張曉男，聶繼云，閆 震，程 楊，王玉嬌

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹研究所/農(nóng)業(yè)部果品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(興城)，遼寧 興城 125100)

研究報(bào)告

UPLC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)蘋果及其制品中的7種真菌毒素

張曉男，聶繼云*，閆 震，程 楊，王玉嬌

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹研究所/農(nóng)業(yè)部果品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(興城)，遼寧 興城 125100)

建立了蘋果及5種蘋果制品中7種真菌毒素(PAT，OTA，AOH，AME，ALT，TEN，TeA)的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。準(zhǔn)確稱取蘋果及5種蘋果制品各10 g(液體樣品量取10 mL)，加入10 mmol/L檸檬酸乙腈溶液進(jìn)行提取，再加入4 g 4A型分子篩和1 g氯化鈉除水鹽析，離心后上清液采用C18凈化，最后采用0.22 μm聚四氟乙烯膜(PTFE)過(guò)濾進(jìn)行UPLC-MS/MS檢測(cè)。7種真菌毒素在2～150 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2>0.99)；檢出限為0.02～1.8 μg/L，方法定量下限為1～5 μg/L。以10，50，100 μg/L濃度水平做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，回收率為71.8%～112.4%。此方法快速、高效，為蘋果及其制品中真菌毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

真菌毒素；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；4A分子篩；蘋果；蘋果制品

蘋果是我國(guó)第一大果品[1]，至2014年，中國(guó)蘋果栽培面積和產(chǎn)量分別達(dá)到2 272.2×104hm2和4 092.32×104t，占全國(guó)水果栽培面積的18.4%和水果產(chǎn)量的15.65%[2]。除鮮食外，我國(guó)每年還有大量蘋果用于加工，在生產(chǎn)過(guò)程中，果實(shí)難免受到真菌病害侵染產(chǎn)生真菌毒素，從而對(duì)蘋果及其制品造成污染。研究表明，污染蘋果及其制品的真菌毒素主要棒曲霉素(Patulin，PAT)[3]、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A，OTA)[4]、交鏈孢酚(Alternariol，AOH)、交鏈孢酚單甲醚(Alternariolmonomethyl ether，AME)、交鏈孢烯(Altenuene，ALT)、騰毒素(Tentoxin，TEN)和細(xì)交鏈孢酮酸(Tenuazonic acid，TeA)[5]7種。目前，果品及其制品中真菌毒素的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法[5]、高效液相色譜法[6]、液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[6-9]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[10]等。有效的前處理方法是實(shí)現(xiàn)儀器分析的前提保證，目前用于真菌毒素分析的前處理方法包括免疫親和柱法[11]、多功能柱法[12]、QuEChERS方法[13]等。然而，這些方法檢測(cè)的真菌毒素種類有限，無(wú)法滿足蘋果及其制品中主要真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)需求。本文以上述7種真菌毒素為對(duì)象，對(duì)樣品的提取凈化方法、色譜條件、質(zhì)譜條件、基質(zhì)效應(yīng)等展開研究。通過(guò)篩選和優(yōu)化，提出適于蘋果及其制品中上述7種真菌毒素的前處理方法，建立了同時(shí)檢測(cè)蘋果及其制品中7種真菌毒素的UPLC-MS/MS方法，從而為蘋果及其制品中真菌毒素污染的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)與評(píng)估奠定了方法基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

甲醇、乙腈、甲酸銨、乙酸銨、甲酸、乙酸、檸檬酸(色譜純，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；C18(50 μm，60 ?)、PSA(40 μm，100 g)(美國(guó)Varian 公司)；無(wú)水MgSO4(優(yōu)級(jí)純，天津市津科精細(xì)化工研究所)；NaCl(優(yōu)級(jí)純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；4A型分子篩(鈉-A型分子篩，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；有機(jī)濾膜(美國(guó)FINE Scientific公司)； PAT，AOH，AME，ALT，TEN，TeA，OTA標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%，新加坡Pribolab公司)。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-MS/MS Xevo TQ，美國(guó)Waters公司)；立式大容量高速離心機(jī)(CF16RXⅡ，日本Hitachi公司)；全自動(dòng)超純水制水機(jī)(Milli-Q Direcet 8，美國(guó)Millipore公司)；馬弗爐(M110，美國(guó)Thermo公司)；色譜柱(美國(guó)Waters公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取1 mg標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 容量瓶中，乙腈定容，配成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中備用?；|(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：利用本實(shí)驗(yàn)前處理方法分別制備蘋果、蘋果汁、蘋果酒、蘋果醋、蘋果醬、蘋果罐頭的基質(zhì)空白溶液，然后用基質(zhì)空白溶液將標(biāo)準(zhǔn)貯備液稀釋至1，2，5，10，50，100，200 μg/L 7個(gè)濃度水平。

1.2.2 樣品前處理 分別準(zhǔn)確吸取10 mL蘋果汁、蘋果醋、蘋果酒樣品于50 mL 具塞離心管中，蘋果、勻漿后的蘋果罐頭和蘋果醬則稱取10 g，加入10 mL提取液(10 mmol/L檸檬酸乙腈溶液)，劇烈振蕩3 min，然后加入4 g 4A型分子篩(400 ℃下烘干3 h，立即移至干燥箱中冷卻至室溫后使用)和1 g NaCl，劇烈振蕩1 min，9 000 r/min離心5 min，取2 mL上清液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入60 mg凈化劑C18，渦旋振蕩1 min，靜置2 min，上清液過(guò)0.22 μm PTFE有機(jī)系濾膜，待測(cè)。

1.2.3 UPLC-MS/MS條件 色譜條件：Cortecs UPLC C18色譜柱；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相：A為甲醇，B為1 mmol/L乙酸銨；梯度洗脫程序：0～0.5 min，3%A；0.5～3.5 min，3%～90%A；3.5～4.5 min，90%A；4.5～4.6 min，90%～3%A；4.6～5.5 min，3%A；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：正負(fù)同時(shí)掃描；毛細(xì)管電壓：0.5 kV；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；離子源溫度：150 ℃；去溶劑氣溫度：400 ℃；去溶劑氣和錐孔氣均為高純氮?dú)猓魉俜謩e為800 L/h和50 L/h；碰撞氣：高純氬氣，流速 0.14 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱及柱溫的選擇

對(duì)比了BEH C18色譜柱[5,14-15]、BEH Hilic色譜柱和Cortecs UPLC C18色譜柱對(duì)7種真菌毒素的分離效果。結(jié)果表明，BEH Hilic色譜柱分析7種真菌毒素的出峰時(shí)間主要集中在0.85～1.05 min，不能將7種真菌毒素很好地分離。Cortecs UPLC C18色譜柱分析7種真菌毒素的峰形和響應(yīng)值優(yōu)于BEH C18色譜柱，對(duì)Cortecs UPLC C18色譜柱的柱溫(30，35，40，45 ℃)進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，當(dāng)柱溫為35 ℃時(shí)，7種真菌毒素的峰形、響應(yīng)值最好。本實(shí)驗(yàn)最終采用Cortecs UPLC C18色譜柱進(jìn)行分離，柱溫為35 ℃。

2.2 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

比較研究了甲酸[16]、乙酸[17]、緩沖鹽、乙酸銨[18]和水共5種水相與乙腈[19]、甲醇[20]2種有機(jī)相作為流動(dòng)相時(shí)7種真菌毒素的分離效果。結(jié)果表明，以甲醇-乙酸銨作為流動(dòng)相體系時(shí)，7種真菌毒素的峰形得到明顯改善，離子信號(hào)值增強(qiáng)，分離度較好，響應(yīng)值為3.67×104～2.50×106。進(jìn)一步優(yōu)化乙酸銨濃度(0.5，1.0，5.0，10.0，50.0 mmol/L)，結(jié)果表明乙酸銨濃度為1.0 mmol/L時(shí)，7種真菌毒素的出峰效果最佳。因此，實(shí)驗(yàn)最終確定以甲醇和1.0 mmol/L乙酸銨作為流動(dòng)相。

液相色譜分離時(shí)，若流動(dòng)相為酸性，調(diào)低毛細(xì)管電壓可以提高檢測(cè)物質(zhì)的靈敏度[21]。本實(shí)驗(yàn)中流動(dòng)相pH值為6.0，提取液pH值為3.79～5.77，當(dāng)降低毛細(xì)管電壓至0.5 kV時(shí)，7種真菌毒素的響應(yīng)值得到提高。所以本研究最終采用0.5 kV的毛細(xì)管電壓。采用流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式對(duì)MRM質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，分別在ESI+模式和ESI-模式下掃描，最終確定7種真菌毒素的MRM參數(shù)見表1。由于基質(zhì)影響差別不大，以蘋果基質(zhì)為例，50 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及50 μg/L加標(biāo)蘋果樣品中7種真菌毒素的定量離子質(zhì)譜圖見圖1。

表1 7種真菌毒素的串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)Table 1 MRM parameters for 7 mycotoxins analyzed

2.3 樣品前處理的優(yōu)化

本研究對(duì)前處理過(guò)程的提取溶劑、除水劑、凈化劑和濾膜進(jìn)行優(yōu)化，分別考察了蘋果及其制品共6種不同基質(zhì)，結(jié)果表明5種蘋果制品和蘋果的前處理?xiàng)l件并無(wú)差異，因此以蘋果基質(zhì)作為代表，討論了樣品前處理的優(yōu)化結(jié)果。

圖2 檸檬酸濃度對(duì)7種真菌毒素回收率的影響Fig.2 Effect of citric acid concentration on recoveries of 7 mycotoxins

圖3 C18用量對(duì)7種真菌毒素回收率的影響Fig.3 Effect of C18 use level on recoveries of 7 mycotoxins

2.3.1 提取溶劑的優(yōu)化 選用極性和毒性均較低的乙腈[20]作為提取溶劑，并比較了乙腈、甲酸-乙腈[22]、乙酸-乙腈[23-24]、檸檬酸-乙腈[25]4種溶劑對(duì)7種真菌毒素回收率的影響。結(jié)果表明，采用純乙腈或乙酸-乙腈進(jìn)行提取時(shí)，TeA的回收率不足50%；甲酸-乙腈提取時(shí)TeA的回收率為60.1%～68.6%；檸檬酸-乙腈提取時(shí)TeA的回收率為61.7%～78.8%，表明以檸檬酸-乙腈提取時(shí)的效果較好。進(jìn)一步優(yōu)化了檸檬酸的濃度(1，5，10，50，100 mmol/L)，結(jié)果表明，以10 mmol/L檸檬酸-乙腈為提取溶劑時(shí)效果最好，7種真菌毒素的回收率為78.8%～116.6%，因此最終選擇10 mmol/L檸檬酸-乙腈作為提取溶劑(圖2)。

2.3.2 除水劑的優(yōu)化 比較了4A型分子篩和無(wú)水MgSO4對(duì)7種真菌毒素回收率的影響。結(jié)果表明，當(dāng)使用無(wú)水MgSO4時(shí)，7種毒素的回收率為54.7%～109.7%，使用4A型分子篩時(shí)的回收率為81.6%～109.5%，表明4A型分子篩的提取效果高于無(wú)水MgSO4。這是由于4A分子篩是一種有效孔徑為0.4 nm的人工合成、具有微孔型立方晶格的硅鋁酸鹽，能有效吸附水、NH3、H2S、二氧化硫、二氧化碳等臨界直徑不大于0.4 nm 的分子，而本研究的7種真菌毒素的直徑均大于0.4 nm，不會(huì)被吸附，提取過(guò)程損失小，4A型分子篩用量對(duì)回收率無(wú)明顯影響，故本實(shí)驗(yàn)采用4 g 4A分子篩作除水劑。2.3.3 凈化劑的優(yōu)化 比較了凈化劑C18和PSA對(duì)7種真菌毒素回收率的影響。結(jié)果表明，PSA對(duì)OTA有明顯的吸附作用，添加PSA凈化后，OTA的添加回收率小于10%。因此采用C18作為凈化劑進(jìn)行凈化，并比較了C18用量(0，15，30，60，120 g)對(duì)樣品中7種真菌毒素回收率的影響。結(jié)果表明，每毫升提取液中加入30 mg C18時(shí)，7種真菌毒素的回收率為77.5%～103.7%(圖3)，凈化效果好，回收率高。2.3.4 濾膜的選擇 比較了尼龍膜(Nylon)、聚醚砜膜(PES)、聚偏二氟乙烯膜(PVDF)、混合纖維素酯(MCE)和聚四氟乙烯膜(PTFE) 5種一次性濾膜對(duì)7種真菌毒素回收率的影響。結(jié)果表明，Nylon膜會(huì)對(duì)AOH和AME產(chǎn)生明顯的吸附作用，PES膜對(duì)AME產(chǎn)生吸附作用。采用PTFE膜時(shí)，7種真菌毒素的回收率為96.4%～106.5%，能有效過(guò)濾雜質(zhì)和最大限度減少樣品損失，因此本實(shí)驗(yàn)選擇0.22 μm的PTFE濾膜進(jìn)行過(guò)濾。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effects，ME)是指色譜分離時(shí)，共洗脫的物質(zhì)使目標(biāo)分析物的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性降低的現(xiàn)象[26]。選取6種100 μg/L的基質(zhì)空白標(biāo)準(zhǔn)工作溶液與溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液比較，按照公式ME=(A-B)/B×100%計(jì)算7種真菌毒素在不同基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)[27]，其中A和B分別為空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)值。當(dāng)平均基質(zhì)效應(yīng)(增強(qiáng)或抑制)超過(guò)20%，則認(rèn)為基質(zhì)效應(yīng)對(duì)定量檢測(cè)具有顯著影響。結(jié)果表明，基質(zhì)對(duì)多數(shù)真菌毒素均存在顯著影響(見表2)。本研究在優(yōu)化色譜-質(zhì)譜分析條件的基礎(chǔ)上，采用樣品空白基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)7種真菌毒素進(jìn)行定量分析，以補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)。

表2 7種真菌毒素在不同樣品中的基質(zhì)效應(yīng)Table 2 Matrix effects of 7 mycotoxins in different samples

(續(xù)表2)

MycotoxinMatrixeffect(%)AppleApplejuiceApplewineAppleacidApplejamCannedappleALT74 0303 988 52 9263 5179 8TEN39 1-42 512 60 6-49 0-98 9TeA11 265 14 215 834 0-45 0

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量下限 在優(yōu)化條件下，用蘋果空白基質(zhì)配制一系列質(zhì)量濃度(2，5，10，50，100，150 μg/L)的真菌毒素溶液，上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果表明7種真菌毒素在2～150 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，r2≥0.992 8。檢出限(S/N=3)為0.02～1.80 μg/L，采用加標(biāo)回收的方法得出方法定量下限，設(shè)置1，2，5 μg/L加標(biāo)水平，計(jì)算回收率，獲得7種真菌毒素的方法定量下限(S/N=10)為1～5 μg/L(見表3)。

表3 7種真菌毒素的線性方程、檢出限及定量下限Table 3 Linear equations,LODs and LOQs of 7 mycotoxins

x：concentration(μg·L-1)；y：response

2.5.2 回收率與精密度 在蘋果及其制品中分別添加10，50，100 μg/L 3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平重復(fù)5次。結(jié)果表明，7種真菌毒素的回收率為71.8%～112.4%(見表4)。本方法對(duì)蘋果及其制品中不同含量的7種真菌毒素的回收率均符合NY/T 788-2004標(biāo)準(zhǔn)[28]。

表4 蘋果及其制品中7種真菌毒素的加標(biāo)回收率Table 4 Spiked recoveries of 7 mycotoxins in apple and its products

(續(xù)表4)

SampleMycotoxinAdded10μg/LAdded50μg/LAdded100μg/LRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)AppleacidPAT102 66 494 14 599 85 8OTA97 312 698 48 397 82 4AOH91 35 495 62 499 23 0AME99 65 299 96 698 83 1ALT103 71 096 18 295 46 6TEN103 810 099 13 198 96 0TeA87 25 592 01 293 37 6ApplejamPAT98 712 698 33 998 61 6OTA99 95 3102 74 799 31 5AOH91 92 9102 81 499 21 6AME88 512 398 14 6100 05 8ALT93 54 898 26 199 61 8TEN101 612 498 36 4101 75 3TeA88 53 288 03 890 53 5CannedapplePAT98 712 597 92 0100 11 2OTA99 77 6103 33 5100 21 0AOH98 67 199 22 799 72 0AME95 75 199 43 699 02 5ALT105 67 9101 60 899 91 6TEN95 312 790 215 3100 010 3TeA90 88 893 82 390 41 6

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用本方法檢測(cè)20個(gè)蘋果、41個(gè)蘋果汁、10個(gè)蘋果酒、34個(gè)蘋果醋、14個(gè)蘋果醬、5個(gè)蘋果罐頭共124個(gè)樣品。結(jié)果顯示，6類樣品中真菌毒素的檢出率分別為0，17.1%，2.9%，0，0，21.4%。其中，蘋果汁中檢出PAT(11.1～13.8 μg/L)，AOH(0.28～3.7 μg/L)，AME(0.6～0.81 μg/L)，ALT(0.48～1.1 μg/L)，TEN(2.2～3.1 μg/L)和TeA(11.9～20.6 μg/L) 6種真菌毒素，蘋果醋中檢出AME(1.77 μg/L)和TeA(14.5 μg/L)兩種真菌毒素，蘋果醬中檢出AME(1.17～4.42 μg/L)和TEN(10.1 μg/L)兩種真菌毒素。表明方法可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

3 結(jié) 論

本文建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)蘋果及5種蘋果制品中7種真菌毒素的定量分析方法，并采用了新型除水劑4A型分子篩。本方法在檢測(cè)速度、靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度、成本、環(huán)保以及檢測(cè)真菌毒素種類方面有顯著改進(jìn)和優(yōu)勢(shì)，適合于此類真菌毒素在蘋果及其制品中污染水平的研究。

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Simultaneous Detection of 7 Kinds of Mycotoxins in Apple and Its Products by UPLC-MS/MS

ZHANG Xiao-nan,NIE Ji-yun*,YAN Zhen,CHENG Yang,WANG Yu-jiao

(Institute of Pomology,Chinese Academy of Agricultural Sciences/Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Fruit (Xingcheng),Ministry of Agriculture,Xingcheng 125100,China)

A rapid and accurate method was developed for the determination of 7 mycotoxins (PAT,OTA,AOH,AME,ALT,TEN and TeA) in apple,apple juice,apple wine,apple acid,apple jam and canned apples by UPLC-MS/MS.10 g of the sample(10 mL of liquid sample) was precisely weighed,and extracted with acetonitrile containing 10 mmol/L citric acid solution,then 4 g of 4A molecular sieve and 1 g of NaCl were added.After oscillation and centrifugation,the liquid supernatant was purged with C18decontaminant.Finally,it was filtered through a 0.22 μm PTFE membrane and analyzed by UPLC-MS/MS.The method showed good linear relationships for 7 mycotoxins in the concentration range of 2-150 μg/L with correlation coefficients above 0.99.The detection limits were in the range of 0.02-1.8 μg/L,and the limits of quantitation were 1-5 μg/L.The recoveries of 7 mycotoxins were between 71.8% and 112.4% at three spiked concentrations levels of 10,50,100 μg/L.This method is rapid and efficient in the simultaneous detection of 7 mycotoxins in apple and its products.This will lay a foundation for the risk monitoring of mycotoxin contamination in apple and its products.

mycotoxin;UPLC-MS/MS;4A molecular sieve;apple;apple product

2017-02-03；

2017-03-14

農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重大專項(xiàng)(GJFP2016003,GJFP2017003)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程(CAAS-ASTIP)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.002

O657.63;S852.44

A

1004-4957(2017)05-0588-07

*通訊作者：聶繼云，博士，研究員，研究方向：果品質(zhì)量安全，Tel:0429-3598178，E-mail:jiyunnie@163.com