楊曉寰

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 汕頭 515041)

松果菊苷對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2生長和縫隙連接細(xì)胞通訊的影響※

楊曉寰

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 汕頭 515041)

目的 觀察松果菊苷(ECH)對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2生長和縫隙連接細(xì)胞通訊(GJIC)的影響。方法 Alamar Blue法繪制HepG2細(xì)胞生長曲線，并檢測ECH的細(xì)胞毒作用；劃痕標(biāo)記染料示蹤技術(shù)(SL/DT)法觀察空白對(duì)照組、API陽性對(duì)照組、AGA陰性對(duì)照組和ECH組對(duì)GJIC的影響；異硫氰酸熒光素(FITC)間接免疫熒光法觀察ECH對(duì)縫隙連接蛋白Cx43表達(dá)的影響。結(jié)果 HepG2細(xì)胞在20 000個(gè)/mL的細(xì)胞密度Alamar Blue還原率與時(shí)間有線性關(guān)系。ECH(5、10、20、40和80 μM)處理HepG2細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率分別為(92.69±3.35)%、(88.33±2.12)%、(80.97±2.50)%、(76.95±1.40)%和(69.09±1.11)%(P<0.01)。抑制率最高(80 μM濃度下)為30.91%。IC50為467.8 μM(368.3 μg/mL)。SL/DT顯示陽性對(duì)照芹黃素和ECH處理24 h后，熒光染料在劃痕外4列細(xì)胞出現(xiàn)了明顯熒光(++++)，說明細(xì)胞出現(xiàn)染料傳輸?shù)默F(xiàn)象。間接免疫熒光法對(duì)Cx43表達(dá)進(jìn)行計(jì)分，空白對(duì)照組細(xì)胞得分為(1.40±0.55)分，ECH組得分為(1.60±0.55)分。結(jié)果表明ECH組的Cx43表達(dá)增強(qiáng)不明顯。結(jié)論 ECH對(duì)HepG2細(xì)胞有細(xì)胞毒作用，同時(shí)可增強(qiáng)GJIC功能，但Cx43表達(dá)不明顯，為ECH抗腫瘤機(jī)制提供依據(jù)。

肝腫瘤，實(shí)驗(yàn)性;病理學(xué);皂苷類；基因表達(dá)；細(xì)胞間通訊

惡性腫瘤是現(xiàn)今全世界最主要的發(fā)病和致死原因，每年癌癥新發(fā)病例約1 400萬，死亡約800萬，2015年因癌癥死亡人數(shù)占全球死亡數(shù)的1/6，造成男性死亡的5種最常見癌癥依次為肺癌、肝癌、胃癌、結(jié)直腸癌及前列腺癌，造成女性死亡的5種最常見癌癥依次為乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌及胃癌，我國新發(fā)癌癥病例和死亡人數(shù)均居世界首位[1]。如何有效防治惡性腫瘤仍然是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)?？p隙連接(gap junction,GJ)是相鄰細(xì)胞間作用的直接通道。縫隙連接細(xì)胞通訊(gap junctional intercellular communication，GJIC)是指直徑<1.5 nm、分子量<1 kDa的小分子物質(zhì)或水溶性的細(xì)胞代謝物能通過縫隙連接通道進(jìn)行物質(zhì)和能量交換，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生命活動(dòng)。腫瘤形成的一個(gè)重要原因在于相鄰的腫瘤細(xì)胞間及腫瘤細(xì)胞與相鄰正常細(xì)胞間出現(xiàn)的縫隙連接功能的異?；蛉笔2]。中醫(yī)藥具有毒副作用少的優(yōu)點(diǎn)，肉蓯蓉具有補(bǔ)益機(jī)體陽氣，提高腫瘤患者機(jī)體免疫力的作用[3]。本研究觀察了肉蓯蓉的主要活性成分松果菊苷(ECH)對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用和對(duì)腫瘤細(xì)胞縫隙連接功能的影響，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 ECH為中國藥品生物制品檢定所的對(duì)照品，18-α甘草酸(AGA)和芹黃素(API)為Sigma公司產(chǎn)品，以上純度均>98%(高效液相色譜法)。Alamar Blue為AbD公司產(chǎn)品，細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640和0.25%含乙二胺四乙酸(EDTA)胰酶的消化液為GIBCO公司產(chǎn)品，新生牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。ECH經(jīng)二甲基亞砜(DMSO)助溶后用磷酸鹽緩沖液(PBS)配成2 mM，調(diào)pH為7.2，0.22 μm過濾除菌，分裝保存，于1個(gè)月內(nèi)使用。以上藥物在培養(yǎng)體系中溶劑濃度不超過1%。HepG2購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HepG2 37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下用含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞生長曲線的繪制 收獲對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，分別按每孔2 500、5 000、10 000、20 000、25 000和50 000個(gè)/mL的細(xì)胞濃度接種入96孔板培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。每孔加入20 μL Alamar Blue，用酶標(biāo)儀分別測定570、630 nm波長的吸收值，計(jì)算Alamar Blue還原率。以還原率為縱坐標(biāo)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.4 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)(Alamar Blue法) 收獲對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，按照每孔4 000個(gè)細(xì)胞接種入96孔板培養(yǎng)24 h后分別加ECH 0、5、10、20、40和80 μM培養(yǎng)。每孔加入20 μL Alamar Blue，24、48和72 h時(shí)用酶標(biāo)儀分別測定570、630 nm波長的吸收值，計(jì)算每個(gè)濃度及時(shí)間段存活率。以存活率為縱坐標(biāo)，藥物濃度為橫坐標(biāo)，計(jì)算藥物IC50值。

1.5 劃痕標(biāo)記染料示蹤技術(shù)(scrape-loading dye transfer assay,SL/DT)檢測ECH對(duì)HepG2細(xì)胞GJ功能的影響 細(xì)胞按0.8×106個(gè)/孔接種到六孔板中，分為空白對(duì)照組、API陽性對(duì)照組、AGA陰性對(duì)照組和ECH組，藥物孵育36 h后用PBS沖洗3遍并吸凈。l mL 0.1%羅氏黃染液加入培養(yǎng)皿后用薄手術(shù)刀片劃痕5道，5 min后吸凈染液并用PBS沖洗3遍吸凈，置于熒光顯微鏡下觀察，通過觀察染色的鄰近細(xì)胞距離進(jìn)行半定量檢測。若熒光僅在劃痕旁1列細(xì)胞則為(-)；熒光擴(kuò)散到劃痕旁2列細(xì)胞即為(+)；熒光擴(kuò)散到劃痕旁3列細(xì)胞即為(++)；熒光擴(kuò)散到劃痕旁4列細(xì)胞即為(+++)；熒光擴(kuò)散到超過劃痕旁4列細(xì)胞即為(++++)。

1.6 異硫氰酸熒光素(FITC)間接免疫熒光法檢測ECH對(duì)HepG2細(xì)胞Cx43的表達(dá) 細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中，80 μM的ECH作用24 h后固定和染色。具體如下：PBS沖洗3次，4%甲醛室溫固定30 min，PBS沖洗10次，50 g/L血清白蛋白(BSA)封閉30 min，吸去多余水分，滴加兔抗鼠Cx43 Ⅰ級(jí)抗體覆蓋抗原標(biāo)本，過夜后，PBS沖洗10次，暗室中滴加1∶100稀釋的FITC-兔抗山羊IgG Ⅱ級(jí)抗體，濕盒內(nèi)2 h后吸去多余水分。用熒光顯微鏡在藍(lán)色激發(fā)光下觀察，200倍視野下每個(gè)樣本隨機(jī)抽取5～7個(gè)進(jìn)行盲法攝像和盲法評(píng)分，根據(jù)熒光是否表達(dá)及亮度分為(-)～(++++)，(+)記1分，(++)記2分，以此類推。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS 14.0軟件進(jìn)行分析，多組間的比較用One-Way ANOVA和LSD法。

2 結(jié) 果

2.1 HepG2細(xì)胞生長曲線 算出HepG2細(xì)胞在不同細(xì)胞濃度和時(shí)間段的Alamar Blue還原率并做圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HepG2在20 000個(gè)/mL的密度培養(yǎng)24～72 h間還原率與時(shí)間有線性關(guān)系，得出此體系最優(yōu)化的培養(yǎng)密度和時(shí)間是20 000個(gè)/mL的密度培養(yǎng)3 d。見表1、圖1。

表1 HepG2不同時(shí)間和密度的還原率 mean,n=5

圖1 HepG2生長曲線圖

2.2 ECH對(duì)HepG2細(xì)胞毒作用 采用Alamar Blue法檢測ECH對(duì)HepG2的細(xì)胞毒作用。結(jié)果顯示，ECH作用24 h開始鏡下可見40 μM和80 μM組的細(xì)胞明顯減少，尤其在80 μM組僅見散在貼壁細(xì)胞，存活率為(69.09±1.11)%(P<0.01)。80 μM下ECH對(duì)細(xì)胞抑制率最高，為30.91%。IC50為467.8 μM(368.3 μg/mL)。見表2、圖2、圖3。

表2 ECH對(duì)HepG2的作用mean±SD,n=5

圖2 ECH對(duì)HepG2細(xì)胞毒作用鏡下觀察(24 h)

圖3 ECH對(duì)HepG2的細(xì)胞毒作用曲線圖

2.3 SL/DT檢測ECH對(duì)GJIC的影響 劃痕后羅氏黃負(fù)載5 min，倒置熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果顯示，AGA陰性對(duì)照組未見熒光(-)，空白對(duì)照組熒光出現(xiàn)在劃痕旁1～2列細(xì)胞中且亮度低，說明GJIC功能差；而API陽性對(duì)照和ECH處理24 h后，熒光均擴(kuò)散到劃痕以外的3～4列細(xì)胞，熒光強(qiáng)度為強(qiáng)陽性(++++)，說明細(xì)胞GJIC明顯增強(qiáng)。見表3、圖4。

圖4 各藥物處理后HepG2細(xì)胞間熒光染料傳輸功能變化(×100)

組 別熒光強(qiáng)度空白對(duì)照組±AGA陰性對(duì)照組-API陽性對(duì)照組++++ECH組++++

2.4 FITC法檢測Cx43表達(dá)情況 鏡下觀察發(fā)現(xiàn)空白組的熒光強(qiáng)度一般，Cx43的表達(dá)評(píng)分為(1.40±0.55)，ECH組細(xì)胞中熒光主要集中在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上，Cx43的表達(dá)評(píng)分為(1.60±0.55)。結(jié)果表明ECH組的Cx43表達(dá)增強(qiáng)不明顯。見表4、圖5。

圖5 ECH對(duì)HepG2細(xì)胞Cx43表達(dá)的影響

組 別++++++++++平均分值對(duì)照組32001．40±0．55ECH80μM23001．60±0．55

3 討 論

縫隙連接是細(xì)胞間直接進(jìn)行信息交換的重要通道，GJIC的異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。相鄰細(xì)胞膜上的連接子(connexon)對(duì)接形成跨膜通道，每個(gè)連接子由6個(gè)連接蛋白(connexin，Cx)組成?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)在乳腺癌、肺癌等多種癌變組織和細(xì)胞株中均可檢測到Cx表達(dá)的異常。恢復(fù)腫瘤細(xì)胞的GJIC功能成為目前研究腫瘤防治的熱點(diǎn)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，癌瘤的病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，機(jī)體正氣內(nèi)虛為本，痰濁、氣滯、血瘀等病理產(chǎn)物為標(biāo)，虛實(shí)夾雜，凝聚而為腫塊。因此，腫瘤的治療注重補(bǔ)益藥的應(yīng)用。臨床上常用補(bǔ)益中藥提高患者抵抗力，但是否具有直接抗腫瘤作用及其機(jī)制尚未明確。據(jù)報(bào)道，一些補(bǔ)陽中藥的提取物如冬蟲夏草[4]、巴戟天[5]等，具有體外抗腫瘤作用。補(bǔ)陽中藥的活性物質(zhì)也有報(bào)道對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接細(xì)胞毒作用，如補(bǔ)骨脂素[6]、蟲草素[7]、靈芝多糖[8]和淫羊藿苷[9]等。

肉蓯蓉始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，性溫，味甘、咸，歸腎、腸經(jīng)，具有補(bǔ)腎壯陽、潤腸通便的作用。臨床上常用于治療陽氣虛衰所致的腰膝痠軟、陽萎早泄、宮寒不孕以及腸燥便秘等癥。現(xiàn)代研究表明，肉蓯蓉具有補(bǔ)腎壯陽、改善記憶力、利尿通便、抗疲勞和抗輻射等作用[3]。

ECH是肉蓯蓉的主要活性成分，是一種多酚物質(zhì)。目前報(bào)道ECH的藥理作用主要是神經(jīng)保護(hù)[10-12]、抗衰老[13-14]、清除自由基[15]、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞[16-17]、促進(jìn)造血功能[18]和促進(jìn)成骨[19-20]等。也有報(bào)道ECH誘導(dǎo)胰腺癌等腫瘤細(xì)胞凋亡[21-22]，但對(duì)腫瘤細(xì)胞GJIC的影響研究較少。

Alamar Blue還原法是一種定量檢測細(xì)胞活力的新方法，具有敏感、操作簡便、快速及并能連續(xù)監(jiān)測的優(yōu)點(diǎn)。其主要原理是Alamar Blue能被生長良好的細(xì)胞攝入，細(xì)胞內(nèi)的還原環(huán)境將其變?yōu)榧t色，而生長抑制的細(xì)胞維持的氧化環(huán)境則使其保持原有的藍(lán)色。檢測2個(gè)顏色波長吸光度則可計(jì)算出Alamar Blue的還原率，從而定量細(xì)胞的活力。由于Alamar Blue對(duì)活細(xì)胞沒有毒性，因此可用于連續(xù)測定不同時(shí)間段各密度細(xì)胞的吸光值，根據(jù)其還原率繪制生長曲線。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ECH作用24 h開始鏡下40 μM和80 μM組的細(xì)胞明顯減少，尤其在80 μM組僅見散在貼壁細(xì)胞，80 μM下ECH對(duì)細(xì)胞抑制率為30.91%。IC50為467.8 μM(368.3 μg/mL)。說明ECH對(duì)HepG2有體外細(xì)胞毒作用，提示ECH具有體外直接抗腫瘤作用。

SL/DT的原理在于通過劃痕法使單層培養(yǎng)的細(xì)胞膜上出現(xiàn)短暫的裂痕(這種裂痕既不影響細(xì)胞的存活，亦不影響其分化能力)，熒光染料羅氏黃可通過裂痕進(jìn)入細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察羅氏黃染液所發(fā)出的黃色熒光向鄰近細(xì)胞間的傳遞而用于表示間隙連接細(xì)胞間通訊功能。API為GJ增效劑，AGA為GJ的長效抑制劑。SL/DT結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞的熒光染料主要出現(xiàn)在劃痕旁1～2列細(xì)胞中而且亮度低(±)，細(xì)胞間染料傳輸功能差；經(jīng)陽性對(duì)照API和ECH處理24 h后，熒光染料不僅出現(xiàn)在劃痕的附近細(xì)胞內(nèi)，而且在劃痕以外的3～4列細(xì)胞內(nèi)也出現(xiàn)了明顯熒光(++++)。說明出現(xiàn)了細(xì)胞間染料傳輸?shù)默F(xiàn)象，說明細(xì)胞的間隙連接通訊功能獲得增強(qiáng)。HepG2細(xì)胞分別經(jīng)陰性對(duì)照AGA處理24 h后，熒光染料出現(xiàn)在劃痕旁1列細(xì)胞且亮度比對(duì)照組低(-)。說明無細(xì)胞間染料傳輸?shù)默F(xiàn)象，細(xì)胞的間隙連接通訊功能得到抑制。

鏡下觀察，各組均有Cx43的表達(dá)的陽性細(xì)胞，但其中空白對(duì)照組的熒光強(qiáng)度一般，各用藥組細(xì)胞中熒光主要集中在細(xì)胞核外的胞漿或胞膜上。本實(shí)驗(yàn)在盲法攝取圖象后，采用盲法評(píng)分，根據(jù)熒光表達(dá)的亮度分為(+)、(++)、(+++)、(++++)4個(gè)等級(jí)，具體標(biāo)準(zhǔn)由觀察者掌握，其中(+)記1分，(++)記2分，如此類推。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組細(xì)胞得分為(1.40±0.55)，ECH組得分為(1.60±0.55)。結(jié)果表明ECH的Cx43表達(dá)增強(qiáng)不明顯，其中的Cx43部分錯(cuò)誤定位在細(xì)胞質(zhì)上。其明顯的GJIC功能可能是通過其他Cx的表達(dá)形成的縫隙連接通道實(shí)現(xiàn)的，關(guān)于ECH體外直接抗腫瘤是否通過凋亡實(shí)現(xiàn)及其增強(qiáng)GJIC的機(jī)制均有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

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(本文編輯：董軍杰)

Effects of echinacoside on growth and gap junctional intercellular communication in HepG2 of human hepatoma carcinoma cell

YANGXiaohuan.

DepartmentoftraditionalChinesemedicine,theFirstHospitalAffiliatedtoMedicalCollegeofShantouUniversity,Guangdong,Shantou515041

Objective To observe the effects of echinacoside (ECH) on growth and gap junctional intercellular communication (GJIC) in HepG2 of human hepatoma carcinoma cell. Methods The cytotoxicity of ECH was detected through draw the growth curve of HepG2 cells by Alamar Blue method. The effects of blank group, API positive control group, AGA negative control group and ECH group on GJIC were observed by scrape-loading dye transfer assay(SL/DT). The effect of EHC on expression of Cx43 protein was observed by flourescein isothiocyanate(FITC)indirect immunofluorescence assay. Results There was a liner correlation in alamar blue reduction rate and time of HepG2 cells under 20 000/mL cell density. The HepG2 cells were conducted by EHC (5,10,20,40 and 80 μM)for 24 h ,and the survival rates of cells were (92.69 ± 3.35)%, (88.33 ± 2.12)%, (80.97 ± 2.50)%, (76.95±1.40)% and (69.09±1.11)%(P<0.01). The highest inhibition rate (under 80 μM concentration) was 30.91%. IC50 was 467.8 μM (368.3 μg/mL). The apigenin and ECH were conducted after treatment 24 h, the SL/DT showed positive control, and fluorescent dyes showed obvious fluorescence (++++) in the scratches outside four cells, which indicated the cells appear the phenomenon of dye transfer. The expression of Cx43 was scored by indirect immunofluorescence assay. The score of blank control group was (1.40 ± 0.55) and the score of ECH group was (1.60 ± 0.55). Conclusion ECH had cytotoxic effect on HepG2 cells, and can enhance GJIC function, but the expression of Cx43 was not obvious, which provide the basis for the anti-tumor mechanism of ECH.

Liver tumor; Experimental; Pathology; Saponins class; Gene expression; Intercellular communication

※ 項(xiàng)目來源：汕頭大學(xué)(醫(yī)學(xué)院)創(chuàng)新強(qiáng)校工程人才培育項(xiàng)目

楊曉寰(1979—)，女，副主任中醫(yī)師，博士。從事中醫(yī)內(nèi)科臨床及基礎(chǔ)研究。

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.04.024

R-332;R282.710.5;R735.7；R329.25

A

1002-2619(2017)04-0579-06

2017-01-17)