，確保細(xì)胞能夠持續(xù)保持陽性結(jié)果。

籃式反應(yīng)器裝填1000g片狀載體，原位高壓滅菌后接種PK-15細(xì)胞，接種密度2*105個(gè)/ml接種，采用灌注培養(yǎng)方式進(jìn)行高密度培養(yǎng)。5～6天后，細(xì)胞達(dá)到最大生長(zhǎng)密度，排空培養(yǎng)液，注入維持液。注入維持液后約36h后開始少量收獲病毒液，此后每隔12h取樣4℃保存，待檢病毒效價(jià)。收獲病毒液時(shí)應(yīng)用籃式反應(yīng)器自帶的蠕動(dòng)泵，一邊收獲病毒培養(yǎng)液一邊向反應(yīng)器內(nèi)補(bǔ)加等體積的新鮮維持液，流速以能夠維持反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的一定量的葡萄糖濃度為準(zhǔn)，并保證反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)液體積維持在30～32L范圍內(nèi)。每隔4h取樣檢測(cè)培養(yǎng)液中葡萄糖濃度，以便及時(shí)調(diào)整流速。當(dāng)細(xì)胞日均耗糖量下降到0.5g/L以下，耗氧曲線有明顯下降趨勢(shì)時(shí)，即刻終止細(xì)胞發(fā)酵，收獲全部病毒液，放入4℃冷柜保存。反應(yīng)器內(nèi)注入事先配制好的0.1mol/L NaOH溶液，滅活罐體內(nèi)病毒，防止實(shí)驗(yàn)室內(nèi)擴(kuò)散。

將上述流程中維持的葡萄糖濃度分為1.0g/L、1.5g/L、2.0g/L 3個(gè)梯度，分別進(jìn)行PCV2病毒發(fā)酵，相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)命名為實(shí)驗(yàn)1、實(shí)驗(yàn)2、實(shí)驗(yàn)3，將測(cè)定的數(shù)據(jù)與常規(guī)方法（不更換維持液，直接收獲全部病毒液）實(shí)驗(yàn)4做對(duì)比。所收獲的病毒溶液測(cè)定效價(jià)后全部使用0.1mol/L NaOH溶液做滅活處理。

病毒毒價(jià)測(cè)定采用ELLSA試劑盒法，結(jié)果用吸光度值表示，無單位[5]。

1.3 結(jié)果

表 病毒液毒價(jià)、收毒時(shí)間、收獲體積對(duì)比

圖 取樣毒價(jià)曲線圖

如下圖、表，實(shí)驗(yàn)1～3的收獲病毒結(jié)束時(shí)間分別為125h、133h、136h，實(shí)驗(yàn)4在接毒后72h到達(dá)毒價(jià)峰值，此時(shí)收獲最佳，如不收獲，毒價(jià)將持續(xù)降低。采用連續(xù)收毒方式，收獲病毒的時(shí)間延長(zhǎng)近1倍，維持的葡萄糖濃度越高，收毒的時(shí)間維持越長(zhǎng)；收獲的病毒液體積，是常規(guī)方法的3倍左右；其中實(shí)驗(yàn)3收獲體積最多，達(dá)到96L。實(shí)驗(yàn)1～3的病毒液平均毒價(jià)與常規(guī)方法接近，實(shí)驗(yàn)2的平均毒價(jià)甚至超過了常規(guī)方法。實(shí)驗(yàn)1～3中取樣的毒價(jià)峰值（96h左右）均高于常規(guī)方法的取樣峰值（72h），而且峰值出現(xiàn)的時(shí)間比常規(guī)方法推后了約24h。

1.4 討論

PCV屬于細(xì)胞外分泌型病毒，在病毒復(fù)制的過程中宿主細(xì)胞逐步而非立即死亡。在常規(guī)方法中，不進(jìn)行換液操作，當(dāng)病毒液毒價(jià)達(dá)到峰值即進(jìn)行全部收毒下罐操作，而此時(shí)大部分宿主細(xì)胞尚有活力，依然有能力繼續(xù)復(fù)制病毒。采用連續(xù)收毒的方法，更換維持液后36h后即進(jìn)行換液操作，因?yàn)樾迈r培養(yǎng)基的注入，宿主細(xì)胞有較充足的營(yíng)養(yǎng)得以進(jìn)行正常的生理代謝活動(dòng)，細(xì)胞活力要比同時(shí)期的常規(guī)方法高很多。另一方面，由于排出的培養(yǎng)液中含有病毒，同時(shí)期的病毒含量卻低于常規(guī)方法。但隨著時(shí)間的逐步積累，病毒含量逐步達(dá)到甚至超過常規(guī)方法的峰值，只是在時(shí)間上相應(yīng)的推遲。由于細(xì)胞活力高，日耗糖量大，峰值會(huì)持續(xù)一段時(shí)間，此時(shí)連續(xù)收獲的病毒液體積最多，質(zhì)量也較高。

另一方面，實(shí)現(xiàn)連續(xù)收毒工藝與片狀載體的關(guān)聯(lián)很大，該型載體內(nèi)部具有親水性三維多孔隙，為宿主細(xì)胞提供較高的生長(zhǎng)面積/容積比，宿主細(xì)胞附著在載體上能夠大量繁殖，相比傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶等工藝技術(shù)其細(xì)胞密度提高很大。在片狀載體中，單個(gè)宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)呈球狀，多個(gè)細(xì)胞聚集成葡萄串狀，貼附在載體內(nèi)部的纖維束上，形成立體結(jié)構(gòu)。而PCV是一種細(xì)胞外分泌型病毒，在病毒復(fù)制擴(kuò)增的過程中，病毒由外至內(nèi)逐層侵蝕宿主細(xì)胞，使宿主細(xì)胞非同步死亡，即在一部分宿主細(xì)胞死亡的同時(shí)，另一部份宿主細(xì)胞仍存活并依舊復(fù)制病毒，正因?yàn)槿绱耍攀贡疚闹羞B續(xù)收獲病毒的工藝方法得以實(shí)現(xiàn)。

而在更為傳統(tǒng)的PCV2抗原生產(chǎn)中，采用的是細(xì)胞培養(yǎng)接種接毒同時(shí)進(jìn)行，細(xì)胞長(zhǎng)滿更換維持液后添加氨基葡萄糖試劑，以促進(jìn)病毒在細(xì)胞內(nèi)的增殖，由于氨基葡萄糖對(duì)細(xì)胞無法避免的毒性，細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)會(huì)迅速的死亡，無法達(dá)到連續(xù)收獲病毒的目的。細(xì)胞種準(zhǔn)備過程中因?yàn)榧?xì)胞密度相對(duì)于反應(yīng)器差距較大，其擴(kuò)繁病毒的能力不足，但只要結(jié)果持續(xù)檢測(cè)為陽性，在反應(yīng)器中隨著細(xì)胞密度的擴(kuò)大與時(shí)間的累積，毒價(jià)會(huì)很快提升。

需要指出的是，本文所設(shè)定的各梯度試驗(yàn)中的每項(xiàng)參數(shù)可能并非最佳。若想采用該工藝達(dá)到病毒效價(jià)與收獲量的更佳效果，需要對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)、單日耗糖量、換液流速、培養(yǎng)基葡萄糖添加量、接毒后葡萄糖濃度變化等一系列參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，進(jìn)一步提高單細(xì)胞產(chǎn)毒力，預(yù)計(jì)會(huì)有更大的突破進(jìn)展。

2 結(jié)論

本文對(duì)應(yīng)用籃式反應(yīng)器連續(xù)收獲PCV2病毒的生產(chǎn)工藝進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法具有良好的的可行性，采用該獲得的PCV2毒價(jià)與常規(guī)方法相當(dāng)或更好，而收獲的病毒液體積達(dá)到了常規(guī)方法的3倍左右，能極大的提高生產(chǎn)效率。本實(shí)驗(yàn)中的相關(guān)參數(shù)可以通過相似實(shí)驗(yàn)繼續(xù)優(yōu)化，使病毒液毒價(jià)與收獲量達(dá)到最佳效果。

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