董淑波，楊漢躍，嚴(yán)拯宇＊

（1.中國藥科大學(xué)理學(xué)院分析化學(xué)教研室，南京210000； 2.江蘇德源藥業(yè)股份有限公司，連云港222000）

高效液相色譜法測定卡格列凈中葡萄糖酸－δ－內(nèi)酯的含量

董淑波1，楊漢躍2，嚴(yán)拯宇1＊

（1.中國藥科大學(xué)理學(xué)院分析化學(xué)教研室，南京210000； 2.江蘇德源藥業(yè)股份有限公司，連云港222000）

提出了高效液相色譜－電霧式檢測器法（HPLC－CAD）測定卡格列凈中葡萄糖酸－δ－內(nèi)酯（GDL）的含量。優(yōu)化的色譜條件如下：Thermo Hypersil Gold Aq色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈（9＋1）混合溶液，流量0.5mL·min－1，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL；電霧式檢測器（CAD）的霧化溫度為50℃，載氣壓力427.5kPa。在上述的色譜條件下，GDL的線性范圍為1.05～22.5mg·L－1，GDL的檢出限（3S／N）為0.32ng。在3個(gè)濃度水平上進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，測得回收率在96.2%～103%之間。供試品加標(biāo)溶液和對(duì)照品溶液在室溫條件下放置12h內(nèi)穩(wěn)定，測定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n＝7）分別為1.8%，1.3%。

高效液相色譜法；電霧式檢測器；葡萄糖酸－δ－內(nèi)酯；卡格列凈

D－葡萄糖酸－δ－內(nèi)酯（簡稱葡萄糖酸內(nèi)酯，GDL）作為凝固劑、酸化劑、改良劑等添加劑廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域［1－3］。近年來，GDL又被作為醫(yī)藥中間體廣泛應(yīng)用于鈉－葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體－2（SGLT－2）抑制劑的合成過程中，如強(qiáng)生制藥公司的Invokana?（卡格列凈，Canagliflozin）、阿斯利康和百時(shí)美施貴寶公司的Farxiga?（達(dá)格列凈，Dapagliflozin）以及勃林格殷格翰制藥公司和禮來公司的Jardiance?（恩格列凈，Empagliflozin）［46］?？ǜ窳袃簦–G）是FDA批準(zhǔn)的首個(gè)SGLT－2抑制劑，用于治療成年患者的II型糖尿病。作為CG合成的中間體，GDL可能會(huì)隨著工藝殘留至產(chǎn)品中，ICH Q3A規(guī)定新原料藥中特定雜質(zhì)的限度一般不得超過0.15%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。為了保證CG臨床使用的安全性和有效性，針對(duì)GDL在CG原料藥中允許殘留的低限度水平，需要建立一種靈敏度高、選擇性好的GDL含量測定的方法。GDL及CG的結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 GDL和CG的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structural formulae of GDL and CG

由于GDL為弱紫外吸收化合物，無法用常規(guī)的紫外檢測器檢測。目前報(bào)道的測定GDL的方法主要有比色法［7］、酸堿滴定法［8］、紫外分光光度法［9－10］、氣相色譜法［11－12］、高效液相色譜示差折光檢測器法［13－15］和離子色譜脈沖安培檢測器法［16］等。比色法、紫外分光光度法、高效液相色譜法、示差折光檢測器法的靈敏度較低，且重復(fù)性不好；酸堿滴定法專屬性較差，測定結(jié)果易受酸性物質(zhì)的干擾；由于GDL對(duì)熱不穩(wěn)定，153℃左右即分解，因此采用氣相色譜法直接測定GDL容易產(chǎn)生降解影響分析結(jié)果，準(zhǔn)確性低；也可將GDL使用甲基硅烷衍生化或者乙?；蟛捎脷庀嗌V法分離測定，但此類方法前處理相對(duì)繁瑣；離子色譜脈沖安培檢測器無法直接檢測GDL，且儀器使用成本較高。

此外，GDL為強(qiáng)極性化合物，其分離相對(duì)困難。目前，對(duì)GDL的分離主要采用氣相色譜法、離子色譜法和高效液相色譜法等。將GDL使用甲基硅烷衍生化或者乙?；戎把苌蟛捎脷庀嗌V法以中等毛細(xì)管柱分離測定，方法前處理相對(duì)繁瑣，且GDL保留時(shí)間較長。離子色譜法主要采用離子交換色譜柱分離GDL的降解產(chǎn)物葡萄糖酸，無法直接測定GDL的含量。目前應(yīng)用最多的是高效液相色譜法，采用糖柱、有機(jī)酸柱、氨基柱或者C18柱分離待測物。強(qiáng)極性化合物在普通C18柱上幾乎不保留，測定時(shí)受溶劑或其他強(qiáng)極性物質(zhì)的干擾較大；有機(jī)酸柱主要用于分離GDL的降解產(chǎn)物葡萄糖酸，且GDL與葡萄糖酸的分離效果并不理想；糖柱、氨基柱等柱流失嚴(yán)重，在使用過程中理論板數(shù)下降較快，使用壽命較短；雖然氨基柱改良為聚合型填充材料，但同規(guī)格的聚合型氨基柱與鍵合型氨基柱相比，柱效明顯下降。鑒于以上原因，開發(fā)一種操作簡便、靈敏度高、選擇性好的快速直接分離測定GDL含量的方法具有重要的意義。

本工作采用高效液相色譜法測定卡格列凈中葡萄糖酸－δ－內(nèi)酯的含量，以極性包埋C18鍵合相的固定相為色譜柱（Thermo Hypersil Gold Aq，250mm×4.6mm，5μm），配合電霧式檢測器（CAD）對(duì)GDL進(jìn)行分離和測定。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo UltiMate 3000型高效液相色譜儀，配HPG 3400SDN型泵（含內(nèi)置脫氣機(jī)），WPS 3000TSL ANALYTICAL型自動(dòng)進(jìn)樣器，TCC 3000RS型柱溫箱；DAD 3000型二極管陣列檢測器；Thermo Corona Ultra型電霧式檢測器（CAD）；Chromeleon 7.2SR4色譜數(shù)據(jù)工作站。

GDL對(duì)照品儲(chǔ)備溶液：150mg·L－1，稱取GDL 15.0mg，用甲醇溶解并定容至100mL。

GDL對(duì)照品溶液：15mg·L－1，移取GDL對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1.00mL，用甲醇定容至10mL。

D－葡萄糖酸－δ－內(nèi)酯（純度不小于99.9%）；乙腈、甲醇為色譜級(jí)；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

Thermo Hypersil Gold Aq色譜柱（250mm× 4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈（9＋1）混合溶液，流量0.5mL·min－1，柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL；CAD的霧化溫度50℃，氮?dú)鈮毫?27.5kPa。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取CG試樣100.0mg置于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，配制成供試品溶液，按儀器工作條件進(jìn)行測定。以15mg·L－1GDL溶液為對(duì)照品，外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測器的選擇

通用型檢測器特別適用于無紫外吸收或弱紫外吸收化合物的檢測。CAD為一款通用型檢測器，其響應(yīng)不依賴于化合物的結(jié)構(gòu)，只要待測物不具有揮發(fā)性，在色譜柱中能被完全分離，都可以通過電霧式檢測器進(jìn)行分析，并且CAD與蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）、示差折光檢測器（RI）等通用型檢測器相比，具備靈敏度高的特點(diǎn)［17－18］。GDL為弱紫外吸收化合物［9］，選用常規(guī)的紫外檢測器無法實(shí)現(xiàn)微量樣品的準(zhǔn)確定量。試驗(yàn)選擇CAD測定GDL的含量。

2.2 色譜柱的選擇

氨基柱是分離糖類化合物較為常用的色譜柱［19－20］，試驗(yàn)首先選擇氨基柱考察GDL和CG的分離情況，以含0.1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸的甲醇溶液為流動(dòng)相，流量為1.0mL·min－1，比較了鍵合型氨基柱（Ultimate XB－NH2，250mm×4.6mm，5μm）和聚合型氨基柱（Shodex Asahipak NH2P－50 40E，250mm×4.6mm，5μm）對(duì)GDL和CG分離的影響，見圖2。

圖2 兩種氨基柱對(duì)GDL和CG分離的影響Fig.2 Effect of 2kinds of amino columns on separation of GDL and CG

由圖2可知：鍵合型氨基柱的柱效高，分離效果好，但基線噪聲較大；聚合型氨基柱柱效低，分離效果差，但基線噪聲較小。

針對(duì)極性化合物的分離，親水作用色譜（HILIC）是分離強(qiáng)極性及親水性化合物的另一色譜模式［21］。此外，通過采用極性或者親水性的封端試劑對(duì)C8或C18表面裸露的硅羥基進(jìn)行封端，這種改性方式與典型的反相色譜柱相比，增大了內(nèi)表面的水浸潤性，且較低的鍵合密度也使得孔內(nèi)疏水性相對(duì)減小，因而允許使用100%水相，增強(qiáng)極性化合物的保留［22－23］?；诓煌|(zhì)色譜柱的選擇性不同，試驗(yàn)考察了Ultimate XB－NH2（250mm×4.6mm，5μm）、Shodex Asahipak NH2P－50 40E（250mm× 4.6mm，5μm）、Welch HILIC Amide（150mm× 4.6mm，3μm）和Thermo Hypersil Gold Aq（250mm×4.6mm，5μm）等4種不同填料固定相的色譜柱對(duì)極性化合物GDL與CG分離的影響，見圖3。

由圖3可知：鍵合型氨基柱XB－NH2和HILIC Amide色譜柱均能滿足分離要求，但鍵合型氨基柱由于柱流失較大，靈敏度較低；HILIC Amide柱分離度較好，但CG裂分為2個(gè)色譜峰，且柱流失也較為嚴(yán)重，影響檢測的靈敏度［24－25］；Gold Aq色譜柱適合分離強(qiáng)極性化合物，在此固定相上，GDL可以與CG實(shí)現(xiàn)基線分離。

對(duì)于極性化合物來說，在典型的C8以及C18色譜柱上，即使有機(jī)相體積分?jǐn)?shù)為5%也不能夠做到有效保留。為實(shí)現(xiàn)極性化合物的有效保留，進(jìn)一步降低有機(jī)相含量至零，則會(huì)引起色譜柱多孔內(nèi)表面以及固定鍵合相的去濕現(xiàn)象（固定相塌陷）。Thermo Hypersil Gold Aq色譜柱對(duì)極性化合物有更好的保留性能和更高的分離度，其鍵合相與分析物之間還存在極性相互作用，因此具有與傳統(tǒng)的C18填料不同的選擇性，可用于分析一些在反相機(jī)制下，在傳統(tǒng)的C18固定相上無保留的極性化合物。綜合考慮，試驗(yàn)選擇Thermo Hypersil Gold Aq色譜柱測定CG中GDL的含量。

2.3 流量對(duì)分離度的影響

采用Thermo Hypersil Gold Aq色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動(dòng)相為乙腈（9＋1）混合溶液，試驗(yàn)考察了流量分別為0.5，1.0mL· min－1時(shí)對(duì)GDL和CG分離度的影響，見圖4。

由圖4可知：流量為0.5mL·min－1時(shí)GDL和CG的峰較寬。在流量分別為1.0，0.5mL·min－1時(shí)，GDL和CG的分離度分別為2.68，2.21。根據(jù)VanDeernter方程式：

式中：H為塔板高度；A，B及C為3個(gè)常數(shù)，其單位分別為cm，cm·s－1，s；u為載氣的線速率，cm·。

在高流量時(shí)（u＞u），線速率u越大，Cu越大，B／u越小，這時(shí)Cu項(xiàng)起主導(dǎo)作用，u增加，H增加，柱效降低［26］。VanDeernter認(rèn)為線速率在0.1cm·s－1左右時(shí)，H最小，柱效最高。根據(jù)公式u＝20F／3πD2，對(duì)于粒徑大于3μm的色譜柱，在線速率為0.1cm·s－1時(shí)，內(nèi)徑D為4.6mm的色譜柱，對(duì)應(yīng)的流動(dòng)相的最佳流量F為1.0mL· min－1。在流量為1.0mL·min－1時(shí)，GDL和CG的分離度好，但GDL的出峰較早，容易受溶劑及其他強(qiáng)極性物質(zhì)的干擾；在流量為0.5mL·min－1時(shí)，GDL和CG的分離度稍低，但仍能滿足分離要求，綜合考慮分離度和保留時(shí)間，試驗(yàn)選擇流量為0.5mL·min－1。

圖3 GDL與CG在不同色譜柱上的色譜圖Fig.3 Chromatograms of GDL and CG on different columns

圖4 不同流量對(duì)GDL和CG分離度的影響Fig.4 Effect of different flow rates on resolution between GDL and CG

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

將150mg·L－1的GDL對(duì)照品儲(chǔ)備溶液用甲醇逐級(jí)稀釋配制成質(zhì)量濃度分別為1.05，7.50，12.0，15.0，22.5mg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，以GDL的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明：GDL的質(zhì)量濃度在1.05～22.5mg·L－1內(nèi)呈線性，線性回歸方程為A＝10.462ρ＋10.25，相關(guān)系數(shù)為0.999 5。

以3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限（3S／N）為0.32ng，相當(dāng)于0.000 3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）的供試品質(zhì)量；以10倍信噪比計(jì)算測定下限（10S／N）為1.05ng，相當(dāng)于0.001%的供試品質(zhì)量。

2.5 精密度與回收試驗(yàn)

稱取陰性樣品100.0mg共9份，分別加入GDL 1.05，148.35，298.76μg各3份，用甲醇溶解并稀釋配制成低、中、高3個(gè)濃度水平的溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

稱取CG試樣100.0mg共6份，分別加入GDL對(duì)照品儲(chǔ)備溶液1.00mL，用甲醇溶解并稀釋至10mL，搖勻，即得供試品加標(biāo)溶液。外標(biāo)法定量，計(jì)算測定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，n＝6）為2.2%；以不同分析人員、不同儀器重復(fù)測定，計(jì)算RSD為4.7%。結(jié)果表明方法的精密度較好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將對(duì)照品溶液和供試品加標(biāo)溶液于室溫下放置0，1，2，4，6，8，12h后分別進(jìn)樣，考查方法的穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。

表1 回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of test for recovery

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝7）Tab.2 Results of test for stability

由表2可知：溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.7 樣品分析

按試驗(yàn)方法對(duì)大批量生產(chǎn)的3批CG樣品中的GDL含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明，3批樣品中均未檢出GDL殘留。

本工作采用帶CAD檢測器的高效液相色譜法快速測定GDL含量。方法具備操作簡單、靈敏度高、選擇性好的特點(diǎn)，樣品無需衍生化即可直接測定CG中GDL的含量。

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HPLC Determination of Glucono－δ－Lactone in Canagliflozin

D
ONG Shu－bo1，YANG Han－yue2，YAN Zheng－yu1＊
（1.Teaching and Research Section of Analytical Chemistry，College of Science，China Pharmaceutical University，Nanjing210000，China；2.Jiangsu Deyuan Pharm.Co.，Ltd.，Lianyungang222000，China）

A method for determination of Glucono－δ－Lactone（GDL）in Canagliflozin was proposed by HPLC coupled with charged aerosol detection（HPLC－CAD）.The optimized chromatographic conditions were as follows：①Thermo Hypersil Gold Aq column（250mm×4.6mm，5μm）was used as stationary phase；②the mobile phase was a mixture of acetonitrile－water（9＋1）solution with a flow rate of 0.5mL·min－1；③column temperature was 30℃；④the injection volume was 10μL；⑤the nebulization temperature of CAD was set at 50℃，and pressure of carrier gas was 427.5kPa.Under above chromatographic conditions，linearity range for GDL in mass concentration found was 1.05－22.5mg·L－1，and the detection limit（3S／N）found was 0.32ng.Test for recovery was made by standard addition method at 3concentration levels，giving results in the range of 96.2%－103%.The sample solution and reference solution were stable for 12hat room temperature，and RSDs（n＝7）found were 1.8%and 1.3%，respectively.

HPLC；Charged aerosol detection；Glucono－δ－Lactone；Canagliflozin

O652.63

A

1001－4020（2017）04－0387－06

10.11973／lhjy－h(huán)x201704004

2016－05－16

董淑波（1984－），男，江蘇連云港人，博士研究生，主要從事藥物分析研究工作。

＊通信聯(lián)系人。E－mail：yanzhengyujiang＠sina.com