繆江林靜洪裴曉林俞冰

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053 2.杭州師范大學(xué)

擬南芥醇腈酶基因在大腸桿菌中的表達(dá)優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)分析

繆江1林靜洪2裴曉林2俞冰1

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053 2.杭州師范大學(xué)

[目的]優(yōu)化重組醇腈酶在大腸桿菌(Escherichia coli)中的表達(dá)工藝，考察其酶學(xué)性質(zhì)。[方法]基于密碼子的偏好性，對(duì)擬南芥(Arabidopsis thaliana)醇腈酶基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，克隆該基因到表達(dá)載體pET-28a(+)上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-HNL-At。采用單因素法優(yōu)化表達(dá)工藝，Ni柱親和層析純化目的蛋白，紫外熒光光度法考察酶學(xué)性質(zhì)。[結(jié)果]通過(guò)IPTG誘導(dǎo)成功實(shí)現(xiàn)來(lái)源于擬南芥醇腈酶基因在大腸桿菌中的重組表達(dá)，對(duì)誘導(dǎo)條件優(yōu)化后，發(fā)酵液中重組酶活力達(dá)到29.3U·mL-1，較未優(yōu)化前提高68%。通過(guò)Ni柱親和層析對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，經(jīng)SDS-PAGE分析重組醇腈酶相對(duì)分子質(zhì)量約為30kDa。通過(guò)酶學(xué)性質(zhì)分析，最適反應(yīng)pH為5，最適反應(yīng)溫度為30℃，比酶活為213.9U·mg-1。[結(jié)論]實(shí)現(xiàn)重組醇腈酶在大腸桿菌中的高效表達(dá)，優(yōu)化工藝簡(jiǎn)單可行，酶學(xué)性質(zhì)表征正確，為進(jìn)一步的酶法制備手性氰醇類化合物奠定基礎(chǔ)。

擬南芥；醇腈酶；大腸桿菌；表達(dá)優(yōu)化；酶學(xué)性質(zhì)

醇腈酶又稱羥氰裂解酶 (Hydroxynitrile Lyases, HNLs)，在自然界中來(lái)源廣泛，能可逆地催化HCN和醛酮類化合物生成手性氰醇化合物[1]。手性氰醇化合物是一類關(guān)鍵的中間體，被廣泛應(yīng)用于常山堿和喜樹堿、抗菌藥甲砜霉素、殺蟲劑擬除蟲菊酯等手性藥物和農(nóng)藥中間體的合成[2-4]。Beate[5]等報(bào)道Prunus amygdalus HNL(PaHNL)催化合成(R)-2,2-二甲基-1-氰基丙二醇，產(chǎn)率100%，對(duì)映體過(guò)量(enantiomeric excess,ee)達(dá)97%以上。Manuel[6]等報(bào)道Hevea brasiliensis HNL(HbHNL)催化合成(S)-1-[2-(二甲胺)-1-(4-甲氧苯基)乙基]環(huán)己醇，其ee達(dá)99%以上。Christoph[7]等報(bào)道Manihot esculenta HNL(MeHNL)催化合成(S) -4-甲氧基苯乙醇腈，ee達(dá)96%。以醇腈酶作為催化劑，合成(R)或(S)型手性氰醇，具有催化效率高、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率和光學(xué)純度高、底物適用范圍廣等特點(diǎn)，受到越來(lái)越多的關(guān)注[8]。

Jennifer[9]等從擬南芥(Arabidopsis thaliana)中發(fā)現(xiàn)一個(gè)新型的醇腈酶，它是α/β水解酶家族的第一個(gè)(R)選擇性的醇腈酶。與HbHNL和MeHNL序列比對(duì)顯示，Arabidopsis thaliana HNL（AtHNL）和前者有70%的序列相似性和45%~47%的序列同源性。Kathrin[10]等報(bào)道AtHNL催化合成(R)苯乙醇腈，產(chǎn)率100%，ee達(dá)98%以上。Danie[11]等報(bào)道AtHNL催化合成(R)-2-氯代苯乙醇腈，產(chǎn)率100%，ee達(dá)99%以上。在自然界中，醇腈酶在植物中的表達(dá)量非常低，需要復(fù)雜的純化工藝才能獲得目的酶蛋白[13]。因此，本文擬通過(guò)基因重組技術(shù)，構(gòu)建來(lái)源于擬南芥其醇腈酶基因的表達(dá)載體，通過(guò)誘導(dǎo)工藝的優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)其在大腸桿菌中的過(guò)量功能表達(dá)。同時(shí)，采用親和層析色譜法純化獲得重組蛋白，對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行系統(tǒng)表征。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 E.coli DH5α，E.coli BL21(DE3)，pET-28a(+)由杭州師范大學(xué)生物催化實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶 BamHI(批號(hào)KB3403BA)、XhoI(批號(hào)：CK2101C)、DNA marker(批號(hào)A1101A)、protein marker(批號(hào)：C2001B)、T4DNA連接酶(批號(hào)：K6601AA)由Takara公司提供；質(zhì)粒和膠回收試劑盒購(gòu)自愛思進(jìn)公司 (批號(hào)：01216KA1)；PCR清潔試劑盒(批號(hào)EP101-01)購(gòu)自北京全式生物技術(shù)有限公司；(D)-扁桃腈(批號(hào)：547YL-FB)購(gòu)自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；其它試劑均為市售分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基配制 LB培養(yǎng)基（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）:胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%，瓊脂粉2%（固體培養(yǎng)基用）；pH 7.0。LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)重組大腸桿菌，使用時(shí)添加卡那霉素終濃度至50μg·mL-1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HNL基因的克隆 基于擬南芥醇腈酶基因序列設(shè)計(jì)引物：上游引物5’-CGGGATCCATGGAACGCAAACATCATTTTGTG-3’(含BamHI位點(diǎn))，下游引物5’-CCGCTCGAGTTACATATAATCTGTAGCAATAGCGCTT-3’(含XhoI位點(diǎn))。PCR反應(yīng)條件為：98℃變性2min；再接著98℃ 10s，58℃ 5s，72℃ 5s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。PCR引物由上海生工合成，PCR產(chǎn)物跑膠驗(yàn)證并切膠回收。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切(BamHI和XhoI)，再與質(zhì)粒pET-28a(+)在22℃連接1h；采用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli DH5α感受態(tài)，在含Kan抗性平板上篩選轉(zhuǎn)化子，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序。經(jīng)測(cè)序鑒定正確后，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)，重組質(zhì)粒命名為pET-28a(+)-HNL-At，菌種保藏至-80℃冰箱。

1.2.3 醇腈酶活力的測(cè)定 醇腈酶可催化(D)-扁桃腈裂解為苯甲醛和氫氰酸，前者在280nm處有很高的吸收峰[14]。測(cè)定醇腈酶酶活力反應(yīng)體系：0.7mL 50mmol· L-1乙酸緩沖液(pH 5.5，酶溶解其中)，0.2mL 50mmol· L-1檸檬酸-磷酸緩沖液(pH 3.5，含67mmol·L-1(D)-扁桃腈)，0.1mL酶液，反應(yīng)中底物終濃度為13.4mmol· mL-1，室溫下反應(yīng)1min，采用紫外分光光度計(jì)(DU730，Beckman)測(cè)定吸光度，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，即ΔA，每個(gè)數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)3次。以不含酶液的反應(yīng)體系為對(duì)照(ΔA′)。酶活定義：1min(D)-扁桃腈經(jīng)醇腈酶催化生成1μmol苯甲醛酶的量定義為1U。

1.2.4 誘導(dǎo)表達(dá)和條件優(yōu)化 將工程菌接種于10mL LB培養(yǎng)基(含Kan抗性)中，37℃，220r/mim震蕩培養(yǎng)12~16h。取培養(yǎng)的菌液，按1%的接種量接種于三角瓶含有100mL LB培養(yǎng)基中，37℃，220r/mim震蕩培養(yǎng)2~3h，至合適的OD600(一般為0.6)，分別對(duì)誘導(dǎo)強(qiáng)度(0.168、0.336、0.504、0.672、0.840、1.008mmol·L-1)，誘導(dǎo)溫度(18℃、22℃、26℃、30℃、33℃、37℃)，誘導(dǎo)時(shí)間(3h、6h、9h、12h、15h)和誘導(dǎo)時(shí)機(jī)(OD6000.3、OD600=0.6、OD600=0.9、OD600=1.2)進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.5 重組HNL的純化 用結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)(20mmol·L-1pH 7.5磷酸鈉緩沖液，500mmol· L-1NaCl，50mmol·L-1咪唑)重懸靜息細(xì)胞，置于冰浴中，采用超聲進(jìn)行細(xì)胞破碎。12000×g離心20min，收集細(xì)胞破壁上清液，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾。采用Ni親和層析柱(Ni-chelating column)進(jìn)行蛋白純化流程：用10倍柱體積Binding Buffer平衡柱子，再將30mL破壁上清液緩緩上樣，上樣完成后停留1h；10倍柱體積Binding Buffer洗去沒有結(jié)合的雜蛋白，流出液留樣；用洗脫液緩沖液(Elution Buffer)(20mmol·L-1pH 7.5磷酸鈉緩沖液，500mmol·L-1NaCl，250mmol·L-1咪唑)收集目的蛋白，流出液留樣。Bradford法測(cè)定蛋白濃度，采用SDS-PAGE分析重組HNL的表達(dá)和純化過(guò)程。

1.2.6 最適pH值 底物 (D)-扁桃腈在pH分別為3.5、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的緩沖溶液中，按酶活測(cè)定方法測(cè)定酶活，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.2.7 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性 純化后的HNL在不同溫度：15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃，測(cè)定最適反應(yīng)溫度，并在30℃、40℃、50℃、60℃下進(jìn)行保溫，每隔30min檢測(cè)剩余酶活。計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.2.8 動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax值測(cè)定 底物(D)-扁桃腈在pH5.5緩沖液下分別配成不同濃度：0.743、0.867、1.040、1.300、1.733、2.600、5.200、10.400μmol·mL-1。在最適反應(yīng)條件下，按酶活測(cè)定方法測(cè)定酶活。做雙倒數(shù)圖，計(jì)算Km和Vmax值。

2 結(jié)果

2.1 重組HNL表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和驗(yàn)證 以質(zhì)粒pET-24a(+)-HNL-At（實(shí)驗(yàn)室保藏）為模板，PCR擴(kuò)增得到特征DNA片段，大小為777bp，與目的HNL基因大小相符，結(jié)果(圖1-A)。與pET28a(+)連接獲得重組HNL表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-HNL-At。測(cè)序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET-28a(+)-HNL-At中HNL基因序列與目的基因序列相似度為100%。表達(dá)質(zhì)粒pET-28a(+)-HNL-At經(jīng)雙酶切驗(yàn)證所示，獲得5329bp和774bp的兩條帶，結(jié)果（圖1-B）。該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)獲得基因工程菌。經(jīng)初步誘導(dǎo)表達(dá)，該基因工程菌顯示出明顯的醇腈酶活力，進(jìn)一步證明重組質(zhì)粒pET-28a(+)-HNL-At的正確性。

圖1 PCR產(chǎn)物的驗(yàn)證，重組質(zhì)粒pET-28a(+)-HNL-At的酶切驗(yàn)證Fig.1 Identification of PCR products,enzyme digestion of recombinant plasmid pET-28a(+)-HNL-At

2.2 工程菌的表達(dá)條件優(yōu)化

2.2.1 誘導(dǎo)強(qiáng)度對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響 取培養(yǎng)的菌液，按1%轉(zhuǎn)接于50mL培養(yǎng)基中，于37℃擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=0.6，誘導(dǎo)溫度為18℃。加異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)終濃度分別至0.168、0.336、0.504、0.672、0.840和1.008mmol·L-1；誘導(dǎo)12h后測(cè)細(xì)胞干重，靜息細(xì)胞經(jīng)超聲波破碎后測(cè)粗酶活，結(jié)果（圖2-A）。IPTG能有效提高外源基因的表達(dá)，IPTG誘導(dǎo)終濃度為0.504mmol·L-1時(shí)，酶活最高。

2.2.2 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響 取培養(yǎng)的菌液，按1%轉(zhuǎn)接于50mL培養(yǎng)基中，于37℃擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=0.6，加IPTG終濃度至0.504mmol·L-1，分別在18℃、22℃、26℃、30℃、33℃，37℃誘導(dǎo)12h。誘導(dǎo)后測(cè)細(xì)胞干重，靜息細(xì)胞經(jīng)超聲波破碎后測(cè)酶活，結(jié)果（圖2-B）。高溫和低溫都不利于醇腈酶可溶表達(dá)，30℃是該酶最適合的誘導(dǎo)溫度。

2.2.3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響 取培養(yǎng)的菌液，按1%轉(zhuǎn)接于50mL培養(yǎng)基中，于37℃擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=0.6，誘導(dǎo)溫度為30℃，IPTG終濃度0.504mmol· L-1，分別誘導(dǎo)3h、6h、9h、12h、15h，誘導(dǎo)完后測(cè)細(xì)胞干重，結(jié)果顯示誘導(dǎo)6h時(shí)酶活最大（2-C）。在誘導(dǎo)前期，酶活隨誘導(dǎo)時(shí)間增加而上升，6h后酶活趨于穩(wěn)定。

2.2.4 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響 取培養(yǎng)的菌液，按1%轉(zhuǎn)接于50mL培養(yǎng)基中，于37℃擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600=0.3、OD600=0.6、OD600=0.9，OD600=1.2時(shí)開始誘導(dǎo)6h，誘導(dǎo)溫度為30℃，IPTG終濃度0.504mmol·L-1誘導(dǎo)完成后測(cè)細(xì)胞干重。由圖2-D可知，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)為OD600=0.9時(shí)，酶活最高。

2.3 HNL蛋白的表達(dá)和純化 按優(yōu)化后的條件，取培養(yǎng)的菌液，按1%轉(zhuǎn)接于600mL培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600=0.9，加IPTG至終濃度為0.504mmol·L-1，30℃誘導(dǎo)6h。4℃收集的菌體，去離子水清洗1~2次，取超聲波破碎后的上清，按1.2.3所述方法測(cè)粗酶活。上清經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾后，按1.2.5所述方法緩慢上樣Ni柱親和層析純化。所得產(chǎn)物經(jīng)脫鹽處理，冷凍干燥得到純化醇腈酶。如圖3所示，SDS-PAGE驗(yàn)證得到1條30kDa左右的條帶，與目的蛋白大小相符合。

圖2 不同誘導(dǎo)條件對(duì)粗酶活的影響Fig.2 Effects of different induction conditions on enzyme activity

圖3 重組醇腈酶SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant Hydroxynitrile lyase

2.4 純化后HNL的最適pH 純化后的HNL的最適pH，結(jié)果(4-A)。測(cè)得HNL最適反應(yīng)pH為5.0，該酶在弱酸中依然有酶活；但是由于底物在中性及弱堿性中存在較強(qiáng)的自分解，故將考察酶的最適反應(yīng)pH及酸堿穩(wěn)定性范圍設(shè)置在pH 3.0~7.0。pH 4.5~ 6.0之間，該酶有較好的活力，pH 5.0時(shí)，HNL比酶活達(dá)到最大。

2.5 純化后HNL的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性 純化后的HNL的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性，結(jié)果（圖4-B）（圖4-C）。在pH5.0時(shí)，測(cè)得不同反應(yīng)溫度下HNL的比酶活大小，最適反應(yīng)溫度為30℃。酶的熱穩(wěn)定較好，30℃、40℃、50℃保溫2.5h，依然有很高的活力，60℃保溫時(shí)，酶活半衰期為1.5h左右，6h后基本喪失活力。該酶在60℃以下，有較好的熱穩(wěn)定性。

2.6 純化后HNL的動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax值為了觀察HNL對(duì)底物的特異性，通過(guò)非線性回歸方程計(jì)算出了HNL的米氏常數(shù) Km值及最大反應(yīng)速率 Vmax，結(jié)果（4-D）。當(dāng)酶活力為最高酶活一半時(shí)所對(duì)應(yīng)的底物濃度為 0.476mmol-1，即 Km值為0.476mmol-1，Vmax為0.245μmol·mL-1·min-1。

圖4 HNL酶學(xué)性質(zhì)表征結(jié)果圖Fig.4 Results of enzymetic properties on HNL

3 討論

據(jù)報(bào)道，大約200種植物含有HNLs活性，主要來(lái)源于高等植物，如橡膠樹、杏樹、木薯和高粱屬植物等[8]。目前，僅純化和表征了18種不同來(lái)源的HNLs蛋白，表現(xiàn)出不同的氨基酸序列和酶學(xué)性質(zhì)[7,15-16]。根據(jù)醇腈酶蛋白是否依賴黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)可分為兩類：氧化還原酶類和α/β水解酶類[8,18]。依賴FAD的HNLs主要來(lái)源于薔薇科梅屬和蘋果屬，李亞科，有PaHNL，PmHNL，PsHNL等。此類HNLs的氨基酸序列和氧化還原酶、Zn2+-依賴醇脫氫酶具有較高的同源度，而且在N-端含有序列高度保守的FAD的結(jié)合域[19]。研究發(fā)現(xiàn)，輔酶FAD并不直接參與氧化還原反應(yīng)，但具有穩(wěn)定酶結(jié)構(gòu)的作用，缺乏輔酶FAD會(huì)引起酶的失活[8]。另一類FAD非依賴HNLs屬于α/β水解酶類，主要分布于亞麻科、禾本科、鐵青樹科、大戟科中，有MeHNL，HbHNL，AtHNL等；其中AtHNL是此類中的(R)型醇腈酶。該類酶活性位點(diǎn)位于蛋白質(zhì)內(nèi)部，通過(guò)側(cè)面非極性殘基的狹窄通道和外面環(huán)境相連接，含有催化三聯(lián)體：Ser80-His235-Asp207(HbHNL)，Ser80-His236-Asp208(MeHNL)和 Ser81-His236-Asp208(AtHNL)，此類醇腈酶遵循親核反應(yīng)機(jī)制，其中絲氨酸使底物氰醇去質(zhì)子化，組氨酸使產(chǎn)物氰根離子質(zhì)子化，從而完成氰醇的水解反應(yīng)[8,20-21]。

手性氰醇中含有羥基和氰基官能團(tuán)，作為手性藥物的重要前體砌塊，可轉(zhuǎn)化為α-羥基酯、α-羥基酸、α-羥基醛、β-羥基酰胺等具有光學(xué)活性化合物，如圖5所示[22-27]。

圖5 氰醇的合成及其在化學(xué)合成中的應(yīng)用Fig.5 Cyanohydrin synthesis and its application in chemical synthesis

為了提高Arabidopsis thaliana醇腈酶基因的活性，選擇質(zhì)粒pET-28a(+)作為構(gòu)建載體，本文研究了該基因在Escherichia coli細(xì)胞中的表達(dá)?；诿艽a子優(yōu)化，通過(guò)克隆Arabidopsis thaliana醇腈酶基因，得到了HNL的編碼基因，其開放閱讀框（open reading frame,ORF）長(zhǎng)777bp，編碼一個(gè)含258個(gè)氨基酸的酶蛋白。另外，在N端加上6×His標(biāo)簽便于分離純化目的蛋白。Ni柱親和層析是實(shí)驗(yàn)室蛋白分離純化的常用方法，具有操作簡(jiǎn)便，高效等特點(diǎn)[28]。Ni2+能與目的蛋白中His-tag特異性結(jié)合，將目的蛋白吸附在鰲合了Ni2+的填料上，而不含His-tag的雜蛋白就會(huì)隨Binding Buffer流出[29]。

在表達(dá)工藝的優(yōu)化中，通過(guò)固定其他因素，依次考察不同誘導(dǎo)強(qiáng)度、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間，誘導(dǎo)時(shí)機(jī)對(duì)HNL蛋白表達(dá)的影響。確定誘導(dǎo)強(qiáng)度和誘導(dǎo)溫度是影響目的蛋白的表達(dá)的主要因素。IPTG與異乳糖的作用相同，對(duì)重組菌表達(dá)有較大影響，考慮到低濃度時(shí)可容蛋白表達(dá)量少，高濃度IPTG可能對(duì)細(xì)胞有毒性，最終選擇0.504mmol·L-1的IPTG終濃度。溫度較低對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)不利，菌體的數(shù)量少導(dǎo)致蛋白表達(dá)少，酶活也相應(yīng)減小。溫度較高有利于菌體生長(zhǎng)，但是合成速度太快，以至于蛋白來(lái)不及正確的折疊，部分蛋白以包涵體的形式出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)主要研究可溶性蛋白的表達(dá)情況，所以誘導(dǎo)溫度選擇為30℃。實(shí)驗(yàn)表明，隨誘導(dǎo)時(shí)間增長(zhǎng)，酶活上升到最大后逐漸穩(wěn)定，可能是誘導(dǎo)進(jìn)入平臺(tái)期，也可能是發(fā)酵液中產(chǎn)生抑制酶表達(dá)的物質(zhì)；從節(jié)約實(shí)驗(yàn)周期考慮，選取6h作為最適的誘導(dǎo)時(shí)間。OD600過(guò)大會(huì)產(chǎn)生菌種老化現(xiàn)象，不利于重組菌的健康生長(zhǎng)和傳代，最終選擇OD600=0.9作為誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。凍干酶粉進(jìn)行酶學(xué)表征，測(cè)得酶最適pH為5，低pH能抑制酶的活性，這可能跟酶活性位點(diǎn)及活性口袋周圍的結(jié)構(gòu)有關(guān)。該酶的最適溫度與熱穩(wěn)定與報(bào)道的其他來(lái)源的醇腈酶較為接近，具有良好的熱穩(wěn)定性。Km和Vmax值測(cè)定，一般在底物濃度較低時(shí)進(jìn)行,酶和底物的匹配程度是影響動(dòng)力學(xué)參數(shù)Km和Vmax值的主要因素之一。不同酶源或不同底物的Km和Vmax值相差較大[8]。

國(guó)內(nèi)外已有許多關(guān)于HNLs的報(bào)道：不同的酶源已經(jīng)實(shí)現(xiàn)在大腸宿主和酵母宿主中表達(dá)，酶學(xué)性質(zhì)相差較大。Jennifer[9]等人從15L培養(yǎng)中，分離得到1.75Kg菌體，經(jīng)測(cè)定AtHNL粗酶活約2.300U·mg-1。Ken-ichi[29]等分離純化得到AtHNL比酶活為99.5U· mg-1。Daniel[30]等對(duì)AtHNL基因在大腸肝菌中進(jìn)行表達(dá)，比酶活達(dá)到227U·mg-1。本研究通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化工藝后，以(D)-扁桃腈為底物得到的上清液酶活最高達(dá)到29.3U·mL-1，較未優(yōu)化前提高68%，比國(guó)外水平有較大提高。另外，粗品中有本底表達(dá)的雜蛋白，也可能含有抑制酶活的物質(zhì)，經(jīng)過(guò)Ni柱親和層析純化得到純度較高的醇腈酶，比酶活可達(dá)到213.9U· mg-1，比國(guó)外水平有提高。該酶的高效表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)的表征，為合成手性氰醇提供了基礎(chǔ)，這也是下一步工作的重點(diǎn)。

References：

[1]褚朝森，韓世清，韋萍.醇腈酶催化合成氰醇的研究進(jìn)展[J].化工與生產(chǎn)技術(shù)，2007,14(6):55-59. CHU Chaosen,HAN Shiqing,WEIPing.Research progress in synthesis of cyanohydrins catalyzed by hydroxynitrile lyases[J].Chemical Production and Technology,2007,14(6):55-59.

[2]Wang J,Wang W,Li W,et al.Asymmetric cyanation of aldehydes,ketones,aldimines,and ketimines catalyzed by a versatile catalystgenerated from cinchona alkaloid, achiral substituted 2,2'-biphenol and tetraisopropyl titanate[J].Chem,2009,15(43):11642-11659.

[3]Adrianus MCH,Richard JBHN,Ruben M,et al.Synthesis of eight 1-deoxynojirimycin isomers from a single chiral cyanohydrin[J].Eur J Org Chem,2012,2012(18): 3437-3446.

[4]Ritzen B,Richelle GJJ,Brocken L,et al.Enzyme and gold catalysis:a new enantioselective entry into funtctionalized 4-hydroxy-2-pyrrolines[J].Synlett,2014,45(28):270-274.

[5]Beate P,Manuela A,Richard G,et al.Screening hydroxynitrile lyases for(R)-pantolactone synthesis[J].J Mol Catal B:Enzym,2008,52-53(1):183-188.

[6]Chavan SP,Pawar KP.Novel process for total synthesis venlafaxine[P].WIPO Patent No.WO2015063791A1.2015-7-5.

[7]Zheng Z,Zi Y,Li Z,et al.A Simple Separation Method for(S)-Hydroxynitrile Lyase from Cassava and Its Application in Asymmetric Cyanohydrination[J].Tetrahedron:Asymmetry,2013,24(8):434-439.

[8]Monica S,Nitya NS,Tek CB.Hydroxynitrile lyases:At the interface of biology and chemistry[J].Enzyme Microb Technol,2005,37(3):279-294.

[9]Jennifer A,Jan VL,Annett M,et al.An R-Selective Hydroxynitrile Lyase from Arabidopsis thaliana with an α/β-Hydrolase Fold[J].Angew Chem Int Ed,2007,46(12): 8679-8681.

[10]Kathrin ES,Daniel O,Benita K,et al.Synthesis of Chiral Cyanohydrins by Recombinant Escherichia coli Cells in a Micro-Aqueous Reaction System[J].Appl Environ Microbiol,2012,78(14):5025-5027.

[11]Daniel O,Monica P,Romano VA.Hydroxynitrile Lyase from Arabidopsis thaliana:Identification of Reaction Parameters for Enantiopure Cyanohydrin Synthesis by Pure and Immobilized Catalyst[J].Adv Synth Catal,2011,353 (13):2399-2408.

[12]Ken-ichi F,Yasuhisa A.Synthesis of (R)-β-nitro alcohols catalyzed by(R)-selective hydroxynitrile lyase from Arabidopsis thaliana in the aqueous-organic biphasic system[J].J Biotechnol,2011,153(3-4):153-159.

[13]Lang LX,Bijay KS,Eric EC.Purification and Characterization of Acetone Cyanohydrin Lyase from Linum usitatissimum[J].Arch Biochem Biophys,1988,263(2):256-263.

[14]Kathrin ES,Benita K,Astrid W,et al.Fusion of a Flavin-Based Fluorescent Protein to Hydroxynitrile Lyase from Arabidopsis thaliana Improves Enzyme Stability[J]. Appl Environ Microbiol,2013,79(15):4727-4733.

[15]Weis R,Poechlauer P,Bona R,Skranc W,et al.Biocatalytic conversion of unnatural substrates by recombinant almond R-HNL isoenzyme 5[J].J Mol Catal B:Enzym, 2004,29(1):211-218.

[16]Gartler G,Kratky C,Gruber K.Structural determinantsofthe enantioselectivity ofthe hydroxynitrile lyase from Hevea brasiliensis[J].J Biotechnol,2007,129(1):87-97.

[17]Andrea H,Meinhard H,Herfried G.Hydroxynitrile lyases:Functions and properties[J].Physiol Plant,1996,98(4): 891-898.

[18]Ingrid D,Karl G,Anton G,et al.The Hydroxynitrile Lyase from Almond:A Lyase that Looks Like an Oxidoreductase[J].Structure,2001,9(9):803-815.

[19]Holt J,Hanefeld U.Enantioselective enzyme-catalyzed synthesis of cyanohydrins[J].Curr Ogr Synth,2009,40(40): 15-37.

[20]Gruber K,Gartler G,Krammer B,et al.Reaction mechanism of hydroxynitrile lyases of the α/β-hydrolase superfamily.The three-dimensional structure of the transient enzyme-substrate complex certifies the crucial role of lys236[J].J Biol Chem,2004,279(19):20501-20510.

[21]Jennifer NA,Nicole S,Thorsten E,et al.Hydroxynitrile Lyases with α/β-Hydrolase Fold:Two Enzymes with Almost Identical 3D Structures but Opposite Enantioselectivities and Different Reaction Mechanisms[J].Chem Bio Chem,2012,13(13):1932-1939.

[22]Tukel S,Yildirim D,Alagoz D.Protein-coated microcrystals of Prunus armeniaca hydoxynitrile lyase for enantioselective synthesis of(R)-mandelonitrile[J].New Biotechnol,2016,33(1):8-19.

[23]Matthew B,Anne B,Ben B,et al.The evolution of a stereoselective synthesis of the C1-C16 fragment of bryostatins[J].Org Biomol Chem,2016,14(40):9650-9681.

[24]Beate P,Zhi BL,Richard G,et al.Efficient Biocatalytic Synthesis of(R)-Pantolactone[J].Adv Synth Catal,2008,350 (13):1943-1948.

[25]Bracco P,Busch H,Von LJ,et al.Enantioselective synthesis of cyanohydrins catalysed byhydroxynitrile lyases-a review[J].Org Biomol Chem,2016,14(27):30-43.

[26]Rajib B,Tridib M,Samik N.Prunus armeniaca hydroxynitrile lyase(ParsHNL)-catalyzed asymmetric synthesis of cyanohydrins from sterically demanding aromatic aldehydes[J].Tetrahedron:Asymmetry,2009,20(13):1526-1530.

[27]Mohammad D,Mizue Y,Kazumi M.S-selective hydroxynitrile lyase from a plantBaliospermum montanum: Molecular characterization of recombinant enzyme[J].J Biotechnol,2011,153(3-4):100-110.

[28]張海燕，楊虹軍，王長(zhǎng)法，等.凝膠過(guò)濾與鎳柱親和純化金葡菌α-溶血素重組蛋白的生物學(xué)特性比較[J].生物工程學(xué)報(bào)，2009，25(2):176-180. ZHANG Haiyan,YANG Hongjun,WANG Changfa,et al. Activity and quality comparison of the engineered protein Staphylococcus aureus α-hemolysin purified with gel filtration chromatography and Ni-NTA[J].Chin J Biotech, 2009,25(2):176-180.

[29]Ken-ichi F,Yasuhisa A.Synthesis of(R)-β-nitro alcohols catalyzed by(R)-selective hydroxynitrile lyase from Arabidopsis thaliana in the aqueous-organic biphasic system [J].J Biotechnol,2011,153(3-4):153-159.

[30]Daniel O,Julia M,Wolfgang W,et al.Tailoring a Stabilized Variant of Hydroxynitrile Lyase from Arabidopsis thaliana[J].Chem Bio Chem,2012,13(6):797-802.

Efficient Expression of Hydroxynitrile Lyase from Arabidopsis Thaliana in Escherichia Coli and Analysis of Recombinant Hydroxynitrile Lyase Enzymetic Proerties

MIAO Jiang1,LIN Jinghong2,PEI Xiaolin2,et al
Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)

[Objective]To optimize the technology of heterologous expression of AtHNL in Escherichia coli,and investigated its enzymetic properties.[Method]Based on the bias of codon,we optimized the codon of HNL gene from Arabidopsis thaliana,and the fragment of HNL gene was amplified by PCR.Using pET-28a(+)as vector,the recombinant plamisd pET-28a(+)-HNL-At was constructed.Optimization of heterologous expression level was enhanced by single factor experiment method,the recombinant protein was purified by Ni-chelating column.Investigated the activity of AtHNL by UV.[Results]Recombinant HNL was successfully expressed in Escherichia coli by IPTG,the maximum activity of AtHNL was reached 29.3U·mL-1in the fermentation broth,promoted to 68%compared with unoptimization.Then,the protein was purified by Ni-chelating column,SDS-PAGE analysis showed that the molecular weight of the AtHNL was 30kDa.The optimal activity was determined at pH 5.0 and 30℃ was 213.9U·mg-1.[Conclusion]Recombinant HNL was expressed highefficiently in Escherichia coli,and the expression technology was simple and feasible.The properties of recombinant HNL were correct,which provided the reliable foundation to further enzymatic preparation of chiral cyanohydrins.

Arabidopsis thaliana;Hydroxynitrile lyase;Escherichia coli;expression optimization;enzymetic properties

R282.71

：A

：1005-5509（2017）05-0408-08

10.16466/j.issn1005-5509.2017.05.015

2016-12-26）

中國(guó)博士后科學(xué)基金(163936)

Fund project:China postdoctoral scientific foundation(163936)

俞冰，E-mail:zjtcmyubing@126.com