周慧鳳，吳 鋆，王 瑜，畢淑云

（長春師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，長春130032）

以金納米粒子為共振光散射探針測定桑色素和楊梅苷含量

周慧鳳，吳 鋆，王 瑜，畢淑云＊

（長春師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，長春130032）

利用種子生長法合成金納米粒子（AuNPs），提出了以AuNPs為共振光散射（RLS）探針測定桑色素和楊梅苷含量的方法。通過靜電引力，AuNPs可與桑色素或者楊梅苷結(jié)合，形成二元復(fù)合物，使RLS強(qiáng)度增強(qiáng)。桑色素／楊梅苷－AuNPs體系的RLS強(qiáng)度增加值ΔIRLS與桑色素／楊梅苷的濃度呈線性關(guān)系，線性范圍分別為0.40～10.0，0.10～10.0μmol·L－1，檢出限（3S／N）分別為2.98，1.39μg·L－1。應(yīng)用該方法測定了合成樣品中的桑色素和楊梅苷的含量，加標(biāo)回收率在97.2%～103%之間，測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝5）在0.7%～2.5%之間。

共振光散射；金納米粒子；桑色素；楊梅苷

桑色素是在黃桑木和桑橙樹等中草藥中提取的一種異黃酮類化合物，為黃色針狀結(jié)晶［1］，具有抗腫瘤［2］、抗氧化［3］和抗凝血［4］的藥理活性。桑色素作為桑葉的有效成分，對于治療糖尿病及其并發(fā)癥具有顯著療效。楊梅苷是一種天然多羥基黃酮類化合物，主要存在于楊梅科植物楊梅的樹皮及葉子中，其生物活性很高，具有消炎、抗菌和鎮(zhèn)痛等作用［5］。目前關(guān)于測定桑色素的方法主要有高效液相色譜法［6］、高效液相色譜法－化學(xué)發(fā)光法［7］、碳糊電極陽極溶出法［8］和雙安培法［9］等，關(guān)于測定楊梅苷的方法主要包括高效液相色譜法［10－11］和以CPB為探針的共振光散射光譜法［12］等，但以金納米粒子（AuNPs）為共振光散射探針測定桑色素和楊梅苷的報(bào)道較少。

共振光散射技術(shù)興起于20世紀(jì)90年代，由于其具有方便快捷、靈敏度高、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，被國內(nèi)外分析測試科研人員廣泛應(yīng)用［13－16］。本工作利用種子生長法合成金納米粒子，并用透射電鏡表征其形貌及尺寸，采用共振光散射光譜法和紫外－可見吸收光譜法研究桑色素／楊梅苷與AuNPs相互作用，優(yōu)化試驗(yàn)條件，并將此方法應(yīng)用于合成樣品的測定中。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

RF－5301PC型雙波長熒光分光光度計(jì)；TU－1901型雙光束紫外－可見分光光度計(jì)；pH－3S型精密酸度計(jì)。

三羥甲基氨基甲烷－鹽酸（Tris－HCl）溶液：三羥甲基氨基甲烷（Tris）與1mol·L－1鹽酸、0.1mol· L－1氯化鈉配制成pH 8的0.05mol·L－1緩沖溶液。

十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）溶液：0.1mol·L－1。

四氯金酸（HAuCl4）溶液：0.01mol·L－1。硼氫化鈉（NaBH4）溶液：0.01mol·L－1。

硝酸鉀、硝酸鎂、氯化鈉、氯化鈣、硫酸銅、硫酸鋅和葡萄糖均為分析純，試驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金納米粒子（AuNPs）的合成

種子液：將0.1mol·L－1CTAB溶液7.5mL加入0.01mol·L－1HAuCl4溶液0.25mL中，隨后立即加入0.01mol·L－1的NaBH4溶液（用冰水溶解）0.6mL，快速攪拌2min使溶液混合均勻，此時(shí)溶液為棕黃色（金種子），室溫下靜置1h，備用［］。

生長液：移取0.1mol·L－1CTAB溶液6.4mL，加入0.01mol·L－1HAuCl4溶液0.8mL，混勻后，再向該混合液中滴加0.01mol· L－1抗壞血酸溶液4.8mL，最后加入32mL水稀釋。

將種子液用水稀釋10倍后，移取60μL加入至生長液中，混合均勻后，在27℃下靜置過夜，即得到AuNPs。次日，將AuNPs溶液以10 000r·min－1轉(zhuǎn)速離心2次，除去AuNPs溶液中的表面活性劑。

1.2.2 透射電鏡（TEM）表征

移取2.88×10－7mol·L－1的AuNPs溶液1.25mL 2份，分別與2.0×10－4mol·L－1桑色素溶液1.25mL和1.0×10－3mol·L－1楊梅苷溶液1.25mL混勻，進(jìn)而對AuNPs溶液、桑色素－AuNPs溶液體系和楊梅苷－AuNPs溶液體系進(jìn)行TEM表征。

1.2.3 共振光散射試驗(yàn)

對于桑色素－AuNPs體系，分別移取1.0× 10－4mol·L－1桑色素溶液25μL和3.6× 10－8mol·L－1AuNPs溶液50μL，并用pH 8的Tris－HCl緩沖溶液定容至2.5mL。

對于楊梅苷－AuNPs體系，分別移取5.0× 10－4mol·L－1楊梅苷和3.6×10－8mol·L－1AuNPs溶液100μL，并用pH 8的Tris－HCl緩沖溶液定容至2.5mL。

在220～800nm范圍內(nèi)，分別掃描桑色素、楊梅苷、AuNPs、桑色素－AuNPs和楊梅苷－AuNPs的共振光散射光譜，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為3nm。單獨(dú)AuNPs的共振光散射強(qiáng)度記為I0；桑色素／楊梅苷－AuNPs的共振光散射強(qiáng)度記為Ii；ΔIRLS為Ii與I0之差。

1.2.4 紫外－可見吸收光譜試驗(yàn)

對于桑色素－AuNPs體系，分別移取1.0× 10－4mol·L－1桑色素溶液500μL和3.6× 10－8mol·L－1AuNPs溶液1 000μL，并用pH 8的Tris－HCl緩沖溶液定容至2.5mL。

對于楊梅苷－AuNPs體系，分別移取5.0× 10－4mol·L－1楊梅苷溶液100μL和3.6× 10－8mol·L－1AuNPs溶液500μL，并用pH 8的Tris－HCl緩沖溶液定容至2.5mL。

在220～800nm范圍內(nèi)，分別掃描桑色素、楊梅苷、桑色素－AuNPs和楊梅苷－AuNPs的紫外－可見吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 TEM表征

AuNPs、桑色素－AuNPs和楊梅苷－AuNPs的TEML圖見圖1。

由圖1可知：合成的AuNPs長度為41.5nm，直徑為28.1nm；桑色素－AuNPs的長度為59.1nm，直徑為46.9nm；楊梅苷－AuNPs的長度為56.2nm，直徑為50.0nm。桑色素－AuNPs和楊梅苷－AuNPs不僅尺寸變大，而且分布整齊均勻。

圖1 AuNPs（a）、桑色素－AuNPs（b）和楊梅苷－AuNPs（c）的TEM圖Fig.1 TEM images of AuNPs（a），morin hydrate－AuNPs（b）and myricetin－AuNPs（c）

2.2 共振光散射光譜

桑色素、楊梅苷、AuNPs、桑色素－AuNPs及楊梅苷－AuNPs的共振光散射光譜見圖2。

圖2 桑色素－AuNPs（a）和楊梅苷－AuNPs（b）體系的共振光散射光譜Fig.2 RLS spectra of（a）morin hydrate－AuNPs systum and（b）myricetin－AuNPs systum

由圖2可知：桑色素、楊梅苷和AuNPs的RLS強(qiáng)度較弱，當(dāng)AuNPs加入到桑色素或楊梅苷溶液中，體系的RLS強(qiáng)度明顯提高。桑色素和楊梅苷均為黃酮類物質(zhì)，它們的pKa分別為5.09［18］和5.23［19］。當(dāng)pH為8時(shí)，桑色素和楊梅苷均發(fā)生解離，以負(fù)電荷的形式存在于體系中，由于AuNPs表面被陽離子表面活性劑CTAB包裹而帶有正電荷，桑色素或楊梅苷與AuNPs產(chǎn)生靜電引力而結(jié)合在一起，形成二元復(fù)合物，從而引起RLS強(qiáng)度的明顯改變。桑色素－AuNPs、楊梅苷－AuNPs體系的RLS最高強(qiáng)度峰分別出現(xiàn)在294，291nm，因此試驗(yàn)選擇桑色素－AuNPs、楊梅苷－AuNPs體系的共振光散射光譜的檢測波長分別為294，291nm。

2.3 紫外－可見吸收光譜

桑色素－AuNPs、楊梅苷－AuNPs體系的紫外－可見吸收光譜見圖3。

由圖3可知：桑色素－AuNPs體系有4個(gè)吸收峰，分別在波長220，276，327，392nm處，相比于單獨(dú)的桑色素的吸收峰均發(fā)生了紅移。如果最大吸收峰的波長向長波長方向移動，那么就表明物質(zhì)的粒徑增大［20］。AuNPs由于表面被CTAB包裹而帶有正電荷，與桑色素的陰離子通過靜電引力形成復(fù)合物，粒徑變大，最終影響吸收峰產(chǎn)生了紅移。同理，楊梅苷在377nm處的吸收峰紅移至379nm處，因此，AuNPs與楊梅苷也通過靜電引力發(fā)生相互作用而形成楊梅苷－AuNPs二元復(fù)合物。

2.4 試驗(yàn)條件的選擇

2.4.1 體系酸度

試驗(yàn)采用Tris－HCl緩沖溶液來控制體系的酸度，考察了酸度對體系RLS強(qiáng)度的影響，見圖4。

由圖4可知：在桑色素／楊梅苷－AuNPs體系中，當(dāng)pH小于8時(shí)，隨著pH增大，體系的ΔIRLS也隨之增大；當(dāng)pH為8時(shí)，ΔIRLS出現(xiàn)最大值；當(dāng)pH大于8時(shí)，體系的ΔIRLS隨pH增大而減小。試驗(yàn)選擇桑色素／楊梅苷－AuNPs體系的酸度為pH 8。

圖3 桑色素－AuNPs（a）和楊梅苷－AuNPs（b）體系的紫外吸收光譜Fig.3 UV－Vis absorption spectra of morin hydrate－AuNPs systum（a）and myricetin－AuNPs systum（b）

圖4 酸度對桑色素－AuNPs體系和楊梅苷－AuNPs體系的共振光散射強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of acidity on RLS intensity of morin hydrate－AuNPs systum and myricetin－AuNPs systum

2.4.2 反應(yīng)時(shí)間及加樣順序

在20～45℃溫度下，試驗(yàn)考察了桑色素／楊梅苷與AuNPs的加樣順序和反應(yīng)時(shí)間對體系ΔIRLS的影響。結(jié)果表明兩種因素對體系的ΔIRLS均沒有產(chǎn)生明顯的影響。

2.4.3 AuNPs的濃度

AuNPs的濃度對桑色素／楊梅苷－AuNPs體系的影響見圖5。

圖5 AuNPs濃度對桑色素－AuNPs體系和楊梅苷－AuNPs體系的共振光散射強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of concentration of AuNPs on RLS intensity of morin hydrate－AuNPs systum and myricetin－AuNPs systum

由圖5可知：對于桑色素－AuNPs體系來說，當(dāng)AuNPs的濃度低于7.2×10－10mol·L－1時(shí)，體系的ΔIRLS隨著AuNPs濃度的增加而增大，當(dāng)AuNPs的濃度高于7.2×10－10mol·L－1時(shí)，體系的ΔIRLS隨著AuNPs濃度的增加而減小。因此，在桑色素－AuNPs體系中，試驗(yàn)選擇AuNPs的濃度為7.2× 10－10mol·L－1。同理，對于楊梅苷－AuNPs體系，試驗(yàn)選擇AuNPs的濃度為1.44×10－9mol·L－1。

2.5 離子強(qiáng)度的影響

離子強(qiáng)度對桑色素／楊梅苷－AuNPs體系的影響見圖6。

由圖6可知：隨著氯化鈉質(zhì)量濃度的增加，桑色素／楊梅苷－AuNPs體系的ΔIRLS明顯降低，可能是因?yàn)樯Ｉ兀瘲蠲奋战怆x出的陰離子與Na＋產(chǎn)生靜電引力，從而削弱了桑色素／楊梅苷與AuNPs的結(jié)合作用。

2.6 共存物質(zhì)的影響

試驗(yàn)考察了一些金屬離子和葡萄糖對桑色素／楊梅苷－AuNPs體系的影響。結(jié)果顯示：當(dāng)相對誤差控制在±5%以內(nèi)時(shí)，在桑色素－AuNPs體系中，4 000倍的K＋，2 000倍的Na＋，1 000倍的Mg2＋，100倍的Zn2＋，8倍的Ca2＋、Cu2＋，10倍的葡萄糖不干擾測定；在楊梅苷－AuNPs體系中，800倍的K＋，200倍的Na＋，400倍的Mg2＋，8倍的Zn2＋，10倍的Ca2＋、Cu2＋、葡萄糖不干擾測定。表明K＋、Na＋和Mg＋對兩個(gè)體系的影響均很小，桑色素－AuNPs體系對Ca2＋、Cu2＋和葡萄糖的耐受量較小，楊梅苷－AuNPs體系對Zn2＋、Ca2＋、Cu2＋和葡萄糖的耐受量較小，但Zn2＋、Ca2＋、Cu2＋和葡萄糖對兩個(gè)體系測定都不產(chǎn)生干擾。因此，方法具有較好的選擇性。

圖6 離子強(qiáng)度對桑色素－AuNPs（a）和楊梅苷－AuNPs（b）體系的共振光散射強(qiáng)度的影響Fig.6 Effect of ion strength on the RLS intensity of morin hydrate－AuNPs systum（a）and myricetin－AuNPs systum（b）

2.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

在最佳的酸度和AuNPs濃度下，依次加入不同濃度的桑色素／楊梅苷進(jìn)行共振光譜掃描，以桑色素／楊梅苷的濃度為橫坐標(biāo)，體系的ΔIRLS為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。

以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限（3S／N），結(jié)果見表1。

表1 線性參數(shù)與檢出限Tab.1 Linearity parameters and detection limits

2.8 合成樣品分析

試驗(yàn)根據(jù)桑色素／楊梅苷－AuNPs體系，利用共振光散射光譜法測定了合成樣品中桑色素／楊梅苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 合成樣品中桑色素和楊梅苷的分析結(jié)果（n＝5）Tab.2 Analytical results of morin hydrate and myricetin in synthetic sample

由表2可知：加標(biāo)回收率在97.2%～103%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.7%～2.5%之間。

本工作利用AuNPs作為RLS探針，研究了桑色素／楊梅苷與AuNPs之間的相互作用，對桑色素／楊梅苷含量進(jìn)行測定。桑色素／楊梅苷與AuNPs以靜電作用相結(jié)合，使RLS強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，并對AuNPs及桑色素／楊梅苷－AuNPs進(jìn)行了TEM表征，佐證了光譜法的結(jié)果。該方法應(yīng)用于合成樣品中測定桑色素／楊梅苷的含量，結(jié)果滿意。

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RLS Determination of Morin Hydrate and Myricetin Using Gold Nanoparticles as Probe

ZHOU Hui－feng，WU Jun，WANG Yu，BI Shu－yun＊
（College of Chemistry，Changchun Normal University，Changchun130032，China）

Gold nanoparticles（AuNPs）were synthesized by seed growth method，and resonance light scattering（RLS）was proposed for determination of morin hydrate and myricetin using AuNPs as probe.Morin hydrate or myricetin was bond to AuNPs by electrostatic interaction，which leaded to an obviously enhancement of RLS intensity.Linear relationships betweenΔIRLSand concentration were obtained in the range of 0.40－10.0μmol·L－1for morin hydrate and 0.10－10.0μmol·L－1for myricetin，with detection limits（3S／N）of 2.98，1.39μg·L－1，respectively

.The proposed method was used in the determination of morin hydrate and myricetin in synthesized samples.Test for recovery was made by standard addition method，giving values of recovery in the range of 97.2%－103%，with RSDs（n＝5）ranged from 0.7%to 2.5%.

Resonance light scattering；Gold nanoparticles；Morin hydrate；Myricetin

O657.3

A

1001－4020（2017）04－0381－06

10.11973／lhjy－h(huán)x201704003

2016－06－02

吉林省教育廳“十二五”科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20140257）；長春師范大學(xué)研究

生教育創(chuàng)新基金項(xiàng)目（cscxy2015002）

周慧鳳（1992－），女，內(nèi)蒙古呼倫貝爾人，碩士研究生，研究方向?yàn)楣庾V分析化學(xué)。

＊通信聯(lián)系人。E－mail：sy＿bi＠sina.com