李俊英 李際強(qiáng)

(廣東省廣州市蘿崗區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科，廣東 廣州 510530)

蘇黃止咳膠囊對(duì)呼吸道合胞病毒作用的體外實(shí)驗(yàn)研究※

李俊英 李際強(qiáng)△

(廣東省廣州市蘿崗區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)科，廣東 廣州 510530)

目的 觀察蘇黃止咳膠囊對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)導(dǎo)致病變的體外抑制作用。方法 接種RSV long株于人肺癌細(xì)胞(A549)，采用細(xì)胞病變效應(yīng)法(CPE)，觀察蘇黃止咳膠囊與三拗片體外對(duì)RSV的作用。結(jié)果 藥物在A549細(xì)胞上的半數(shù)毒性濃度(TC50)：三拗片為3.85 mg/mL，蘇黃止咳膠囊為4.09 mg/mL，利巴韋林為3.58 mg/mL。蘇黃止咳膠囊在無(wú)毒濃度1.36 mg/mL、三拗片在0.62 mg/mL、利巴韋林在0.625 mg/mL下能完全抑制RSV。結(jié)論 蘇黃止咳膠囊與三拗片均有一定的抗RSV作用，為2種藥物臨床治療呼吸道病毒感染性疾病提供一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

呼吸道合胞病毒；藥物作用；中藥；膠囊；藥理學(xué)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)感染是臨床常見(jiàn)的呼吸道病毒感染性疾病，臨床發(fā)病率高，尤其兒童更易發(fā)病，咳嗽或哮喘為臨床常見(jiàn)表現(xiàn)[1]。臨床研究認(rèn)為，蘇黃止咳膠囊治療呼吸道病毒感染后咳嗽療效較好[2-3]。三拗片是治療呼吸道病毒感染風(fēng)寒襲肺證較有效的藥物[4-5]。本實(shí)驗(yàn)研究了蘇黃止咳膠囊與三拗片對(duì)RSV導(dǎo)致病變的抑制作用，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 蘇黃止咳膠囊(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)北京海燕藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20103075，批號(hào)：15060312)，三拗片(江蘇濟(jì)川制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20090708，批號(hào)：1505123)。實(shí)驗(yàn)時(shí)將2種藥物分別加純水完全溶解后分管，置80 ℃間歇滅菌3 d，離心后無(wú)菌分管放置冰箱存放備用。陽(yáng)性藥物：利巴韋林(原料藥，純度>98%，購(gòu)自廣東肇慶鼎湖藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20140825)。

1.1.2 細(xì)胞與病毒 人肺癌細(xì)胞(A549)，購(gòu)于中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)研究所病毒室傳代保種。RSV long株引自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，編號(hào)為VR-26)，并于人肺癌細(xì)胞(A549)中傳代擴(kuò)增及測(cè)定病毒滴度。經(jīng)測(cè)定RSVlong株在人肺癌細(xì)胞(A549)上的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)為7.0。

1.1.3 主要試劑及儀器 小牛血清；DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)GIBCO公司)；二氧化碳(CO2)恒溫培養(yǎng)箱(Real Force，型號(hào)：HF90/HF240)；通用型酶標(biāo)儀(Bio-tek instrument，INC.型號(hào)：ELX800)；倒置顯微鏡(Olympus，型號(hào)：CK40)；生物安全柜(Haier，型號(hào)：HR40-ⅡA2)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理 精密稱取蘇黃止咳膠囊與三拗片2個(gè)樣品，用足量三蒸水充分浸泡溶脹后置于60 ℃水浴2 h后離心，取上清液后隔水蒸騰濃縮至母液濃度，蘇黃止咳膠囊為434.1 mg/mL，三拗片為296.8 mg/mL，母液以間歇滅菌法除菌(80 ℃水浴30 min，連續(xù)3 d)，離心分裝凍于-20 ℃?zhèn)溆?。精密稱取利巴韋林0.052 4 g，用無(wú)菌DMEM培養(yǎng)基5.2 mL充分溶解后，0.22 μm過(guò)濾除菌分裝凍于-20 ℃?zhèn)溆?，母液濃度?0.0 mg/mL。

1.2.2 藥物細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入(2.0×103個(gè)/mL)的人肺癌細(xì)胞(A549)，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層后，另加入不同濃度的藥物，每個(gè)藥物8個(gè)濃度，每濃度4孔。逐日觀察細(xì)胞病變，培養(yǎng)6 d后則終止實(shí)驗(yàn)，受試樣品對(duì)細(xì)胞的毒性作用通過(guò)四甲基偶氮唑鹽(MTT)染色法進(jìn)行測(cè)定。并計(jì)算出藥物的半數(shù)毒性濃度(TC50)。實(shí)驗(yàn)時(shí)設(shè)陽(yáng)性藥利巴韋林對(duì)照、正常細(xì)胞對(duì)照。根據(jù)MTT染色讀取490 nm下的光密度值(OD值)，參照文獻(xiàn)[6]方法計(jì)算各藥物各濃度下對(duì)細(xì)胞的毒性作用和TC50。公式如下：

A=log>50%藥物濃度 B=log<50%藥物濃度 C=A-B

1.2.3 藥物體外抑制作用實(shí)驗(yàn)[7]常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng)并消化人肺癌細(xì)胞(A549)，用DMEM培養(yǎng)基調(diào)整接種密度至2.0×105個(gè)/mL，以0.1 mL/孔接種于96孔一次性培養(yǎng)板上，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)至緊密單層后備用。選取無(wú)毒濃度作為藥物的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。先將稀釋好的各濃度的藥物接種于96孔細(xì)胞板上，每個(gè)樣品濃度接種4個(gè)細(xì)胞復(fù)孔，加樣后直接接種100TCID50病毒懸液100 μL繼續(xù)培養(yǎng)6 d，35 ℃、5%CO2。同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性藥利巴韋林對(duì)照、病毒對(duì)照和正常細(xì)胞對(duì)照(用于與實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)照，表中不顯示)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后以顯微鏡觀察，細(xì)胞病變效應(yīng)法(CPE)評(píng)價(jià)受試樣品對(duì)病毒的抑制作用。

2 結(jié) 果

2.1 各藥物在人肺癌細(xì)胞(A549)上的毒性作用 見(jiàn)表1。

表1 各藥物在人肺癌細(xì)胞(A549)上的毒性作用

注：“-”表示對(duì)細(xì)胞完全無(wú)毒

由表1可見(jiàn)，藥物在人肺癌細(xì)胞(A549)上的TC50：三拗片為3.85 mg/mL，蘇黃止咳膠囊為4.09 mg/mL，利巴韋林為3.58 mg/mL。

2.2 各藥物在人肺癌細(xì)胞(A549)上對(duì)RSV導(dǎo)致病變的抑制作用 見(jiàn)表2。

表2 各藥物在人肺癌細(xì)胞(A549)上對(duì)RSV導(dǎo)致病變的抑制作用

注：“⊙”表示樣品對(duì)細(xì)胞具有毒性作用，造成細(xì)胞破碎、固縮等；藥物對(duì)照中“-”表示無(wú)毒、無(wú)病變；藥物加病毒中“-”表示細(xì)胞病變程度<10%，“+”表示細(xì)胞病變程度25%～50%，“++”表示細(xì)胞病變程度50%～70%，“+++”表示細(xì)胞病變程度75%～90%，“++++”表示細(xì)胞病變程度>90%

由表2可見(jiàn)，蘇黃止咳膠囊在無(wú)毒濃度1.36 mg/mL、三拗片在0.62 mg/mL、利巴韋林在0.625 mg/mL下能完全抑制RSV。

3 討 論

RSV是一種RNA病毒，屬副黏液病毒科，該病毒常經(jīng)空氣飛沫或密切接觸傳播，是兒童呼吸道感染最常見(jiàn)的病原體之一，兒童RSV相關(guān)下呼吸道感染常見(jiàn)為毛細(xì)支氣管炎和肺炎，發(fā)病率高，其中部分患兒需要住院治療，甚至死亡，嚴(yán)重威脅患兒生命健康。同時(shí)RSV感染還與此后的喘息發(fā)作及哮喘關(guān)系密切[8]，因此RSV感染的預(yù)防和治療十分重要。

中醫(yī)學(xué)在治療呼吸道病毒感染方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，但目前研究多集中于清熱解毒類藥物，金銀花在體外可能通過(guò)直接滅活、阻止病毒吸附和抑制生物合成3種方式發(fā)揮抗RSV作用[9]；連翹、野菊花提取物等均有體外抑制RSV作用[10-11]。我們發(fā)現(xiàn)呼吸道病毒感染的患者風(fēng)寒證或兼夾風(fēng)邪證占據(jù)了較大的比例[12]，臨床上“治風(fēng)”為主的蘇黃止咳膠囊及治療風(fēng)寒襲肺證的三拗片已廣泛應(yīng)用。蘇黃止咳膠囊根據(jù)國(guó)醫(yī)大師晁恩祥“風(fēng)咳”理論組方而成，由麻黃、紫蘇葉、地龍、蜜枇杷葉、炒紫蘇子、蟬蛻、前胡、炒牛蒡子、五味子等組成。其中麻黃散寒平喘，為君藥；五味子、紫蘇葉收斂肺氣，止咳化痰，為臣藥；前胡、紫蘇子助麻黃疏散風(fēng)邪，降氣止咳，為佐藥；配以蟬蛻、地龍加強(qiáng)其疏風(fēng)散邪功效，并利咽止癢。諸藥共奏疏風(fēng)宣肺、解痙止咳之功[13]。三拗片源于《太平惠民和劑局方》三拗湯，由麻黃、杏仁、甘草及生姜等組成，方中麻黃為君，發(fā)散表邪，宣暢肺氣；杏仁為臣，降氣止咳化痰；二藥配伍，一宣一降，調(diào)暢氣機(jī)，用于咳嗽痰多。生姜溫肺止咳；甘草補(bǔ)脾益氣，止咳祛痰，調(diào)和藥性，二藥共為佐使?，F(xiàn)代藥理研究表明，麻黃水提液在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)RSV有一定抑制作用[14]；甘草能夠?qū)θ梭w進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，減輕氣道炎癥，并對(duì)多種呼吸科常見(jiàn)致病細(xì)菌(葡萄球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等)及病毒(RSV、流感病毒等)均有一定抑制作用[15]；紫蘇葉單味藥有較好的體外抗RSV作用[16]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，蘇黃止咳膠囊在無(wú)毒濃度1.36 mg/mL、三拗片在0.62 mg/mL下能完全抑制RSV，二者均有較好的抗呼吸道病毒作用，并且顯示了較低的細(xì)胞毒性。對(duì)照藥物利巴韋林在體外有較好的抗RSV作用，但其在臨床由于療效一般、成本高及使用繁瑣，并有研究表明利巴韋林和抗生素治療RSV引起的毛細(xì)支氣管炎可能無(wú)效[17]，臨床上較少應(yīng)用。2種中成藥組方簡(jiǎn)單，攜帶、服用方便，除了本實(shí)驗(yàn)提示的抗RSV作用外，還有較好的止咳、化痰、平喘等作用[18-19]，具有較好的應(yīng)用前景。本研究結(jié)果為2種藥物臨床治療呼吸道病毒感染性疾病提供一定的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)，有待進(jìn)一步深入研究，以闡明藥物的作用機(jī)制。

[1] 李際強(qiáng)，云芯芯，張忠德，等.應(yīng)用晁恩祥風(fēng)咳理論治療病毒感染致氣道高反應(yīng)的研究思路[J].中國(guó)中醫(yī)急癥，2014，23(8):1479-1481.

[2] 張燕萍，晁燕，苗青，等.蘇黃止咳膠囊治療感冒后咳嗽的隨機(jī)對(duì)照研究[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2008，28(8):698-701.

[3] 張靜，張紓難，王雪京，等.蘇黃止咳膠囊治療感冒后咳嗽臨床觀察[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，17(1):107-110.

[4] 陳麒，張煒，張學(xué)超.三拗片治療急、慢性支氣管炎風(fēng)寒襲肺證80例分析[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2012，16(1):87-88，91.

[5] 樊茂蓉，王冰，高金柱，等.三拗片治療急性支氣管炎(風(fēng)寒襲肺證)的臨床研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2014，19(1):44-48.

[6] 徐培平，趙昉，劉妮，等.中藥體外防治甲型H1N1流感病毒實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，19(8):1121-1124.

[7] 劉妮，孟以蓉，趙昉.穿心蓮水提取物的抗Ⅰ型單純皰疹病毒作用[J].熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2006，10(6)：1098-1107.

[8] 虞燕萍，黃先玫.兒童呼吸道合胞病毒感染預(yù)防和治療研究進(jìn)展[J].國(guó)際呼吸雜志，2014，34(10):776-780.

[9] 張旋，鄭明星，朱志兵，等.金銀花體外抗呼吸道合胞病毒作用研究[J].新中醫(yī)，2014，46(6):204-206.

[10] 田文靜，李洪源，姚振江，等.連翹抑制呼吸道合胞病毒作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，38(5):421-423.

[11] 張振亞，方學(xué)平，刁志花，等.野菊花提取物抑制呼吸道合胞病毒作用的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22(4):273-276.

[12] 林俏麗，黃增嬋，李際強(qiáng).廣州地區(qū)6402例流感樣病例臨床特點(diǎn)與中醫(yī)證型研究[J].江西中醫(yī)藥，2015，46(12):35-37.

[13] 李際強(qiáng)，韓云，張忠德，等.晁恩祥治療風(fēng)咳的臨床經(jīng)驗(yàn)探析[J].江西中醫(yī)藥，2010，41(7):13-14.

[14] 朱欣，李聞文.麻黃水提液抑制呼吸道合胞病毒作用實(shí)驗(yàn)研究[J].實(shí)用預(yù)防醫(yī)學(xué)，2012，19(10):1555-1557.

[15] 呂小華，吳鐵，覃冬云.甘草對(duì)慢性小鼠哮喘模型氣道炎癥及外周血Th1/Th2失衡的影響[J]．中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2006，11(5):532-534.

[16] 姚梅悅，周長(zhǎng)征，陳飛，等.白芷、防風(fēng)、紫蘇葉配伍的體外抗病毒追蹤[J].世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，10(6):782-784.

[17] 劉恩梅，彭才靜.呼吸道合胞病毒感染防治進(jìn)展[J].臨床兒科雜志，2011，29(8):705-707.

[18] 馬春華，汪姍姍，馬世平，等.三拗湯對(duì)哮喘小鼠變應(yīng)性氣道炎癥的影響及其成分分析[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(19):149-153.

[19] 馬錦地，謝洋，李建生.蘇黃止咳膠囊治療咳嗽變異性哮喘的Meta分析[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2015，30(4):477-480.

(本文編輯：習(xí) 沙)

Effects of Suhuang-zhike capsule on respiratory syncytial virus in vitro experimental study

LIJunying*,LIJiqiang.

*DepartmentofInternalMedicine,LuogangDistrictHospitalofTraditionalChineseMedicineinGuangzhouCity,Guangdong,Guangzhou510530

Objective To observe the inhibitory effect of Suhuang-zhike capsule on respiratory syncytial virus-induced (RSV-induced) desease. Methods RSV long strain was inoculated in A549 cells to observe the effects of Suhuang-zhike capsule and San'ao piece on RSV in vitro by cytopathogenic effect inhibition. Results Median toxic concentration (TC50)on A549 cells: San'ao piece was 3.85 mg/mL, Suhuang-zhike capsule was 4.09 mg/mL, and ribavirin was 3.58 mg/mL. Suhuang-zhike capsule was able to inhibit RSV completely at 0.63 mg/mL of non-toxic concentration, San'ao piece was 0.62 mg/mL, and ribavirin could inhibit RSV at 0.625 mg/mL. Conclusion Suhuang-zhike capsule and San'ao piece have a certain effect of anti-RSV, and provide a certain laboratory basis for clinical treatment of respiratory virus infectious diseases.

Respiratory syncytial virus; Drug effect; Traditional Chinese medicine; Capsules; Pharmacology

※ 項(xiàng)目來(lái)源：2013年度廣東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：S2013010012179)

李俊英(1975—)，女，主治醫(yī)師，學(xué)士。從事中西醫(yī)結(jié)合治療內(nèi)科疾病的臨床與研究工作。

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.04.023

R373.1；R965；R285.5

A

1002-2619(2017)04-0575-04

2016-05-12)

△ 通訊作者：廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院綜合三科，廣東 廣州 510006