謝 航，邱宏端，林 娟，趙 瑩

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350116)

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黃腐酸高產(chǎn)菌株的培養(yǎng)條件優(yōu)化研究

謝 航，邱宏端，林 娟，趙 瑩

(福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350116)

對發(fā)酵蔗渣產(chǎn)黃腐酸(FA)的高產(chǎn)菌株-枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化研究. 獲得的優(yōu)化培養(yǎng)基配方為： 可溶性淀粉、 蛋白胨、 磷酸氫二鉀和硫酸鎂的添加量分別為12.50、 12.50、 0.25、 0.50 g·L-1；優(yōu)化的培養(yǎng)條件為： pH 7.0、 溫度37 ℃、 裝液量20 mL/250 mL、 轉(zhuǎn)速 130 r·min-1、 接種量5%(體積分?jǐn)?shù)). 在該優(yōu)化的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下，枯草芽孢桿菌培養(yǎng)12 h后的細(xì)胞生物量達(dá)2.280×109cfu·mL-1，較優(yōu)化前提高了77.9倍. 采用優(yōu)化前后的條件培養(yǎng)菌種進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)黃腐酸實(shí)驗(yàn)，結(jié)果優(yōu)化后的發(fā)酵產(chǎn)品中FA含量為26.36%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，細(xì)胞生物量為1.09×109cfu·g-1，比優(yōu)化前分別提高了13.9%和2.3倍.

黃腐酸； 枯草芽孢桿菌； 培養(yǎng)條件優(yōu)化

0 引言

腐植酸(humic acid，HA)廣泛存在于土壤、 褐煤、 泥炭、 湖泊、 河流、 海洋和沼澤中[1]，是有機(jī)物質(zhì)在微生物參與下經(jīng)過復(fù)雜的化學(xué)、 生物分解等一系列反應(yīng)后的一類富含多種官能團(tuán)的天然大分子有機(jī)弱酸. 而黃腐酸(fulvic acid，F(xiàn)A)是HA中分子質(zhì)量最小、 溶解度最高、 生物活性最強(qiáng)且吸收效果最佳的部分，含有羥基、 氨基等基團(tuán)，具有一定的陽離子交換、 絡(luò)合、 螯合以及吸附能力[2]，廣泛應(yīng)用于農(nóng)林牧、 醫(yī)藥衛(wèi)生、 環(huán)保、 石油、 化工、 建材等領(lǐng)域[3-5].

目前，黃腐酸的生產(chǎn)一方面可以從泥炭和風(fēng)化煤中提取，另一方面也可以利用生物技術(shù)的方法以農(nóng)林下腳料如作物秸稈、 木屑、 蔗渣等為原料生產(chǎn)，即生物腐植酸(biotechnology humicacid，BHA). BHA開拓了將廢棄物轉(zhuǎn)化為極有價值的新資源和農(nóng)業(yè)資源綜合利用的新路[6]. 現(xiàn)有的生物腐植酸發(fā)酵主要為人工堆建發(fā)酵法，其中有許多物料與環(huán)境中的微生物參與代謝，存在腐植酸產(chǎn)量較低、 產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等不足[7-8]. 為了更好地篩選到發(fā)酵蔗渣高產(chǎn)FA的菌株，實(shí)驗(yàn)室前期以漳州市詔安綠洲生化有限公司自主研制的生物腐植酸樣品為基礎(chǔ)，分離篩選出了能有效提升FA含量的黃腐酸高產(chǎn)菌株-枯草芽孢桿菌[9]. 本研究對發(fā)酵蔗渣高產(chǎn)FA的枯草芽孢桿菌進(jìn)行培養(yǎng)基配方與培養(yǎng)條件的優(yōu)化，旨在提高其細(xì)胞生物量，從而為后續(xù)枯草芽孢桿菌更好地應(yīng)用于發(fā)酵蔗渣生產(chǎn)黃腐酸奠定良好基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)為實(shí)驗(yàn)室選育保藏菌種.

1.2 培養(yǎng)基

1) 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[10].

2) 工廠發(fā)酵培養(yǎng)基. 蔗渣： 麩皮為1∶1，并添加少量淀粉等成分. 配料時將所有原料加水混合均勻，物料水分控制以手捏混合料能成塊，指尖有水滲出但不滴落為宜.

1.3 主要儀器設(shè)備

生化培養(yǎng)箱(SHP-250型, 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司) ； 超凈工作臺(SW-CJ-2FD型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)； 手提式高壓蒸汽滅菌鍋(YXQ-LS18SI型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)； 可見分光光度計(jì)(V-1200型，上海美譜達(dá)儀器有限公司)； 氣浴式恒溫?fù)u床(THZ-82型，常州國華電器有限公司) ； pH計(jì)(PHS-3C型，上海精密科學(xué)儀器有限公司)

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 枯草芽孢桿菌生長曲線測定

配制牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，分裝于試管(5 mL)和三角瓶(100 mL/250 mL)中(裝液量下同). 先將枯草芽孢桿菌斜面菌種接種于試管液體培養(yǎng)基中，37 ℃下靜置培養(yǎng)24 h，后以5%(體積分?jǐn)?shù)，以下同)接種量接種到三角瓶培養(yǎng)基中，置于37 ℃、 200 r·min-1下培養(yǎng)，分別采用分光光度法(OD600nm)和平板菌落計(jì)數(shù)法跟蹤測定細(xì)胞生物量的變化情況(單位為cfu·mL-1: 菌落數(shù)/mL)，獲得枯草芽孢桿菌的生長曲線，從而為后續(xù)優(yōu)化菌種試驗(yàn)掌握其培養(yǎng)時間奠定依據(jù).

1.4.2 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

1.4.2.1 碳源對菌種細(xì)胞生物量的影響

以液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，選擇葡萄糖等9種碳源，分別配制成含10 g·L-1單一碳源的培養(yǎng)基，后將菌液按照5%接種量接入并置于37 ℃、 200 r·min-1下培養(yǎng)12 h(培養(yǎng)條件下同). 試驗(yàn)以O(shè)D600增長量(即菌種培養(yǎng)后OD600值與菌種初始OD600值之差)為指標(biāo)[11]，確定最佳碳源種類. 后用優(yōu)化的碳源種類，探討不同添加量(2.5～17.5 g·L-1)對菌種生長的影響，從而確定最佳的碳源添加量.

1.4.2.2 氮源對菌種細(xì)胞生物量的影響

在碳源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別以10 g·L-1的蛋白胨、 硝酸銨、 硫酸銨、 尿素、 氯化銨作為氮源配制培養(yǎng)基，以O(shè)D600增長量為指標(biāo)，確定最佳氮源種類. 后用優(yōu)化的的氮源種類，探討不同添加量(2.5～17.5 g·L-1)對菌種生長的影響，從而確定最佳的氮源添加量.

1.4.2.3 無機(jī)鹽對菌種細(xì)胞生物量的影響

在碳源和氮源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，選擇鉬酸鈉等10種無機(jī)鹽，分別配制成含5 g·L-1的無機(jī)鹽培養(yǎng)基，以O(shè)D600增長量為指標(biāo)，確定最佳無機(jī)鹽種類. 后采用L27(313)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法[12]，探討不同種類的無機(jī)鹽配比及其交互作用對菌體細(xì)胞生長量的影響，從而確定作用比較明顯的無機(jī)鹽的添加量.

1.4.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.4.3.1 培養(yǎng)基初始pH值對菌種細(xì)胞生物量的影響

以優(yōu)化的培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH值范圍 4.0～10.0，再將菌液以5%接種量接種到培養(yǎng)基中，置于37 ℃、 200 r·min-1下培養(yǎng)12 h，以O(shè)D600增長量為指標(biāo)，確定培養(yǎng)基的最佳初始pH值.

1.4.3.2 溫度對菌種細(xì)胞生物量的影響

以優(yōu)化的培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)，將枯草芽孢桿菌以5%接種量接種到培養(yǎng)基中，分別置于30、 37、 45、 50 ℃，200 r·min-1下培養(yǎng). 實(shí)驗(yàn)過程每3 h取樣跟蹤測定其OD600的變化，從而確定最佳培養(yǎng)溫度.

1.4.3.3 溶氧對菌種細(xì)胞生物量的影響

1) 轉(zhuǎn)速. 將枯草芽孢桿菌以5%接種量接種到已優(yōu)化培養(yǎng)基成分的液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃，分別在50～300 r·min-1的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)12 h，以O(shè)D600增長量為指標(biāo)確定最佳轉(zhuǎn)速.

2) 裝液量. 分別設(shè)定培養(yǎng)基的初始裝液量為20～140 mL/250 mL，將枯草芽孢桿菌以5%接種量接種至不同裝液量的錐形瓶中，置于37 ℃、 200 r·min-1下培養(yǎng)12 h，以O(shè)D600增長量為指標(biāo)確定最佳裝液量.

1.4.3.4 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)法考察溫度、 轉(zhuǎn)速、 裝液量、 培養(yǎng)基初始pH值對菌種生長的影響. 按照L27(313)正交試驗(yàn)表設(shè)定相應(yīng)培養(yǎng)條件后，將枯草芽孢桿菌以5%接種量接種培養(yǎng)12 h，試驗(yàn)以O(shè)D600增長量為指標(biāo)確定最佳培養(yǎng)條件.

1.4.3.5 接種量對菌種細(xì)胞生物量的影響

在培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將活化好的菌液分別以1%～20%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接種至液體培養(yǎng)基中，跟蹤測定OD600的變化情況，探討不同接種量對菌種細(xì)胞生物量的影響. 后在培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件不變的情況下，采用優(yōu)化的接種量接種，利用平板菌落計(jì)數(shù)法確定枯草芽孢桿菌在最佳培養(yǎng)條件下的細(xì)胞生物量.

1.5 高細(xì)胞生物量菌種應(yīng)用發(fā)酵產(chǎn)黃腐酸實(shí)驗(yàn)

分別將優(yōu)化前后培養(yǎng)的兩批枯草芽孢桿菌接種于工廠發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵物料每袋裝料量30 kg，各4袋堆置于發(fā)酵池的上層進(jìn)行發(fā)酵. 同時以工廠原始發(fā)酵模式為對照，測定發(fā)酵結(jié)束后實(shí)驗(yàn)組和對照組FA含量，以及細(xì)菌細(xì)胞生物量的差異.

2 結(jié)果與分析

圖1 枯草芽孢桿菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of Bacillus subtilis

2.1 枯草芽孢桿菌生長曲線的測定

為了解枯草芽孢桿菌在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中的生長狀況，實(shí)驗(yàn)過程每隔3 h利用分光光度法和平板菌落計(jì)數(shù)法跟蹤測定細(xì)胞生物量的變化情況，并繪制菌種生長曲線(見圖1). 由生長曲線可知，菌種培養(yǎng)12 h后進(jìn)入穩(wěn)定期，此時細(xì)胞生物量OD600為2.26，平板菌落計(jì)數(shù)達(dá)2.927×107cfu·mL-1. 實(shí)驗(yàn)表明，后續(xù)考察菌種的細(xì)胞生物量以培養(yǎng)12 h為較適合時期.

2.2 培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.2.1 碳源對菌種細(xì)胞生物量的影響

碳源不僅能為生物的生長提供必要的碳元素和能量，而且是微生物合成代謝產(chǎn)物所必需的重要組成部分. 以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為對照配方，選擇9種不同碳源進(jìn)行篩選，結(jié)果見圖2. 由圖2可見，菌種以可溶性淀粉和牛肉膏作為碳源時，細(xì)胞OD600增長量最大(分別為0.565和0.586). 雖然牛肉膏作為碳源時細(xì)胞生長量略高于可溶性淀粉，但考慮后續(xù)工廠化培養(yǎng)菌體節(jié)約培養(yǎng)基成本且實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)基煮沸的應(yīng)用培養(yǎng)模式，因此最終確定采用可溶性淀粉作為菌種培養(yǎng)的最優(yōu)碳源. 為此，試驗(yàn)進(jìn)一步對可溶性淀粉的添加量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖3. 由圖3可見，隨著可溶性淀粉添加量的增加，細(xì)胞生物量也不斷提高，當(dāng)可溶性淀粉添加量為12.5 g·L-1時，OD600增長量達(dá)到最高(為0.713)； 而后繼續(xù)增加可溶性淀粉的添加量，OD600增長量卻出現(xiàn)緩慢下降. 實(shí)驗(yàn)表明，可溶性淀粉的最適添加量為12.5 g·L-1.

注： 以下圖中小寫字母表示P0.05，大寫字母表示P0.01.

圖2 不同碳源對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on Bacillus subtilis注： 圖2～3以菌懸液稀釋5倍后的OD600增長量為縱坐標(biāo)

圖3 可溶性淀粉添加量對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.3 Effect of addition of soluble starch on Bacillus subtilis

2.2.2 氮源對菌種細(xì)胞生物量的影響

氮源是微生物生長的重要元素，可構(gòu)成細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的蛋白質(zhì)、 含氮物質(zhì)以及代謝產(chǎn)物等. 在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，牛肉膏與蛋白胨是有機(jī)氮源，營養(yǎng)成分豐富，但成本較高. 為此，實(shí)驗(yàn)考察4種無機(jī)氮源對菌種生長的適應(yīng)情況，結(jié)果見圖4. 由圖4可見，添加無機(jī)氮作為培養(yǎng)基氮源時菌種基本不生長，而對照組以蛋白胨作為氮源時，菌種的OD600增長量最大，表明菌種的最佳氮源種類是蛋白胨. 實(shí)驗(yàn)繼續(xù)對蛋白胨的添加量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見圖5. 由圖5可見，隨著蛋白胨添加量的增加，其OD600增長量不斷提高，當(dāng)添加量為12.5 g·L-1時，OD600增長量顯著，當(dāng)添加量為15.0 g·L-1時，OD600增長量減緩，之后隨著蛋白胨添加量的繼續(xù)增加，OD600增長量出現(xiàn)緩慢下降. 實(shí)驗(yàn)表明，培養(yǎng)基中蛋白胨適合的添加量為12.5～15.0 g·L-1，但考慮成本因素，最后選擇添加量12.5 g·L-1為宜.

圖4 不同氮源對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.4 Effect of different nitrogen sources on Bacillus subtilis注： 圖4～5以菌懸液稀釋5倍后的OD600增長量為縱坐標(biāo)

圖5 蛋白胨添加量對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.5 Effect of addition of peptone on Bacillus subtilis

2.2.3 無機(jī)鹽對菌種細(xì)胞生物量的影響

2.2.3.1 無機(jī)鹽種類

圖6 不同無機(jī)鹽種類對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.6 Effect of different inorganic salts on Bacillus subtilis注： 本圖以菌懸液稀釋10倍后的OD600增長量為縱坐標(biāo)

在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中，明確的無機(jī)鹽成分只有氯化鈉一種. 而無機(jī)鹽作為微生物生長所不可缺少的營養(yǎng)物質(zhì)，對構(gòu)成細(xì)胞的組成成分、 維持酶的活性、 調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓等方面具有重要作用. 實(shí)驗(yàn)繼續(xù)探討多種無機(jī)鹽對菌種生長的影響, 結(jié)果見圖6. 由圖6可見，當(dāng)培養(yǎng)基中分別添加氯化鈣、 磷酸氫二鉀、 硫酸鎂作為無機(jī)鹽時，菌種OD600增長量較大，分別為0.865、 0.842、 0.634，說明這些無機(jī)鹽的添加對菌種生長較有利. 因此，后續(xù)繼續(xù)考察氯化鈣、 磷酸氫二鉀和硫酸鎂的最佳添加量，以及它們之間的交互作用.

2.2.3.2 無機(jī)鹽添加量

實(shí)驗(yàn)以氯化鈉、 磷酸氫二鉀、 氯化鈣、 硫酸鎂為考察因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L27(313)進(jìn)行無機(jī)鹽及配比優(yōu)化試驗(yàn)，并考慮磷酸氫二鉀與其余3因素的交互作用. 正交試驗(yàn)因素水平表分別選擇氯化鈉(因素A)的3水平為(0%、 0.25%、 0.50%)； 磷酸氫二鉀(因素B)的3水平為(0%、 0.025%、 0.050%)； 氯化鈣(因素C)的3水平為(0%、 0.05%、 0.10%)； 硫酸鎂(因素D)的3水平為(0%、 0.05%、 0.10%). 由試驗(yàn)的方差分析結(jié)果(見表1)可以看出，影響枯草芽孢桿菌生長的主次順序?yàn)镈>B> B×D>A>C> B×C> A×B. 其中，磷酸氫二鉀(B)和硫酸鎂(D)對于菌體生長具有顯著性影響，而氯化鈉(A)和氯化鈣(C)對于菌體生長不具有顯著性影響，且在其他無機(jī)鹽存在下添加氯化鈉菌體生長欠佳，而氯化鈣對于菌體生長影響最小. 通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，最優(yōu)條件組合為A1B2C1D2，即當(dāng)磷酸氫二鉀、 硫酸鎂的添加量分別為0.25、 0.50g·L-1時菌體生長最好，說明二者對于菌體生長具有促進(jìn)作用.

表1 無機(jī)鹽添加量正交實(shí)驗(yàn)綜合方差分析

2.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1 培養(yǎng)基初始pH值對菌種細(xì)胞生物量的影響

培養(yǎng)基pH值對菌體生長與代謝具有重要影響[13-14]，實(shí)驗(yàn)考察不同pH值對菌種生長的影響，結(jié)果見圖7. 由圖7可見，當(dāng)pH值維持在5.0～8.0之間時，菌體均生長旺盛； 其中培養(yǎng)基在初始pH值7.0時，菌種生長最好，OD600增長量最大(為0.752)； 而過酸、 過堿均不利于菌種的生長. 因此，確定菌種生長的培養(yǎng)基初始pH值為7.0.

2.3.2 溫度對菌種細(xì)胞生物量的影響

溫度是影響微生物生長速率的極其重要因素. 實(shí)驗(yàn)考察不同溫度對菌種生長的影響，結(jié)果見圖8. 由圖8可見，在一定溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，培養(yǎng)液中的菌濃度逐漸增加，其中，溫度為45 ℃時，菌種的細(xì)胞濃度達(dá)到最大值(為0.663). 而溫度高于45 ℃時，菌種生長速率卻出現(xiàn)下降. 因此，可以確定菌種的最適生長溫度為45 ℃.

圖7 培養(yǎng)基初始pH對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.7 Effect of initial pH of medium on Bacillus subtilis注： 本圖以菌懸液稀釋10倍后的OD600增長量為縱坐標(biāo)

圖8 培養(yǎng)溫度對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.8 Effect of culture temperature on Bacillus subtilis注： 本圖以菌懸液稀釋10倍后的OD600為縱坐標(biāo)

2.3.3 溶氧對菌種細(xì)胞生物量的影響

2.3.3.1 轉(zhuǎn)速

溶氧對于細(xì)胞生長和產(chǎn)物的積累有較大的影響，而細(xì)菌培養(yǎng)時的搖床轉(zhuǎn)速和錐形瓶的裝液量均是影響溶氧的重要參數(shù)，因此考查轉(zhuǎn)速和裝液量對細(xì)胞生長的影響，結(jié)果見圖9. 由圖9可見，轉(zhuǎn)速較低時，菌體OD600增長量很低，而后隨著轉(zhuǎn)速的增加，菌體OD600增長量急劇上升，當(dāng)轉(zhuǎn)速上升至170 r·min-1時OD600增長量最大(為0.772)，而當(dāng)轉(zhuǎn)速繼續(xù)提高時，菌體OD600增長量便不再增加，而是維持在與170 r·min-1轉(zhuǎn)速下相當(dāng)?shù)乃? 這說明170 r·min-1為菌種培養(yǎng)的最佳轉(zhuǎn)速.

2.3.3.2 培養(yǎng)基裝液量

培養(yǎng)基裝液量也是考察好氧微生物對氧氣需求情況的另一個指標(biāo)，如培養(yǎng)基裝液量少，說明培養(yǎng)通氣量大，反之說明菌種通氣量小. 實(shí)驗(yàn)考察三角瓶的不同裝液量對菌種培養(yǎng)的影響，結(jié)果見圖10. 由圖10可見，隨著裝液量的增加，菌種的OD600增長量逐漸下降，但當(dāng)裝液量≥80 mL/250 mL時，菌種的OD600增長量差異不大. 而初始裝液量為20ml/250mL，菌種的OD600增長量最大(為0.907)，因此，選擇20 mL/250 mL作為菌種培養(yǎng)的初始裝液量.

圖9 轉(zhuǎn)速對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.9 Effect of rotational speed on Bacillus subtilis注： 圖9～10以菌懸液稀釋10倍后的OD600增長量為縱坐標(biāo)

圖10 培養(yǎng)基裝液量對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.10 Effect of liquid volume in flask of medium on Bacillus subtilis

2.3.4 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L27(313)進(jìn)行培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)，同時考察轉(zhuǎn)速和裝液量有無交互作用. 正交試驗(yàn)因素水平表分別選擇裝液量/mL(因素A)的3水平為20、 40、 80； 轉(zhuǎn)速/r·min-1(因素B)的3水平為130、 170、 200； pH值(因素C)的3水平為6.0、 7.0、 8.0； 溫度/℃(因素D)的3水平為37、 45、 50. 由方差分析結(jié)果(見表2)可以看出，影響枯草芽孢桿菌生長的條件因素主次順序?yàn)镈>A>A×B>B>C. 其中，培養(yǎng)基裝液量(A)、 培養(yǎng)溫度(D)對于菌體生長具有顯著性影響，而轉(zhuǎn)速(B)和培養(yǎng)基初始pH值(C)對菌體生長不具有顯著性影響，且轉(zhuǎn)速和裝液量無交互作用. 通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，最優(yōu)條件組合為A1B1C2D1，即裝液量20 mL/250 mL、 轉(zhuǎn)速 130 r·min-1、 培養(yǎng)基初始pH值 7.0、 培養(yǎng)溫度37 ℃時菌體生長最好.

表2 培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)綜合方差分析

2.3.5 菌種接種量對細(xì)胞生物量的影響

接種量對微生物生長延滯期的長短具有影響作用. 實(shí)驗(yàn)考察不同接種量對菌種生長的影響，結(jié)果見圖11. 由圖11可見，接種量太小時(如1%和3%)，菌種的生長周期變長； 接種量太大時(如15%和20%)，菌種的穩(wěn)定期縮短，菌種過早衰亡. 因此接種量應(yīng)從5%和10%進(jìn)行選擇.

2.4 最佳條件實(shí)驗(yàn)

將枯草芽孢桿菌采用上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件進(jìn)行培養(yǎng)，并采用平板菌落計(jì)數(shù)跟蹤測定5%和10%接種量下的細(xì)胞生物量，以明確采用最佳培養(yǎng)條件下的枯草芽孢桿菌的細(xì)胞生物量，結(jié)果見圖12. 由圖12可見，采用5%接種量，菌體生長的穩(wěn)定期較長、 不易衰亡，菌種培養(yǎng)至12 h時細(xì)胞生物量最高(2.280×109cfu·mL-1)，較優(yōu)化前牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的細(xì)胞生物量(2.927×107cfu·mL-1)提高了77.9倍.

圖11 接種量對枯草芽孢桿菌生長的影響Fig.11 Effect of inoculation amount on Bacillus subtilis注： 本圖以菌懸液稀釋10倍后的OD600為縱坐標(biāo)

圖12 最佳培養(yǎng)條件下枯草芽孢桿菌的細(xì)胞生物量Fig.12 Cell biomass of Bacillus subtilis under optimal culture conditions

2.5 高細(xì)胞生物量菌種應(yīng)用發(fā)酵產(chǎn)黃腐酸實(shí)驗(yàn)

分別采用優(yōu)化前后的培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件進(jìn)行枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)，并將培養(yǎng)的菌種分別接種于工廠發(fā)酵培養(yǎng)基，以工廠原始自然發(fā)酵模式為對照，3批物料分別堆料于發(fā)酵池的上層發(fā)酵，同時測定發(fā)酵4 d 的物料中FA含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù), 以下同)和細(xì)菌細(xì)胞生物量，結(jié)果見圖13、 14.

圖13 枯草芽孢桿菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)產(chǎn)FA的比較Fig.13 Comparison of FA from bagasse fermentation by Bacillus subtilis

圖14 枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)品中細(xì)胞生物量的比較Fig.14 Comparison of cell biomass from bagasse fermentation by Bacillus subtilis

由圖13、 14知，采用優(yōu)化后培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌應(yīng)用發(fā)酵，F(xiàn)A含量為26.36%，與工廠對照組(FA 13.95%)相比, FA增長率為88.96%； 與優(yōu)化前培養(yǎng)的菌種發(fā)酵(FA含量 23.14%)相比, FA增長率為13.90% . 從細(xì)胞數(shù)量看，優(yōu)化后菌種的發(fā)酵產(chǎn)品細(xì)胞生物量為1.09×109cfu·g-1，與工廠對照組(3.15×107cfu·g-1)相比提高了34.6倍，與優(yōu)化前菌種發(fā)酵的產(chǎn)品相比(細(xì)胞生物量為4.71×108cfu·g-1)提高了2.3倍. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，采用接種枯草芽孢桿菌發(fā)酵，產(chǎn)品中FA含量與細(xì)胞生物量較自然發(fā)酵均有顯著提高. 但從優(yōu)化前后培養(yǎng)的菌種發(fā)酵產(chǎn)品比較，優(yōu)化后菌種發(fā)酵的FA含量與細(xì)胞生物量較優(yōu)化前培養(yǎng)菌種發(fā)酵的增長幅度較小. 這可能是因?yàn)槲锪习l(fā)酵在不滅菌下，培養(yǎng)條件優(yōu)化前的枯草芽孢桿菌接種量已滿足發(fā)酵產(chǎn)FA的較好條件了，所以優(yōu)化條件后的菌種雖大幅增加了其接種量，但發(fā)酵物料的產(chǎn)物增長有限.

3 結(jié)語

以實(shí)驗(yàn)室前期篩選出的高產(chǎn)黃腐酸菌株-枯草芽孢桿菌為基礎(chǔ)，分別對其培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化. 以獲得的培養(yǎng)基配方為基礎(chǔ)優(yōu)化菌種，得到最適培養(yǎng)條件. 采用優(yōu)化條件，菌種培養(yǎng)12 h后的細(xì)胞生物量較優(yōu)化前的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基提高了77.9倍.

將優(yōu)化前后培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌應(yīng)用于工廠發(fā)酵蔗渣實(shí)驗(yàn). 接種優(yōu)化前后培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)品中FA含量及有益微生物較工廠自然發(fā)酵對照組顯著提高，而優(yōu)化條件后培養(yǎng)的菌種發(fā)酵產(chǎn)品FA含量及有益微生物較優(yōu)化前的也有一定幅度提高. 后續(xù)將以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步研究150 L中試發(fā)酵的應(yīng)用擴(kuò)大培養(yǎng)模式，在節(jié)約生產(chǎn)成本的同時，為工廠大規(guī)模化應(yīng)用該菌發(fā)酵蔗渣生產(chǎn)黃腐酸奠定基礎(chǔ)

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(責(zé)任編輯： 洪江星)

Optimization of culture conditions of strains to produce fulvic acid

XIE Hang，QIU Hongduan，LIN Juan，ZHAO Ying

(College of Biological Science and Technology，F(xiàn)uzhou University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350116，China)

This study was performed to optimize the medium formula and culture conditions ofBacillussubtiliswhich produced fulvic acid (FA) from bagasse fermentation. The results showed that the optimal medium formula forBacillussubtilisconsisted of 12.50 g·L-1soluble starch, 12.50 g·L-1peptone, 0.25 g·L-1K2HPO4and 0.50 g·L-1MgSO4. And the optimal fermentation conditions were pH 7.0, 37 ℃, liquid volume of 20 mL/250 mL, rotation speed of 130 r·min-1, and inoculation amout of 5%(volume fraction). Under these conditions after growing for 12 hours, the cell biomass ofBacillussubtilisreached 2.280×109cfu·mL-1, which was increased by 77.9 times compared with those before the optimization. ApplicatedBacillussubtiliswhich culture conditions were used before and after optimization to produce FA, the results showed that FA content in the fermentation product was 26.36%(mass fraction) and the cell biomass reached 1.09×109cfu·g-1, which were increased by 13.19% and 2.3 times compared with those before the optimization.

fulvic acid；Bacillussubtilis； culture conditions optimization

10.7631/issn.1000-2243.2017.03.0438

1000-2243(2017)03-0438-08

2016-01-18

邱宏端(1955-)，女，教授，主要從事應(yīng)用微生物方面的研究，hongduanlq@163.com

國家農(nóng)業(yè)部2013年度農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201303094-05)

S939.9

A