毛建 宋珊 賈欽堯 陳紹平 韓美玲 廖俊蕾

慢性阻塞性肺疾病患者外周血淋巴細(xì)胞NLRP3 mRNA的表達(dá)及血清IL-1β、IL-18檢測(cè)的意義

毛建 宋珊 賈欽堯 陳紹平 韓美玲 廖俊蕾

目的 通過對(duì)慢阻肺患者外周血淋巴細(xì)胞NLRP3 mRNA及血清中炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-18的檢測(cè)，探討NLRP3炎癥小體在慢阻肺發(fā)病中的作用。方法 選取60例確診AE慢阻肺患者，根據(jù)有無呼吸衰竭，分為2組，每組30例，急性加重期患者經(jīng)治療癥狀體征好轉(zhuǎn)達(dá)到緩解期水平后作為慢阻肺組，同期門診健康體檢者30例作為健康對(duì)照組。采用ELISA檢測(cè)各個(gè)組血清中IL-1β、IL-18的濃度，采用PCR檢測(cè)各組中NLRP3 mRNA的表達(dá)量。 結(jié)果 AECOPD組和慢阻肺緩解組患者的NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清中IL-1β和IL-18的濃度均顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05); AE慢阻肺組患者的NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清中IL-1β和IL-18的濃度均顯著高于慢阻肺緩解組(P<0.05)；慢阻肺合并呼吸衰竭患者的NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清中IL-1β和IL-18的濃度顯著高于未合并呼吸衰竭患者(P<0.05)；慢阻肺患者NLRP3 mRNA表達(dá)量與血清中IL-1β、IL-18的濃度呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r分別為0.69和0.70(P<0.05)；IL-1β的濃度與IL-18的濃度呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.65(P<0.05)。結(jié)論 NLRP3和IL-1β、IL-18參與慢阻肺的炎癥反應(yīng)，其濃度升高導(dǎo)致慢阻肺病情嚴(yán)重程度增加。

NRLP3 mRNA；慢阻肺；IL-1β；IL-18

NLRP3(NOD-like Receptor Family, Pyrin Domain Containing 3，NLRP3)是10號(hào)染色體1q44上的NLRP3基因編碼的蛋白質(zhì)。NLRP3分子、凋亡相關(guān)微粒蛋白(Apoptosis associated speck-like protein containing ASC)以及半胱天冬酶(caspase-1)共同組成的多聚蛋白復(fù)合物即為NLRP3炎癥小體[1]。近年研究表明[2]，NLRP3與多種炎癥性疾病密切相關(guān)，在炎癥反應(yīng)的急性期，NLRP3表達(dá)量明顯增加，在炎癥反應(yīng)緩解期時(shí)其表達(dá)量又顯著下降。但是NLRP3與慢阻肺的相關(guān)性研究相對(duì)較少，且目前研究結(jié)果不一致，尚沒有定論。有研究顯示[3]，IL-1β、IL-18在慢阻肺患者中的水平升高，是引起慢阻肺病情加重的重要因素。因此有必要進(jìn)一步對(duì)NLRP3 mRNA和IL-1β、IL-18進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)，探索它們?cè)诼璺伟l(fā)生發(fā)展中的作用。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2014年10月至2015年5月于川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院的60例確診AECOPD患者，其中男性31例，女性29例，年齡70.43±7.92歲。AECOPD組根據(jù)有無呼吸衰竭，分為AECOPD合并呼吸衰竭組，其中男性16例，女性14例，年齡70.28±7.85歲。AECOPD未合并呼吸衰竭組，其中男性15例，女性15例，年齡70.76±8.12歲。急性加重期患者經(jīng)治療癥狀體征好轉(zhuǎn)達(dá)到緩解期水平后作為慢阻肺組，同期門診健康體檢者30例作為健康對(duì)照組，其中男女各15例，年齡70.15±7.73歲。所有患者的診斷均符合《2015年GOLD指南》，且近4周無呼吸道感染史，無高血壓、冠心病、心肌病、糖尿病、甲亢等疾病。所有患者均知情同意，各組間一般資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、主要儀器和試劑

人淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)笊锕?，中?，快速熒光定量PCR預(yù)混試劑(天根生化科技有限公司，中國)，實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒(TakaRa公司, JAPAN)，Human IL-18 ELISA Kit(欣博盛生物科技有限公司，中國)，Human IL-1βELISA Kit(欣博盛生物科技有限公司，中國)；7900 RT-PCR儀(ABI公司，美國 )，Jaeger Master Screen肺功能檢測(cè)儀(耶格公司，德國)，Infinite M2000 Pro多功能酶標(biāo)儀(TECAN公司，瑞士)。

三、研究方法

1 設(shè)計(jì)引物

根據(jù)gene bank中的NLRP3和人肌動(dòng)蛋白β-actin序列，由上海生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成PCR引物。NLRP3與β-actin內(nèi)參引物序列(見表1)。

2 熒光定量PCR檢測(cè)NLRP3 mRNA表達(dá) 從外周靜脈血中，分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，提取總RNA，加30 μL無RNA酶水溶解RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，總反應(yīng)體系20 μL，反應(yīng)條件：擴(kuò)增反應(yīng)為95℃預(yù)變性1min；95℃ 5s，60℃ 15s，30次循環(huán)；72℃延伸5min。熔解反應(yīng)為95℃ 15s，60℃ 15s，95℃ 15s。NLRP3 mRNA表達(dá)量計(jì)算：ΔCt=NLRP3Ct值-β-actin Ct值；ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組-對(duì)照組Ct值。2(-ΔΔCt)值表示NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 NLRP3、β-actin基因引物序列及PCR擴(kuò)增長度

3 檢測(cè)血清中IL-1β、IL-18的濃度

采用雙抗體夾心ELISA法，嚴(yán)格按照人IL-1β、人IL-18定量ELISA試劑盒(欣博盛生物科技有限公司，中國)說明書步驟檢測(cè)各組血清中IL-1β、IL-18的濃度。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、AECOPD組和慢阻肺緩解組患者的NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清中IL-1β和IL-18的濃度均顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05); AECOPD組患者的NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清中IL-1β和IL-18的濃度均顯著高于慢阻肺緩解組，P<0.05，(見表2)。

二、慢阻肺組中合并有呼吸衰竭患者的NLRP3 mRNA表達(dá)量和血清中IL-1β和IL-18的濃度顯著高于未合并呼吸衰竭患者，P<0.05，(見表3)。

三、慢阻肺患者NLRP3 mRNA表達(dá)量與血清中IL-1β、IL-18濃度呈正相關(guān)，NLRP3與 IL-1β相關(guān)系數(shù)0.69(P<0.05)；NLRP3與IL-18相關(guān)系數(shù)0.70(P<0.05)；IL-1β與IL-18相關(guān)系數(shù)0.65(P<0.05)。

表2 AECOPD組、慢阻肺緩解組與健康對(duì)照組NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量和血清IL-1β、IL-18濃度

注：與AECOPD組比較，aP<0.05；與慢阻肺緩解組比較，bP<0.05。

表3 AECOPD亞組和健康對(duì)照組NLRP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量和血清IL-1β、IL-18濃度

注：與AECOPD組比較，aP<0.05；與慢阻肺緩解組比較，bP<0.05。

討 論

NLRP3炎癥小體是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，內(nèi)源性和外源性的多種危險(xiǎn)信號(hào)均可激活NLRP3炎癥小體，其活化后形成的多蛋白復(fù)合體可激活半胱天冬酶(caspase-1)，進(jìn)一步加工IL-1β和IL-18的前體，形成并分泌IL-1β、IL-18等前炎癥介質(zhì)，激活下游一系列炎癥反應(yīng)[4-5]。IL-1β、IL-18屬于IL-1家族，由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌。L-1β可激活T淋巴細(xì)胞啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，招募炎癥細(xì)胞至感染部位，引發(fā)炎癥反應(yīng)和組織損傷。IL-18最初從小鼠肝臟提取液中分離得到，被命名為INF-γ誘導(dǎo)因子[6]。近年研究發(fā)現(xiàn)[7]，香煙煙霧暴露、感染及吸入有害氣體等可能通過共同的NLRP3炎癥小體信號(hào)通路引起肺部及全身炎癥反應(yīng)，加快慢阻肺病情發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示：AECOPD組和慢阻肺緩解組中患者的NLRP3 mRNA表達(dá)量和IL-1β和IL-18的濃度均顯著高于健康對(duì)照組(P<0.05)，AECOPD組患者的NLRP3 mRNA表達(dá)量和IL-1β和IL-18的濃度明顯高于慢阻肺緩解組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。推測(cè)NLRP3 mRNA表達(dá)水平在AECOPD組與慢阻肺緩解組之間的差異與病原微生物感染因素相關(guān)。感染是臨床上引起慢阻肺急性加重最常見的誘因，感染引起慢阻肺患者病情急性加重時(shí)，病原微生物通過PAMPs刺激巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，引起NLRP3 mRNA表達(dá)增加。經(jīng)過抗感染治療使癥狀緩解后，病原微生物數(shù)量下降，PAMPs減少，NLRP3 mRNA表達(dá)量亦隨之下降。但是肺部持續(xù)性的炎癥反應(yīng)，引起炎癥小體持續(xù)性活化，導(dǎo)致IL-1β、IL-18濃度進(jìn)一步上升，通過促進(jìn)下游炎癥反應(yīng)，加重患者的臨床癥狀和肺組織的損傷，促進(jìn)慢阻肺病情惡化和疾病進(jìn)展[6,8]。

此外，AECOPD合并呼吸衰竭組患者的NLRP3 mRNA表達(dá)量和IL-1β和IL-18的濃度顯著高于AECOPD未合并呼吸衰竭組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由于合并呼吸衰竭的患者多為長期反復(fù)住院者或體質(zhì)差免疫功能低下者，因此推測(cè)廣譜抗生素的長期使用、免疫功能低下等因素容易引起呼吸道病原微生物的定植以及二重感染的發(fā)生，可通過多種PAMAs活化更多的NLRP3炎癥小體，造成這些患者肺部感染更重，進(jìn)一步證實(shí)NLRP3炎癥小體在慢阻肺的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，同時(shí)也說明IL-1β、IL-18濃度升高不僅促進(jìn)肺部炎癥反應(yīng)，而且與病情嚴(yán)重程度相關(guān)，IL-1β、IL-18濃度升高，患者的癥狀也隨之加重[8-9]。本研究還發(fā)現(xiàn)NLRP3 mRNA表達(dá)水平與IL-1β、IL-18表達(dá)水平呈正相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。這與Rotta[10]等的研究結(jié)果一致。病原微生物感染、香煙煙霧暴露、吸入粉塵及有害氣體等多種危險(xiǎn)因素可通過PAMPs和DAMPs途徑活化NLRP3炎癥小體，進(jìn)一步促進(jìn)下游IL-1β、IL-18等炎癥介質(zhì)的成熟與釋放，共同參與慢阻肺病情的進(jìn)展。本研究結(jié)果進(jìn)一步支持NLRP3和IL-1β、IL-18可能在同一信號(hào)通路上。

綜上所述，NLRP3在慢阻肺的發(fā)病過程中具有重要作用，NLRP3的表達(dá)水平可能作為臨床上評(píng)價(jià)慢阻肺病情的有價(jià)值指標(biāo)之一，進(jìn)一步研究NLRP3 炎癥小體在慢阻肺中的作用，能夠?qū)β璺蔚男滤庨_發(fā)及臨床治療等提供新的思路。

[1] Schroder K,Tschopp J.The Inflammasomes[J].Cell,2010,140(6):821-832.

[2] Dixit VD.Nlrp3 Inflammasome Activation in Type 2 Diabetes: Is It Clinically Relevant?[J]. Diabetes,2012,62(1):22-24.

[3] Hammad DR,Elgazzar AG,Essawy TS,et al.Evaluation of serum interleukin-1 beta as an inflammatory marker in COPD patients[J].Egyptian Journal of Chest Diseases and Tuberculosis,2015,64(2):347-352.

[4] 楊其彬,周京國,青玉鳳,等.痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞NLRP3炎性體mRNA表達(dá)的研究[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2010,14(10):686-689.

[5] 文啟芹,劉俊,明懷志.肺炎支原體肺炎患兒血清 hs-CRP、IL-6、IL-8及肺炎支原體 DNA 檢測(cè)的臨床意義[J].川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2016,31(1):16-18,22.

[6] Imaoka H,Hoshino T,Takei S,et al.Interleukin-18 production and pulmonary function in COPD[J].Eur Respir J,2008,31(2):287-297.

[7] Wong K,Jacobs WR Jr.Critical role for NLRP3 in necrotic death triggered by Mycobacterium tuberculosis[J]. Cell Microbiol,2011,13(9):1371-1384.

[8] Churg A,Zhou S,Wang X,et al.The role of interleukin-1beta in murine cigarette smoke-induced emphysema and small airway remodeling [J].Am J Respir Cell Mol Biol,2009,40(4):482-490.

[9] Costa A,Gupta R,Signorino G,et al.Activation of the NLRP3 Inflammasome by Group B Streptococci[J].J Immunol,2012,188(4):1953-1960.

[10]Rotta DLJ,Rohmann K,Droemann D,et al.Nontypeable Haemophilus Influenzae Infection Upregulates the NLRP3 Inflammasome and Leads to Caspase-1-Dependent Secretion of Interleukin-1β-A Possible Pathway of Exacerbations in COPD[J].PLoS One,2013,8(6):e66818.

Significance of peripheral blood lymphocyte NLRP3 mRNA expression and IL-1β and IL-18 detection in COPD patients

MAOJian,SONGShan,JIAQin-yao,CHENShao-ping,HANMei-ling,LIAOJun-lei

DepartmentofRespiratoryMedicine,theAffiliatedHospitalofChuanbeiMedicalCollege,Nanchong,Sichuan637000,China

Objective To explore the role of NLRP3 inflammasome in the occurrence and development of COPD through the detection of NLRP3 mRNA in peripheral blood lymphocyte and the concentration of IL-1β and IL-18 in plasma of COPD patients. Methods 60 patients with AECOPD were selected and divided into 2 groups according to whether there was no respiratory failure, 30 cases in each group. Patients with acute exacerbation of symptoms and signs after improvement to achieve remission level were taken as the COPD group, and 30 cases of healthy people at the same period were selected as the control group. The concentration of IL-1β and IL-18 was measured by ELISA method and the expression of NLRP3 mRNA was measured by qRT-PCR. Results The level of NLRP3 mRNA and the concentration of IL-1β and IL-18 in plasma of patients with AECOPD or stable COPD was significantly higher than that of the control group (P<0.05). The level of NLRP3 mRNA and the concentration of IL-1β and IL-18 in plasma of the AECOPD group was obviously higher than that of the stable COPD group (P<0.05). The level of NLRP3 mRNA and the concentration of IL-1β and IL-18 in plasma of the respiratory failure group was notably higher than that of the without respiratory failure group (P<0.05). The correlation was positive between the level of NLRP3 mRNA and the concentration of IL-1β and IL-18, and the correlation coefficient r equal to 0.69 and 0.70, respectively (P<0.05). The correlation was positive between the concentration of IL-1β and IL-18 (r=0.65,P<0.05). Conclusion NLRP3 and IL-1β, IL-18 involve in the inflammatory reaction of COPD, and the increase of the concentration can cause a serious increase in the severity of the disease.

NRLP3 mRNA; COPD; IL-1β; IL-18

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.06.026

四川省教育廳基金項(xiàng)目支持(No 16ZB023)

637000 四川 南充，川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科

陳紹平，E-mail：chenshaoping836@163.com

2016-10-24]