吳夢(mèng)琪，張文清，徐志珍，宛燕飛，張 力，夏 瑋*

(1.華東理工大學(xué) 上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2.成都利爾藥業(yè)有限公司，四川 成都 610083)

核磁共振氫譜法測(cè)定甘露聚糖肽中多糖的含量

吳夢(mèng)琪1，張文清1，徐志珍1，宛燕飛2，張 力2，夏 瑋1*

(1.華東理工大學(xué) 上海市功能性材料化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2.成都利爾藥業(yè)有限公司，四川 成都 610083)

以甘露聚糖肽為研究對(duì)象，首次采用1H-NMR法測(cè)定多糖產(chǎn)品中的多糖含量。以基準(zhǔn)試劑鄰苯二甲酸氫鉀為內(nèi)標(biāo)，考察了弛豫延遲時(shí)間和采樣次數(shù)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。選定核磁共振參數(shù)弛豫延遲時(shí)間1 s，采樣次數(shù)16次?？疾旖Y(jié)果表明，該方法具有很好的重復(fù)性和精密度。在對(duì)甘露聚糖肽定性鑒定的基礎(chǔ)上，采用絕對(duì)定量方式測(cè)定了甘露聚糖肽實(shí)際樣品的多糖含量，結(jié)果與苯酚-硫酸法一致。該方法專屬性高，操作方便，結(jié)果準(zhǔn)確，不僅可用于甘露聚糖肽中多糖含量的測(cè)定，還可用于其它結(jié)構(gòu)明確的多糖含量測(cè)定。

核磁共振氫譜；多糖含量；甘露聚糖肽

甘露聚糖肽是我國(guó)首創(chuàng)的一種新型免疫促進(jìn)劑，是將從健康人咽喉部分離的α-溶血性鏈球菌33號(hào)菌株經(jīng)發(fā)酵、提取、精制而獲得的一種糖肽類物質(zhì)[1]。目前，甘露聚糖肽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的多糖含量采用傳統(tǒng)的苯酚-硫酸法[2]進(jìn)行測(cè)定，但該方法由于使用強(qiáng)腐蝕性酸，其危險(xiǎn)系數(shù)高，操作較復(fù)雜，人為操作及測(cè)量誤差不可避免，重現(xiàn)性差，且專屬性不強(qiáng)。

核磁共振波譜是有機(jī)物定性的有力工具，由于1H-NMR中的共振峰面積與該共振峰所對(duì)應(yīng)的質(zhì)子數(shù)成正比，使得該方法可用于定量分析[3-4]。高強(qiáng)度磁場(chǎng)和傅立葉變換技術(shù)的應(yīng)用使儀器性能得到較大改善，其測(cè)定準(zhǔn)確度、重現(xiàn)性和靈敏度能滿足定量要求，目前很多國(guó)家和地區(qū)已將NMR技術(shù)用于藥物的定量分析和檢測(cè)[5-7]，2010年中國(guó)藥典新增了核磁共振波譜定量方法[8]。但是核磁共振波譜法用于多糖含量的測(cè)定至今未見(jiàn)報(bào)道。本文以甘露聚糖肽為研究對(duì)象，考察了NMR實(shí)驗(yàn)條件對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，建立了測(cè)定甘露聚糖肽中多糖含量的1H-NMR方法，并與傳統(tǒng)方法的結(jié)果進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為甘露聚糖肽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供了科學(xué)依據(jù)，并為其他種類糖肽或多糖產(chǎn)品的多糖含量測(cè)定提供了參考方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

DD2400-MR型核磁共振儀(安捷倫科技有限公司)；Mettler AE240型分析天平(梅特勒-托利多有限公司)；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；Pipetman P100 100-1000 μL型微量移液槍(吉爾森公司)；甘露聚糖肽供試品(批號(hào)：131101，131102，G100102，成都利爾藥業(yè)有限公司)；鄰苯二甲酸氫鉀(純度>99.05%，國(guó)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司)；重水(氘代度：99.8%，北京希凱創(chuàng)新科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品溶液的制備 精密稱取干燥的甘露聚糖肽供試品60 mg和內(nèi)標(biāo)物鄰苯二甲酸氫鉀10 mg，置于塑料離心管中，準(zhǔn)確加入1.0 mL重水，超聲至樣品完全溶解，轉(zhuǎn)移至5 mm核磁管中，待測(cè)。

1.2.2 核磁測(cè)定條件1H-NMR的共振頻率為400 MHz，采樣參數(shù)如下：脈沖序列(seqfil)：s2pul，掃描次數(shù)(ct)：16，空掃次數(shù)(ss)：0，譜寬(sw):8 012.8 Hz，脈沖角度(pw)：30，接收增益(gain)：10，測(cè)試溫度(temp)：30 ℃，弛豫延遲時(shí)間(d1)：1.0 s，窗函數(shù)線寬因子(lb)：0 Hz。

1.2.3 甘露聚糖肽的定性鑒定 在優(yōu)化條件下，測(cè)定添加內(nèi)標(biāo)物的甘露聚糖肽的1H-NMR譜，將異頭氫區(qū)域譜圖峰形和峰位移值與甘露聚糖肽標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比對(duì)，采用相關(guān)系數(shù)法測(cè)定譜圖相似度，采用Microsoft EXCEL軟件分析所選定光譜區(qū)的數(shù)據(jù)，將供試品譜圖的Y軸坐標(biāo)與對(duì)照品圖譜的Y軸坐標(biāo)進(jìn)行比較，計(jì)算相關(guān)系數(shù)ρ，若相關(guān)系數(shù)ρ>0.95，認(rèn)為二者糖鏈結(jié)構(gòu)一致；反之，則糖鏈結(jié)構(gòu)不一致[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 內(nèi)標(biāo)物的選擇 核磁定量要求內(nèi)標(biāo)物具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、不與溶劑和樣品發(fā)生反應(yīng)、純度高、易稱量以及信號(hào)峰不干擾樣品測(cè)定等特質(zhì)。核磁定量常用的內(nèi)標(biāo)物有：1,2,4,5-四氯苯、1,4-二硝基苯、對(duì)苯二酚、對(duì)苯二酸、鄰苯二甲酸氫鉀和苯甲酸芐酯等。由于甘露聚糖肽樣品易溶于水，且鄰苯二甲酸氫鉀的化學(xué)位移在7.56～7.74之間，與甘露聚糖肽樣品的信號(hào)完全分離，故實(shí)驗(yàn)采用易溶于水的鄰苯二甲酸氫鉀作為內(nèi)標(biāo)。

圖1 添加內(nèi)標(biāo)物的甘露聚糖肽樣品的1H-NMR譜圖Fig.1 1H-NMR spectrum of mannatide adding internal standard

2.1.2 定量峰的選擇 由于內(nèi)標(biāo)物的定量峰須與被測(cè)樣品的信號(hào)峰完全分離，或者至少保證有一組峰完全分離，以保證積分結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)選擇鄰苯二甲酸氫鉀為內(nèi)標(biāo)，甘露聚糖肽供試品的1H-NMR譜圖見(jiàn)圖1?？捎^察到鄰苯二甲酸氫鉀的兩組質(zhì)子峰分別為：H-4,5(δ7.56～δ7.59,2H,dd)和H-3,6(δ7.72～δ7.74,2H,dd)。本實(shí)驗(yàn)選擇其中一組質(zhì)子峰H-4,5(δ7.56～δ7.59,2H,dd)作為內(nèi)標(biāo)物的定量峰。甘露聚糖肽樣品的信號(hào)集中在3.20～5.80之間，主要分為兩個(gè)區(qū)域：①異頭氫區(qū)，5.80～4.40；②環(huán)質(zhì)子區(qū)，4.40～3.20。其中，異頭氫區(qū)的信號(hào)(4.88～5.35)不與其他氫信號(hào)重疊，且異頭氫譜峰的化學(xué)位移值、峰形與甘露聚糖肽糖鏈結(jié)構(gòu)重復(fù)單元中不同連接方式的糖殘基一一對(duì)應(yīng)，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇整個(gè)異頭氫區(qū)域的譜峰(4.88～5.35)作為定量峰。

2.1.3 樣品及內(nèi)標(biāo)物濃度的選擇 待測(cè)樣品和內(nèi)標(biāo)物的濃度要考慮樣品的溶解性，并且需將樣品和內(nèi)標(biāo)物的強(qiáng)度信號(hào)控制在具有可比性的范圍內(nèi)。如果待測(cè)樣品和內(nèi)標(biāo)物之間的濃度差過(guò)大，會(huì)造成核磁信號(hào)的溢出，導(dǎo)致信號(hào)失真，手動(dòng)積分時(shí)，最高信號(hào)面積的微小變化會(huì)引起顯著的量化誤差；而如果樣品濃度過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致積分結(jié)果誤差偏大。本實(shí)驗(yàn)選擇樣品濃度為60 mg/mL，鄰苯二甲酸氫鉀濃度為10 mg/mL，此時(shí)樣品的溶解性和流動(dòng)性均較好，且從圖1也可以看出，樣品及內(nèi)標(biāo)物信號(hào)在可比范圍內(nèi)。

2.1.4 弛豫延遲時(shí)間的選擇 以內(nèi)標(biāo)物鄰苯二甲酸氫鉀的一組質(zhì)子峰H-4,5(δ7.56～δ7.59,2H,dd)作為內(nèi)標(biāo)定量峰，設(shè)定其積分面積(Ar1)為2.000，考察了不同弛豫延遲時(shí)間(1，2，5，10，25 s)下，鄰苯二甲酸氫鉀的質(zhì)子峰H-3,6(δ7.72～δ7.74,2H,dd)的積分面積(Ar2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著弛豫延遲時(shí)間的增加，Ar2分別為2.003，2.005，2.009，2.015，2.025，其值略微增加，但各條件下Ar2值均接近其實(shí)際質(zhì)子數(shù)，重現(xiàn)性較好，為節(jié)省時(shí)間，選擇弛豫延遲時(shí)間為1 s。

2.1.5 掃描次數(shù)的選擇 以內(nèi)標(biāo)物鄰苯二甲酸氫鉀的一組質(zhì)子峰H-4,5(δ7.56～δ7.59,2H,dd)作為內(nèi)標(biāo)定量峰，設(shè)定其積分面積為2.000，考察了掃描次數(shù)(2，4，8，16，32次)對(duì)甘露聚糖肽異頭氫區(qū)域(δ4.88～δ5.35)譜峰積分面積(As)的影響。結(jié)果顯示，采樣次數(shù)較少時(shí)，重現(xiàn)性較差，當(dāng)掃描16次以上時(shí)，As的數(shù)據(jù)重現(xiàn)性較好，繼續(xù)增大掃描次數(shù)，As無(wú)明顯提高，因此實(shí)驗(yàn)選擇掃描16次。

2.2 甘露聚糖肽多糖含量的測(cè)定

2.2.1 定量公式的推導(dǎo) 根據(jù)1H-NMR中譜峰面積與該譜峰對(duì)應(yīng)氫原子數(shù)成正比的原理，可知溶液中所有氫的吸收強(qiáng)度均相等，即Ar/MHr=As/MHs。式中，Ar為內(nèi)標(biāo)定量峰的積分面積；MHr為內(nèi)標(biāo)定量峰包含氫原子的摩爾數(shù)；As為供試品定量峰的積分面積；MHs為供試品定量峰包含氫原子的摩爾數(shù)[10]。等式左邊內(nèi)標(biāo)物的計(jì)算比較簡(jiǎn)單直觀，只需將稱量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量Wr、內(nèi)標(biāo)定量峰包含氫原子的數(shù)目Nr以及內(nèi)標(biāo)物相對(duì)分子質(zhì)量Mr代入，將左邊算式變成Ar·Mr/(Nr·Wr)。等式右邊反映的是甘露聚糖肽所有糖殘基異頭氫的情況，樣品定量峰面積As以整個(gè)異頭氫區(qū)域譜峰面積來(lái)表示。通過(guò)上述等式可得到樣品中所有糖殘基異頭氫的摩爾數(shù)MHs。由于甘露聚糖肽的糖鏈部分由甘露糖和少量葡萄糖組成，甘露糖和葡萄糖均為六碳糖，相對(duì)分子質(zhì)量均為180.155。樣品中多糖的質(zhì)量可用甘露糖和葡萄糖的總質(zhì)量表示，多糖的質(zhì)量Ws等于MHs·Ms，Ms值為180.155。進(jìn)一步根據(jù)甘露聚糖肽樣品的質(zhì)量W，可以得到樣品中多糖含量Ws%。

2.2.2 精密度試驗(yàn) 在優(yōu)化條件下，取同一供試品溶液，連續(xù)測(cè)定6次，以內(nèi)標(biāo)物鄰苯二甲酸氫鉀的一組質(zhì)子峰H-4,5(δ7.56～δ7.59,2H,dd)作為內(nèi)標(biāo)定量峰，設(shè)定其積分面積為2.000，記錄樣品定量峰的積分面積(As)并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示6次測(cè)定結(jié)果的RSD 為0.34%，表明該方法精密度良好。

2.2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 在優(yōu)化條件下，平行制備3份供試品(批號(hào)131101)溶液，以內(nèi)標(biāo)物鄰苯二甲酸氫鉀的一組質(zhì)子峰H-4,5(δ7.56～δ7.59,2H,dd)作為內(nèi)標(biāo)定量峰，設(shè)定其積分面積為2.000，記錄樣品定量峰積分面積(As)并計(jì)算供試品中多糖含量的RSD值。3份樣品含量測(cè)定值的RSD 為0.71%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 對(duì)不同批次樣品的測(cè)定結(jié)果 采用核磁共振氫譜法對(duì)不同批次的甘露聚糖肽原料藥樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1所示，多糖含量分別為101%，100%，99.6%。說(shuō)明該方法測(cè)定甘露聚糖肽原料藥樣品中的多糖含量可行且測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定。

表1 不同批次樣品的測(cè)定結(jié)果Table 1 The measurement results of different batches of samples

同時(shí)采用苯酚-硫酸法對(duì)批號(hào)131101的原料進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得多糖含量為104%，兩種方法的測(cè)定結(jié)果相一致。需要說(shuō)明的是，為了提高該測(cè)定方法的專屬性，應(yīng)先采用核磁共振氫譜法進(jìn)行定性鑒定，計(jì)算樣品和甘露聚糖肽標(biāo)準(zhǔn)品的相似度，如果相關(guān)系數(shù)ρ>0.95，認(rèn)為二者糖鏈結(jié)構(gòu)一致,可進(jìn)一步采用核磁共振氫譜法進(jìn)行含量測(cè)定,否則由于樣品中含有其他糖類物質(zhì)或在異頭氫區(qū)域有吸收的雜質(zhì),將會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果不能準(zhǔn)確反映甘露聚糖肽的真實(shí)含量。另外核磁共振波譜法不僅局限于測(cè)定甘露聚糖肽的含量，其他多糖的含量如果結(jié)構(gòu)明確也可以采用該方法進(jìn)行測(cè)定。

3 結(jié) 論

本文建立了1H-NMR測(cè)定甘露聚糖肽中多糖含量的方法，所建立的方法專屬性強(qiáng)，精密度高，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，且操作簡(jiǎn)便，可用于測(cè)定甘露聚糖肽的多糖含量。此外，該方法還可用于其它結(jié)構(gòu)明確的多糖含量測(cè)定。

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Determination of Polysaccharide Content in Mannatide by1H-NMR

WU Meng-qi1,ZHANG Wen-qing1,XU Zhi-zhen1,WAN Yan-fei2,ZHANG Li2,XIA Wei1*

(1.Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry,East China University of Science and Technology,Shanghai 200237,China；2.Chengdu Lier Pharmaceutical Co.,Ltd.,Chengdu 610083,China)

A proton-nuclear magnetic resonance(1H-NMR) method was established for the determination of polysaccharide content in mannatide using potassium acid phthalate as the internal standard.Effects of some experiment parameters were investigated.The optimal conditions were selected as follows:relaxation delay time(d1):1 s；transient number(ns):16.The results indicated that,under the optimal conditions,the good precision and repeatability for the method were obtained.The polysaccharide content in mannatide, determined by the1H-NMR method with inner standard model,was similar to that of the ultraviolet spectrophotometry method.The established method was simple,specific and repeatable.Therefore,it could be used not only for the determination of polysaccharide content in mannatide,but also for detection of other kinds of polysaccharide with definite structures.

1H nuclear magnetic resonance；polysaccharide content；mannatide

2016-10-07；

2016-11-22

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.021

O482.532；O629.12

A

1004-4957(2017)05-0693-04

*通訊作者：夏 瑋，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物的研究與應(yīng)用，Tel：021-64253221，E-mail：xiawei1999@ecust.edu.cn