黃天帶 方永軍 暢姣 陳濤 辛士超 Naychi Koko 黃華孫 華玉偉

摘 要 橡膠樹轉(zhuǎn)基因過程篩選效率低阻礙了轉(zhuǎn)基因研究快速發(fā)展?；ㄇ嗨乩鄯e產(chǎn)生的紫紅色肉眼直接可辨，是一種簡單、安全的可視化篩選標(biāo)記。為利用橡膠樹花青素作為轉(zhuǎn)基因篩選標(biāo)記，本文首先以R2R3-MYB保守結(jié)構(gòu)域（R2、R3）為探針調(diào)取橡膠樹R2R3-MYB，并與擬南芥等其他物種花青素合成相關(guān)的R2R3-MYB進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果顯示橡膠樹scaffold0374_923317和Scaffold0598_393375與其他物種已功能驗(yàn)證的花青素合成調(diào)控R2R3-MYB聚到同一亞類。隨后從古銅期葉片中克隆到scaffold0374_923317基因，并將其命名為HbAn1。序列分析表明，HbAn1蛋白具有R2R3-MYB蛋白的典型結(jié)構(gòu)：R2R3結(jié)構(gòu)域及bHLH互作結(jié)構(gòu)域。定量表達(dá)分析表明HbAn1在古銅期葉片及暗培養(yǎng)莖稈中高水平表達(dá)，在其他時期葉片及光照培養(yǎng)莖稈中表達(dá)水平很低，與不同組織花青素含量正相關(guān)。最后，在煙草中組成型過表達(dá)HbAn1，使煙草葉片、花瓣、花托、花絲等組織大量累積花青素，定量分析表明其激活了這些組織后期花青素合成酶基因NtDFR， NtLDOX， NtUFGT。本文首次獲得橡膠樹花青素累積相關(guān)的正調(diào)控因子R2R3-MYB（HbAn1），這為花青素作為橡膠樹轉(zhuǎn)基因可視化篩選標(biāo)記提供了基因資源。

關(guān)鍵詞 橡膠樹；花青素；可視化篩選標(biāo)記；R2R3-MYB；結(jié)構(gòu)域

中圖分類號 S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract The low screening efficiency for the positive embryo of rubber trees hinders the development of transgenic research in Hevea. Red purple from anthocyanin， which can be detected by naked eyes， is a simple and safe visual marker. In order to take anthocyanin as the selective marker to improve the screening efficiency for the positive embryo of rubber trees， R2R3-MYB of rubber trees was cloned based on the conserved domain of R2R3-MYB， and the phylogenetic relationship with the anthocyanin-related R2R3-MYB of Arabidopsis thaliana and other species was analyzed， Results showed that scaffold 0374_923317 and Scaffold 0598_393375 were classified in the same sub-group with other known anthocyanin-related R2R3-MYB regulators. Then scaffold0374_923317 isolated from the bronze leaf， and named as HbAn1， had the typical conserved R2R3 and bHLH interaction domain. Quantitative expression analysis revealed that the expression of HbAn1 decreased gradually with the development of rubber leaves， which was coincided with the anthocyanin accumulation contents of rubber leaves. The expression of HbAn1 was also coincided with green and red stems， indicating that the expression of HbAn1 was positively correlated with rubber tree anthocyanin accumulation. Finally， in constitutive overexpression HbAn1 tobacco， the anthocyanin accumulation increased extremely in tobacco leaves， petals， filaments and receptacles caused by activating the late flavonoid pathway genes NtDFR， NtLDOX， NtUFGT. In this paper， for the first time， R2R3-MYB positively regulating anthocyanin accumulation in H. brasiliensis was isolated， which would provide a gene resource for the visual selection marker of H. brasiliensis transformation.

Key words Hevea brasiliensis； anthocyanin； visual selection marker； R2R3-MYB； domain

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.015

1994年，馬來西亞的Arokiaraj等[1]使用基因槍法轉(zhuǎn)化橡膠樹花藥愈傷組織，在世界上首次獲得2株橡膠樹轉(zhuǎn)基因植株。隨后，Jayashree等[2]、Leclercq等[3]、Sunderasan等[4]通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將功能基因橡膠樹超氧化物歧化酶基因（HbSOD）、銅鋅超氧化物歧化酶基因（HbCuZnSOD）和人心鈉素基因（HANF）導(dǎo)入橡膠樹。我國黃天帶等[5]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)花藥愈傷組織獲得11株轉(zhuǎn)基因橡膠樹，隨后，Huang等[6]以次生胚為侵染受體，轉(zhuǎn)化效率提高到4.06%。

然而，到目前為止，橡膠樹均以nptII為篩選標(biāo)記，gus或gfp為報告基因，篩選效率低、準(zhǔn)確性差。以50 mg/L卡那霉素作為選擇壓，抗性胚狀體GUS陽性率僅為1.9%[6]；以100 mg/L巴龍霉素作為選擇壓，抗性愈傷GUS陽性率僅為17.9%[7]；將卡那霉素濃度提高到300 mg/L，抗性愈傷GUS陽性率也僅為4%[2]。Leclercq等[8]試圖利用gfp在早期篩選出陽性愈傷組織，提高篩選效率，然而，24塊GFP陽性愈傷團(tuán)經(jīng)過7次繼代增殖及巴龍霉素篩選后，累計為7 510個愈傷團(tuán)，最終僅篩選出12個陽性愈傷系（0.2%），因此，由于GFP檢測需要依賴特殊儀器，且熒光淬滅快，未能提高篩選效率及準(zhǔn)確率。而GUS需要添加昂貴底物，且為破壞性檢測，不能實(shí)現(xiàn)活體實(shí)時監(jiān)測。

花青素是一種肉眼直接可辨、簡單、安全的篩選標(biāo)記，通常呈紅色或紫紅色，作為可視化篩選標(biāo)記，已成功應(yīng)用于玉米、煙草、西紅柿、蘋果、葡萄轉(zhuǎn)基因研究[9-13]及病毒侵染示蹤[14]、硼元素缺乏實(shí)時監(jiān)測[15]，無需專用設(shè)備或化學(xué)試劑，對材料無破壞性。

橡膠樹古銅期葉片以及暗培養(yǎng)的幼嫩植株莖稈均為紫紅色，同時，橡膠樹胚狀體受茉莉酸誘導(dǎo)時從白色變?yōu)樽霞t色，這些組織的顏色均由花青素——矢車菊素累積造成[16-18]。植物花青素合成主要由R2R3-MYB、bHLH和WD40三類轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成MBW（MYB-bHLH-WD40）復(fù)合體調(diào)控[19-20]，其中R2R3-MYB直接激活結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[21-22]，是調(diào)控花青素合成的關(guān)鍵因子，其具有2個高度保守的、可結(jié)合DNA的MYB結(jié)構(gòu)域（R2、R3結(jié)構(gòu)域），且R3結(jié)構(gòu)域內(nèi)通常含有一個與bHLH互作的[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R基序[23]。

本研究利用植物花青素合成R2R3-MYB調(diào)控基因功能和結(jié)構(gòu)保守性，首先通過生物信息學(xué)調(diào)取橡膠樹花青素合成相關(guān)的R2R3-MYB，隨后，克隆了橡膠樹花青素合成相關(guān)的R2R3-MYB（HbAn1），并通過組織定量表達(dá)分析和煙草過表達(dá)證明其正調(diào)控花青素合成，為利用花青素作為橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化可視化篩選標(biāo)記提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

巴西橡膠樹熱研7-33-97古銅期、淡綠期、變色期、穩(wěn)定期等4個發(fā)育時期的葉片以及黑暗和光照培養(yǎng)下幼苗嫩莖，作為橡膠樹花青素合成調(diào)控基因克隆及其表達(dá)分析的研究材料。

1.2 方法

1.2.1 利用生物信息學(xué)篩選橡膠樹花青素合成R2R3-MYB蛋白 以R2R3-MYB保守結(jié)構(gòu)域（R2、R3）為探針，從橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫中調(diào)取R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子，隨后，從NCBI中調(diào)取擬南芥等植物已驗(yàn)證功能的控制花青素合成的R2R3-MYB，利用clustal omega（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析，篩選與已驗(yàn)證功能的花青素合成調(diào)控基因在同一進(jìn)化分支的橡膠樹R2R3-MYB。

1.2.2 克隆與橡膠樹花青素合成調(diào)控相關(guān)R2R3-MYB蛋白基因 依據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果，調(diào)取與已驗(yàn)證功能的其他物種花青素合成調(diào)控基因在同一進(jìn)化分支的橡膠樹R2R3-MYB蛋白的cDNA序列，設(shè)計特異擴(kuò)增引物（正向引物：5′ GGCTAGCTTCA

TCATATATGGAAGGC，反向引物：GGTGGTGTAA

AGCTTAAAACATCTCATCG），以古銅期葉片cDNA為模板，用Takara的Primer STAR MAX進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，用OMEGA公司的Gel Extraction kit（100）凝膠回收試劑盒進(jìn)行目的片段回收測序。

1.2.3 HbAn1在橡膠樹不同花青素含量組織表達(dá)分析 以古銅期、變色期、淡綠期和穩(wěn)定期等4個發(fā)育時期葉片、暗培養(yǎng)和光培養(yǎng)體胚植株嫩莖cDNA為模板，Premix Ex Taq為反應(yīng)酶，熒光定量PCR反應(yīng)在Light Cycler @2.0熒光定量PCR儀中進(jìn)行（Roche公司）。熒光定量引物見表1。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min。反應(yīng)體系為10 μL，其中5 μL 2×Premix Ex Taq，0.25 μL引物（10 μmoL），0.5 μL cDNA模板。反應(yīng)結(jié)果使用Light Cycler Software 4.05軟件進(jìn)行分析。以RH8作為內(nèi)參基因，標(biāo)準(zhǔn)品cDNA和待測樣品均設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.4 HbAn1在煙草中過表達(dá)分析 將HbAn1克隆到pCAMBIA2301中，以CaMv35S作為啟動子，Nos作為終止子，然后，轉(zhuǎn)化到GV3101中用于侵染煙草，侵染方法及培養(yǎng)基參照Pattanaik等[24]。待紫紅色抗性芽長至2 cm左右大小時，剪下，轉(zhuǎn)入篩選生根培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)其生根，生根后再移栽到溫室。

以轉(zhuǎn)基因煙草葉片、花瓣等組織的cDNA為模板，通過熒光定量PCR，對煙草花青素合成調(diào)控基因NtAn1（bHLH）和NtAn2（MYB）及結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行表達(dá)分析，確定橡膠樹轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)對煙草花青素合成基因調(diào)控作用，除了退火溫度外，反應(yīng)條件及反應(yīng)體系與1.2.3相同，以煙草NtTub基因?yàn)閮?nèi)參。引物序列見表1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

熒光定量結(jié)果采用2-ΔΔCT方法分析，用SAS軟件（V9.0）進(jìn)行顯著性分析，α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 控制橡膠樹花青素合成R2R3-MYB生物信息學(xué)分析結(jié)果

對橡膠樹全基因組掃描R2R3-MYB，共獲得177個R2R3-MYB，然后，從NCBI下載擬南芥AtPAP2（AT1G66390.1）、矮牽牛PhAN2（AB982128.1）、煙草NtAN2（FJ472647.1）、金魚草AmROSEA1（DQ275529.1）、金魚草AmROSEA2（DQ275530.1）、金魚草AmVENOSA（DQ275531.1）、蘋果MdMYB10（DQ267896.1）、馬鈴薯StAN1（AY841127.1）、葡萄VvMYBA1（AB097923.1）、葡萄VvMYBA2（AB097924.1）等10個花青素合成相關(guān)R2R3-MYB，進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，橡膠樹scaffold0374_

923317和Scaffold0598_393375與已鑒定的花青素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在同一進(jìn)化分支（圖1），推測兩者與橡膠樹花青素合成調(diào)控可能相關(guān)，后續(xù)分析以兩者為目標(biāo)基因展開。

2.2 與橡膠樹花青素合成調(diào)控相關(guān)R2R3-MYB克隆及結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果

從橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫中調(diào)取scaffold0374_

923317和Scaffold0598_393375序列，并以此序列為檢索序列，對作者單位葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行檢索，調(diào)取其基因序列，隨后，設(shè)計特異擴(kuò)增PCR引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果獲得與scaffold0374_923317相同的基因序列，測序后其全長為618 bp（圖2），將其命名為HbAn1。Scaffold0598_393375未擴(kuò)增到，推測可能該Scaffold為拼接序列。

與擬南芥AtPAP2（AT1G66390.1）、矮牽牛PhAN2（AB982128.1）、煙草NtAN2（FJ472647.1）、金魚草AmROSEA1（DQ275529.1）、金魚草AmROSEA2（DQ275530.1）、金魚草AmVENOSA（DQ275531.1）、蘋果MdMYB10（DQ267896.1）、馬鈴薯StAn1（AY841127.1）、葡萄VvMYBA1（AB097923.1）、葡萄VvMYBA2（AB097924.1）等10個花青素合成相關(guān)R2R3-MYB蛋白序列比對發(fā)現(xiàn)，HbAn1蛋白不但具有R2R3-MYB兩個保守結(jié)構(gòu)域，同時，在R3結(jié)構(gòu)域中具有與bHLH互作結(jié)構(gòu)域（D/E）LX2（R-K）X3LX6LX3R，此結(jié)構(gòu)域是花青素合成MYB調(diào)控因子的特征結(jié)構(gòu)域，預(yù)示著HbAn1可能是調(diào)控橡膠樹花青素合成關(guān)鍵調(diào)控因子。

2.3 HbAn1在不同花青素含量組織中表達(dá)分析結(jié)果

以古銅期、變色期、淡綠期和穩(wěn)定期等4個時期葉片及暗培養(yǎng)和光照培養(yǎng)嫩莖為材料，進(jìn)行HbAn1熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)，HbAn1隨著葉片老化及花青素逐漸褪去，其表達(dá)量逐漸下降，同時，暗培養(yǎng)嫩莖中HbAn1表達(dá)要高于光照培養(yǎng)嫩莖（圖3），這與花青素含量正相關(guān)，預(yù)示著HbAn1與橡膠樹花青素累積可能具有相關(guān)性。

2.4 HbAn1在煙草中過表達(dá)分析結(jié)果

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片轉(zhuǎn)化，共獲得11個轉(zhuǎn)化植株，本研究挑取3個轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行了后續(xù)研究。在發(fā)育早期，葉片花青素累積隨著植株長大，花青素逐漸褪去，如在植株分化階段以及生根早期，葉片累積大量花青素，而隨著植株葉片增多，新抽出的葉片花青素累積量變少（圖4-A～C）。在植株長大后，其葉片、花瓣、花托、花絲均較非轉(zhuǎn)基因的植株大量累積花青素（圖4-D～F），但是，葉片累積花青素明顯低于花瓣、花托和花絲。

為了檢測HbAn1過表達(dá)對煙草內(nèi)源結(jié)構(gòu)基因表達(dá)影響，對葉片、花瓣、花托和花絲等4個組織表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，在這4個組織中內(nèi)源花青素合成結(jié)構(gòu)基因均上調(diào)表達(dá)，尤其是3個后期結(jié)構(gòu)基因NtDFR、NtANS和NtUFGT表達(dá)量極顯著上調(diào)（圖5）。對于內(nèi)源花青素合成調(diào)控因子，在不同組織中表達(dá)模式與結(jié)構(gòu)基因有所不同，在花瓣中NtAn1（bHLH）和NtAn2（MYB） 有所下調(diào)，在花托和花絲中NtAn1和NtAn2或NtAn2被上調(diào)，然而，在葉片中NtAn1和NtAn2并沒有發(fā)生顯著改變（圖6）。

3 討論

3.1 獲得橡膠樹花青素合成R2R3-MYB基因HbAn1，為橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化可視化篩選標(biāo)記提供候選基因

以往研究發(fā)現(xiàn)R2R3-MYB蛋白異源表達(dá)后，受體物種不累積花青素或累積組織存在差異[25，29]，主要原因如下：（1）外源調(diào)控因子與受體物種調(diào)控因子不能互作[25]；（2）無法識別、激活受體花青素結(jié)構(gòu)基因啟動子[22]；（3）轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)具有組織特異性[26-27]；（4）受體物種/組織沒有花青素合成調(diào)控因子或/和結(jié)構(gòu)基因[28]。但植物自身的花青素合成調(diào)控基因能激活自身花青素累積[12，26，29]。綜上所述，利用外源MYB基因轉(zhuǎn)化橡膠樹其表型難以預(yù)期，而物種自身轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)則能有效提高該物種花青素累積量，因此需要克隆橡膠樹自身MYB基因。據(jù)我們所知，橡膠樹中未見花青素合成相關(guān)R2R3-MYB基因克隆報道。

本文獲得了1個R2R3-MYB基因，其具有R2R3-MYB蛋白的典型特征：含R2、R3保守結(jié)構(gòu)域，且R3結(jié)構(gòu)域具有與bHLH蛋白互作結(jié)構(gòu)域（圖2），其表達(dá)模式與橡膠樹花青素累積正相關(guān)（圖3），其通過與煙草內(nèi)源花青素合成調(diào)控因子互作（圖5）且/或促進(jìn)煙草花青素合成結(jié)構(gòu)基因尤其是后期基因表達(dá)量提高（圖6）正調(diào)控?zé)煵莼ㄇ嗨睾铣桑▓D4），以上證據(jù)表明本研究克隆到了橡膠樹正調(diào)控花青素合成R2R3-MYB基因，我們將其命名為HbAn1，為橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化可視化篩選標(biāo)記提供候選基因。

3.2 HbAn1可以作為煙草轉(zhuǎn)基因可視化篩選標(biāo)記

由于其高再生能力，煙草常作為植物基因功能驗(yàn)證的模式植物，為了在大量的非轉(zhuǎn)化細(xì)胞中篩選出陽性轉(zhuǎn)化子，通常通過抗生素加gus基因的方式。篩選步驟繁瑣、準(zhǔn)確率低。

花青素肉眼可見，將其作為遺傳轉(zhuǎn)化報告基因可實(shí)現(xiàn)實(shí)時活體監(jiān)測，但是其過量表達(dá)影響植物生長甚至致死[13]，是其作為可視化篩選標(biāo)記的最大障礙。過表達(dá)HbAn1煙草，新生小苗葉片為紫紅色（圖4-A、B），隨著植株長大，抽出的新葉為正常綠色（圖4-C）。植株進(jìn)入生殖生長后，其花器官（花瓣、花絲、花托）大量累積花青素（圖5-B、C），但是不影響轉(zhuǎn)基因植株正常結(jié)實(shí)，種子正常萌發(fā)（數(shù)據(jù)未提供）。由此可見，HbAn1可通過紫紅色葉片在煙草轉(zhuǎn)基因早期篩選出陽性芽，并可在花器官形成時進(jìn)一步確認(rèn)轉(zhuǎn)化事件，而不影響轉(zhuǎn)基因植株的營養(yǎng)生長、結(jié)實(shí)及種子萌發(fā)。因此，HbAn1在煙草中的表達(dá)模式使其可直接作為煙草轉(zhuǎn)化的可視化篩選標(biāo)記。

3.3 HbAn1作為橡膠樹轉(zhuǎn)基因可視化篩選標(biāo)記

橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化以nptII作為篩選標(biāo)記，以gus和gfp作為報告基因[2-8]，或假陽性率高，或需要添加昂貴底物且破壞受檢材料，或需要特殊儀器且受本底熒光干擾。因此需要開發(fā)無需添加底物、對材料無破壞性、無需特殊設(shè)備的新型可視化篩選標(biāo)記以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)篩選。

本研究克隆了橡膠樹花青素合成R2R3-MYB正調(diào)控因子HbAn1，其能否作為可視化篩選標(biāo)記基因應(yīng)用于橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化研究的關(guān)鍵是受檢組織是否存在花青素合成途徑。橡膠樹遺傳轉(zhuǎn)化均依賴體胚再生體系，抗性胚是重要的篩選對象[2-6，8]。前期研究表明橡膠樹胚狀體存在花青素合成的完整途徑，且能被茉莉酸調(diào)控[17-18]，因此可進(jìn)一步推斷過表達(dá)HbAn1可激活胚狀體花青素合成結(jié)構(gòu)基因表達(dá)，從而促進(jìn)胚狀體累積花青素，使胚狀體從白色變成紫紅色，實(shí)現(xiàn)肉眼識別轉(zhuǎn)化子。

花青素作為遺傳轉(zhuǎn)化篩選標(biāo)記的最大問題是其過量表達(dá)影響植株再生及生長[13]。因此，篩選表達(dá)量適宜的組織特異型啟動子使花青素僅在子葉累積，從而實(shí)現(xiàn)活體篩選但不影響植株正常生長發(fā)育，是花青素能否作為可視化篩選標(biāo)記應(yīng)用于橡膠樹轉(zhuǎn)基因研究需要解決的問題。

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