劉倩，吳悅，方明夢 支小芳，徐小青，孫玉軍

( 安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽233100)

秀珍菇富硒多糖的制備及體外抗氧化活性研究

劉倩，吳悅，方明夢 支小芳，徐小青，孫玉軍

( 安徽科技學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，安徽鳳陽233100)

經(jīng)液體富硒發(fā)酵培養(yǎng)秀珍菇(Pleurotusgeesteranus)硒菌絲體，以此為原料制備富硒多糖(SPMP)，通過對羥基自由基、DPPH自由基、亞硝酸鹽的清除作用及還原力的測定，研究SPMP的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，SPMP具有一定的清除羥基自由基、DPPH自由基、亞硝酸鹽能力和較強的還原能力，且與多糖的濃度呈明顯的量效關(guān)系，其清除效果和還原能力均比秀珍菇多糖(PMP)高。由此可見，SPMP具有一定的體外抗氧化活性。

秀珍菇(Pleurotusgeesteranus)；富硒；多糖；抗氧化

秀珍菇(Pleurotusgeesteranus)屬于擔(dān)子菌綱傘菌目側(cè)耳科側(cè)耳屬，是一種味道鮮美的食用真菌[1]。秀珍菇營養(yǎng)成分豐富，富含蛋白質(zhì)、粗脂肪、多糖和多種維生素[2]。研究表明，秀珍菇多糖具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]、抑菌[5]、降血脂[6]等多方面的生物功能。

硒是機(jī)體生命活動必需的一種微量元素，是過氧化氫酶等氧化酶活性中心的組成成分，能夠增強機(jī)體的抗氧化能力，抵抗有關(guān)疾病的發(fā)生。硒不能由機(jī)體自主合成，只能從體外攝取[7]。自然界的硒有無機(jī)硒和有機(jī)硒2種形式，與亞硒酸鈉等無機(jī)硒相比較，硒多糖等有機(jī)硒毒性低、副作用小，易于被機(jī)體吸收和利用。同時，硒多糖兼有多糖和硒的活性，具有清除自由基、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等多種功能[8]。

真菌富硒發(fā)酵培養(yǎng)是將無機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒的有效方法之一。采用添加亞硒酸鈉進(jìn)行秀珍菇富硒培養(yǎng)，經(jīng)紗布過濾將硒菌絲體與發(fā)酵液分開，從硒菌絲體中提取制備秀珍菇富硒多糖，利用紫外光譜和紅外光譜對其進(jìn)行表征，并通過體外實驗研究其抗氧化性，旨在為抗氧化藥物和保健食品的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

秀珍菇菌種由安徽科技學(xué)院食用菌研究所提供；DPPH購自美國Sigma公司；亞硒酸鈉、三氯乙酸 、鄰苯二胺、EDTA等均為分析純。

主要儀器設(shè)備有：TDL5離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、FA2004電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、R205B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申順生物科技有限公司)、FUS-50L發(fā)酵罐(上海國強生化工程裝備有限公司)、FD-1-50冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)、T6新世紀(jì)紫外分光光度計(北京普析通用儀器責(zé)任有限公司)、Nexus傅里葉紅外光譜儀(美國NICOLET公司)、ZHWY-2102C往復(fù)式恒溫?fù)u床(上海智城分析儀器制造有限公司)、Multiskan Go全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.2 方法1.2.1 秀珍菇富硒發(fā)酵培養(yǎng)及富硒多糖SPMP的制備

將秀珍菇菌株接種于PDA培養(yǎng)基上，經(jīng)活化、一級種子液、二級種子液培養(yǎng)，按10%的接種量接種于50L發(fā)酵罐中，并添加硒濃度為20μg/mL 的亞硒酸鈉(依據(jù)最適硒濃度的單因素試驗確定亞硒酸鈉的添加量)，180r/min、25℃條件下發(fā)酵培養(yǎng)7d，紗布過濾除去發(fā)酵液，硒菌絲體經(jīng)自來水多次淋洗，冷凍干燥，粉碎機(jī)粉碎，過100目篩。稱取一定量的硒菌絲體粉末，按1∶20的料液比于70℃溫水中浸泡3h，4800r/min離心15min，取上清液，濃縮，3倍體積95%的乙醇沉淀過夜，經(jīng)乙醚、丙酮洗滌后溶于適當(dāng)體積的蒸餾水中，冷凍干燥得秀珍菇富硒多糖SPMP(簡稱SPMP)。同時，以不加亞硒酸鈉的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，按相同的方法制備秀珍菇多糖PMP(簡稱PMP)作對照。

1.2.2 紫外可見光譜掃描

分別稱取50mg SPMP、PMP于2個錐形瓶中，各加入5mL混酸(HClO4∶H2SO4∶HNO3=1∶1∶4)于電爐上硝化至澄清，待冷卻后轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶定容，再稱取50mg亞硒酸鈉溶解，定容到50mL容量瓶。分別吸取5mL溶液，加蒸餾水至25mL，再加入2mL 0.1%鄰苯二胺溶液，用甲酸和氨水調(diào)pH 1.5～2.5，陰暗處靜置50min。加甲苯10mL萃取，以不含樣品的甲苯調(diào)零，在200～700nm波長范圍內(nèi)掃描。

1.2.3 紅外光譜掃描

取SPMP、PMP各2mg，分別加入適量干燥的KBr粉末，混合均勻，在瑪瑙研缽中研磨均勻后壓片，于400～4000cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.2.4 SPMP多糖及其硒含量測定

SPMP多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法[9]，SPMP硒含量測定采用鄰苯二胺紫外分光光度法[10]，具體步驟如下：①硒標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。稱取50mg亞硒酸鈉定容至50mL得1mg/mL亞硒酸鈉溶液，吸取10mL該亞硒酸鈉溶液定容到100mL容量瓶得100μg/mL亞硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液。準(zhǔn)確吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL亞硒酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液于三角瓶中，添加蒸餾水至25mL，加入2mL0.1%鄰苯二胺溶液，用80%甲酸調(diào)pH至1.5～2.5，在陰暗處放置50min。加甲苯10mL用力振搖2min萃取，靜置10min，吸取上層甲苯層，以不含樣品的甲苯為對照，在334nm處測定光密度。以硒的濃度為橫坐標(biāo)，光密度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。②樣品硒含量測定。稱取50mg SPMP于錐形瓶中，加入5mL混酸(HClO4∶H2SO4∶HNO3=1∶1∶4)于電爐上加熱硝化，硝化至溶液澄清，冷卻，轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中定容。吸取25mL于錐形瓶中，加2mL0.1%鄰苯二胺溶液，用80%甲酸和濃氨水調(diào)pH 1.5～2.5，在陰暗處放置50min，加10mL甲苯萃取，測定光密度。

1.2.5 體外抗氧化活性測定

1)羥基自由基清除率 依次加入2mL不同濃度的樣品溶液、6mmol/L FeSO4溶液和6mmol/L 的H2O2溶液于各試管中，混勻，靜置15min，再分別加入6mmol/L 的水楊酸溶液3mL，混勻，37℃水浴30min，于510nm波長處測定其光密度(D1)，以蒸餾水代替樣品作為空白對照,測定其光密度(D0)，實驗重復(fù)3次。羥基自由基的清除率公式[11]如下：

羥基自由基清除率=(D0-D1)/D0×100%

式中，D0表示空白對照的光密度；D1表示樣品(SPMP、PMP)光密度。

2)DPPH自由基清除率 依次加入不同濃度的樣品溶液1mL、0.2mmol/L 的DPPH乙醇溶液3mL于各試管中，充分混勻，避光靜置30min后，4000r/min離心10min，取上清于517nm波長處測定其光密度(D1)，以蒸餾水代替樣品作為空白對照,測定其光密度(D0)，實驗重復(fù)3次。DPPH自由基的清除率公式[12]如下：

DPPH自由基清除率=(D0-D1)/D0×100%

3)亞硝酸鹽清除率 依次加入不同濃度的樣品溶液1mL、5μg/mL的NaNO22mL、蒸餾水1mL于各試管中，搖勻，室溫靜置10min，各管加入0.4 %對氨基苯磺酸1mL，搖勻，靜置5min后，再加入0.2%的鹽酸萘乙二胺1mL，搖勻，靜置15min，于538nm處測定光密度(D1)。以蒸餾水代替樣品作為空白對照,測定其光密度(D0)，實驗重復(fù)3次。亞硝酸鹽清除率公式[13]如下：

亞硝酸鹽清除率=[(D0-D1)/D0]×100%

4)還原力 依次加入不同濃度的樣品溶液2mL、0.2mol/L磷酸鈉緩沖液(pH=6.6) 2mL、1% K3[Fe(CN)6]溶液2mL于各試管中，混勻，于50℃恒溫水浴鍋中水浴20min，自來水冷卻，再加入10%三氯乙酸溶液2mL，混勻，4000 r/min離心10min，取上清液2mL，再加入蒸餾水2mL和0.1%三氯化鐵溶液1mL，混勻，常溫10min后，于700nm處測定光密度[14]。光密度的大小反應(yīng)其還原能力的大小，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光譜分析

圖1 SPMP、PMP紫外掃描結(jié)果

圖2 SPMP和PMP紅外掃描結(jié)果

SPMP、PMP的紫外掃描結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，亞硒酸鈉在334nm處有很強的吸收峰，這與文獻(xiàn)[15]報道相一致；硒多糖在334nm處也有吸收峰，而多糖在334nm處無吸收峰，由此說明通過添加亞硒酸鈉進(jìn)行富硒發(fā)酵培養(yǎng)，菌絲體富集了硒元素，以此為原料制備的多糖樣品含有硒元素，即通過發(fā)酵培養(yǎng)將亞硒酸鈉無機(jī)硒轉(zhuǎn)化成有機(jī)硒多糖SPMP。

2.2 紅外光譜分析

SPMP和PMP的紅外掃描結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，SPMP 的主要吸收峰有2998.7cm-1、2382.6cm-1、1568.1cm-1、1498.7cm-1、1389.6cm-1、1287.6cm-1、1215.4cm-1、 1194.1cm-1、1123.3cm-1、1063.8cm-1、888.2cm-1；PMP的主要吸收峰有2998.7cm-1、2391.1cm-1、1490.2cm-1、1389.6cm-1、1283.4cm-1、1219.6cm-1、1133.2cm-1、1061.0cm-1、895.2cm-1。兩者紅外表征相似，在2998.7cm-1處均有糖類的典型特征吸收峰，這是由糖類C-H伸縮振動引起的吸收。SPMP在1568.1cm-1，1194.1cm-1處有吸收峰，而PMP在此處無吸收峰，說明兩者的結(jié)構(gòu)存在一定差異，這主要是SPMP的一些官能團(tuán)結(jié)合硒而引起吸收波長出現(xiàn)一定的偏移造成的[16]。

2.3 SPMP多糖含量及其硒含量

根據(jù)繪制葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)曲線測得的數(shù)據(jù)，通過EXCEL得出多糖含量測定的回歸方程為y=0.012x-0.001，R2=0.9991(式中：y為光密度值；x為多糖濃度)。根據(jù)繪制硒標(biāo)準(zhǔn)曲線測得的數(shù)據(jù)，通過EXCELL得出硒含量測定的回歸方程為y=0.2276x+0.0395，R2=0.9903(式中：y為光密度值，x為硒濃度)。經(jīng)計算，SPMP中多糖含量為60.81 %，有機(jī)硒的含量為8.65mg/g。

圖3 SPMP及PMP對羥基自由基清除作用結(jié)果

圖4 SPMP和PMP對DPPH自由基清除作用結(jié)果

2.4 SPMP對羥基自由基的清除效果

羥基自由基是一種對生物機(jī)體危害較大、毒性較強的自由基。藥物對羥基自由基的清除能力是其抗氧化的重要指標(biāo)之一。SPMP及PMP對羥基自由基清除作用的結(jié)果如圖3所示。由圖3可以看出，SPMP對羥基自由基具有一定的清除能力，且清除率隨著濃度的升高而增大，與濃度存在一定的量效關(guān)系；SPMP對羥基自由基的清除率均大于同一濃度的PMP。

2.5 SPMP對DPPH自由基的清除效果

DPPH自由基是一種以氮為中心的自由基，對它的清除，可以表示受試物具有一定的清除羥基自由基、烷自由基的能力和打斷脂質(zhì)過氧化鏈反應(yīng)的作用。SPMP和PMP對DPPH自由基清除作用結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，秀珍菇富硒多糖具有一定的清除DPPH自由基能力；SPMP對DPPH自由基的清除率隨著濃度的升高而增大，與濃度存在一定的量效關(guān)系；SPMP對DPPH自由基的清除率均比同濃度的PMP高。

2.6 SPMP對亞硝酸鹽的清除效果

圖5 SPMP及PMP對亞硝酸鹽清除作用結(jié)果

亞硝酸鹽在酸性水溶液中能與對氨基苯磺酸重氮化，再與鹽酸萘乙二胺偶合反應(yīng)生成紅色化合物，紅色化合物顏色的深淺反映溶液中亞硝酸鹽濃度的高低。SPMP及PMP對亞硝酸鹽清除作用結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，SPMP對亞硝酸鹽具有一定的清除作用，清除能力隨著濃度的升高而增大，與濃度存在一定的量效關(guān)系；SPMP對亞硝酸鹽的清除率均比同濃度的PMP高。

2.7 SPMP的還原能力

抗氧化性物質(zhì)通過自身的還原作用提供電子清除自由基，其還原能力的強弱反映受試物抗氧化能力的高低。SPMP和PMP的還原能力測定結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，SPMP具有一定的還原能力，還原能力隨著濃度的升高而增大，與濃度存在一定的量效關(guān)系；SPMP的還原能力均比同濃度的PMP高。

圖6 SPMP和PMP的還原能力測定結(jié)果

3 結(jié)論

通過紫外可見光譜掃描、紅外掃描對制備的秀珍菇多糖和硒多糖的結(jié)構(gòu)表征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)硒多糖和多糖的基本結(jié)構(gòu)相似，其多糖含量為60.81%，硒含量為8.65mg/g。體外抗氧化實驗表明，秀珍菇富硒多糖具有較強的還原能力；對羥基自由基、DPPH自由基和亞硝酸鹽具有一定的清除能力。因此，秀珍菇富硒多糖作為天然的抗氧化藥物值得進(jìn)一步開發(fā)與應(yīng)用，有關(guān)富硒多糖的化學(xué)組成、結(jié)構(gòu)以及體外抗氧化的機(jī)理等有待進(jìn)一步研究。

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[編輯] 李啟棟

2016-12-15

安徽省高等學(xué)校省級自然科學(xué)研究重點項目(KJ2014A052)；安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃重點項目(gxyqZD2016221)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201610879009)。

劉倩(1997-)，女，現(xiàn)從事多糖研究。通信作者：孫玉軍，sunyujun208@163.com。

Q539

A

1673-1409(2017)10-0056-05

[引著格式]劉倩，吳悅，方明夢，等.秀珍菇富硒多糖的制備及體外抗氧化活性研究[J].長江大學(xué)學(xué)報(自科版)，2017，14(10)：56～60.