李洋洋, 朱成敏, 黃盈盈, 趙沁怡, 黃東平, 徐淼澤, 皮二旭

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310036)

大豆GmMYB130對(duì)GmCHI3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究

李洋洋, 朱成敏, 黃盈盈, 趙沁怡, 黃東平, 徐淼澤, 皮二旭

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,浙江 杭州 310036)

鹽脅迫通常會(huì)引起植物細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物等次級(jí)危害,是限制農(nóng)作物產(chǎn)量的主要逆境之一,從分子水平解析大豆在鹽脅迫中的響應(yīng)機(jī)制可為大豆耐鹽品種的分子育種奠定基礎(chǔ).本研究通過(guò)亞細(xì)胞定位、染色質(zhì)免疫共沉淀、熒光定量PCR等手段,探索大豆耐鹽響應(yīng)因子GmMYB130對(duì)GmCHI3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制.結(jié)果表明,GmMYB130定位于細(xì)胞核中,且能結(jié)合于類(lèi)黃酮合成酶基因GmCHI3的啟動(dòng)子區(qū),從而調(diào)節(jié)GmCHI3的轉(zhuǎn)錄表達(dá).因此,轉(zhuǎn)錄因子GmMYB130可能通過(guò)激活GmCHI3的轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)類(lèi)黃酮物質(zhì)的合成,最終提高大豆耐鹽能力.

大豆；鹽脅迫；GmMYB130；GmCHI3；類(lèi)黃酮合成

土壤鹽漬化嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng),是限制作物產(chǎn)量的主要非生物逆境因子之一[1].研究表明,土壤中鹽脅迫主要通過(guò)Na+對(duì)植物造成損傷,其直接損害體現(xiàn)在兩個(gè)方面：離子毒害與滲透脅迫[2-3].Na+進(jìn)入細(xì)胞后引起過(guò)氧化物的積累,過(guò)量的活性氧化物會(huì)損害蛋白質(zhì)、核酸以及其它大分子的結(jié)構(gòu)與功能,甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡[4].

為抵御鹽脅迫引起的過(guò)氧化物危害,植物在進(jìn)化過(guò)程中形成了一系列清除活性氧的機(jī)制,主要包括酶促和非酶促兩類(lèi)體系.酶促系統(tǒng)包括超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、抗壞血酸過(guò)氧化物酶(Ascorbate peroxidase, APX)等[5],非酶類(lèi)抗氧化劑主要是一些小分子量的有機(jī)物,包括抗壞血酸、谷胱甘肽、甘露醇以及黃酮類(lèi)等[6-8].

類(lèi)黃酮是含多酚結(jié)構(gòu)的次生代謝產(chǎn)物,在植物抵御各種逆境脅迫的響應(yīng)中扮演著非常重要的角色.在黃酮類(lèi)生物合成過(guò)程中,MYB轉(zhuǎn)錄因子起關(guān)鍵調(diào)控作用,可以調(diào)控合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)黃酮類(lèi)物質(zhì)的合成途經(jīng)[9].

黃酮類(lèi)代謝途徑中分枝眾多,有些MYB轉(zhuǎn)錄因子能特異地調(diào)控某一分枝的代謝,也有一些MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控多個(gè)支路的代謝過(guò)程.Stracke等對(duì)擬南芥幼苗中MYB11、MYB12和MYB111的研究發(fā)現(xiàn),這3個(gè)高度同源的MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子均可調(diào)控查爾酮合酶、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)以及黃烷酮3-羥化酶(Flavanone 3-hydroxylase, F3H)等黃酮類(lèi)合成途徑關(guān)鍵酶的表達(dá),且其作用器官分別為根、子葉等[10].Miyake等發(fā)現(xiàn),MYB101通過(guò)調(diào)控查爾酮合酶表達(dá)水平影響黃酮類(lèi)物質(zhì)代謝途徑,進(jìn)而調(diào)節(jié)豆科植物百脈根和大豆的缺氮響應(yīng)[11].可見(jiàn),黃酮類(lèi)代謝途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)通常受MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,負(fù)責(zé)對(duì)多種生物/非生物脅迫信號(hào)的響應(yīng).

本研究確立GmMYB130轉(zhuǎn)錄激活因子角色,并驗(yàn)證其對(duì)下游靶基因GmCHI3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控,為類(lèi)黃酮物質(zhì)主導(dǎo)的植物耐鹽響應(yīng)機(jī)制研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

大豆Union85140種子由中國(guó)農(nóng)科院作物品種資源研究所邱麗娟研究員惠贈(zèng).大豆栽培所用珍珠巖和蛭石購(gòu)于浙江國(guó)美園藝有限公司.微生物培養(yǎng)所用LB培養(yǎng)基購(gòu)于生工生物工程(上海)有限公司.

1.2 方法

1.2.1 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建

首先采用高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase(Takara, code No. R045Q)將GmMYB130的基因組片段從Union85140大豆幼苗根中擴(kuò)增出來(lái).所用引物MYB130OE-F(CATGCCATGGGAAAAACAGCATTAACACAAATAAACTAG)和MYB130OE-R(CATGCCATGGAATGCCACTTATCTAAGTTTAATTTTTAC)涵蓋GmMYB130起始密碼子上游-1.2 kb UTR到終止密碼子.然后,將擴(kuò)增片段連入T載體.經(jīng)SacⅠ和KpnⅠ雙酶切將GmMYB130基因構(gòu)入改造后的pDL28載體(含雙HA標(biāo)簽和紅色熒光標(biāo)記RFP)[12]的35S啟動(dòng)子3′端即獲得植物表達(dá)載體pDL28-HA-GmMYB130-RFP.

1.2.2 基因沉默載體構(gòu)建

采用Oligoengine Workstation 2軟件篩選GmMYB130基因的沉默片段.設(shè)計(jì)引物(MYB130RNAi-1F:AAGAACCTACTACCATCCACCAAAA; MYB130RNAi-1R:CCTCCCTTCCAGGAGTAACAGG; MYB130RNAi-2F:AAGAACCTACTACCATCCACCAAAA; MYB130RNAi-2R: CCTCCCTTCCAGGAGTAACAGG)從pDL28-HA-GmMYB130-RFP載體中擴(kuò)增這些沉默片段,分別以XbaI/XbaI和KpnI/EcoRⅠ兩對(duì)酶將沉默片段以相反方向構(gòu)入pKANNIBAL載體的PDK intron兩端,即構(gòu)成pKANNIBAL-RNAi-GmMYB130中間載體.然后,用限制酶SalⅠ和SpeⅠ將pKANNIBAL-RNAi-GmMYB130的功能片段切下,并連接到表達(dá)載體pDL28-HA-RFP中,即得GmMYB130基因的植物沉默載體pDL28-HA-RNAiMYB130-RFP.

1.2.3 農(nóng)桿菌k599介導(dǎo)的大豆毛根轉(zhuǎn)化

將20 μg的pDL28-HA-GmMYB130-RFP或pDL28-HA-RNAiMYB130-RFP質(zhì)粒通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化到發(fā)根農(nóng)桿菌K599中,通過(guò)含卡那霉素的LB平板培養(yǎng)基篩選后,采用PCR方式挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化克隆.在30 ℃培養(yǎng)箱中,將該克隆在含卡那霉素的LB平板上劃線(xiàn)培養(yǎng),備用.

同時(shí),將大豆種子在無(wú)菌的濕潤(rùn)濾紙上萌發(fā).待根長(zhǎng)至1 cm長(zhǎng)度,切去下胚軸,保留上胚軸部分.然后,用刀片劃傷子葉節(jié)部位使之與上述劃線(xiàn)培養(yǎng)的K599農(nóng)桿菌接觸.將農(nóng)桿菌侵染過(guò)的大豆子葉置于FM培養(yǎng)基上,在黑暗環(huán)境中培養(yǎng)3～5 d.待子葉節(jié)處不定根達(dá)1 cm長(zhǎng)度時(shí),采用體式熒光顯微鏡篩選顯紅色熒光的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因根進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn).

1.2.4 GmMYB130亞細(xì)胞定位

用Nikon SMZ1270i體視顯微鏡篩選GmMYB130-RFP過(guò)表達(dá)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因根.依照文獻(xiàn)[13]中方法,采用Carl Zeiss LSM 710激光共聚焦顯微鏡分析GmMYB130的亞細(xì)胞定位.

1.2.5 基因表達(dá)量分析

取0.1 g鮮樣于液氮中研磨,用超純RNA提取試劑盒(康為世紀(jì), CW0597S)提取總RNA.取3 μg RNA通過(guò)試劑盒(康為世紀(jì), CW2569M)反轉(zhuǎn)錄成cDNA.將cDNA模板稀釋10倍,進(jìn)行熒光定量PCR分析(BioRad, CFX96).采用Primer Blast在線(xiàn)軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)引物GmCHI3RT-F (CTGCTCCGGTGGAGAAGTTT)和GmCHI3RT-R(GAGGAAGACACCGCACTTGA).

1.2.6 染色質(zhì)免疫共沉淀分析

染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與操作步驟參考Wu等方法[5]. 簡(jiǎn)言之, 將GmMYB130與HA標(biāo)簽融合, 構(gòu)入pDL28載體, 以發(fā)根農(nóng)桿菌k599介導(dǎo)轉(zhuǎn)入大豆根. 然后, 以HA抗體沉淀GmMYB130-HA以及與之結(jié)合的DNA復(fù)合物, 設(shè)計(jì)引物(GmCHI3CHIP-1F:CCCTTAACCATTATCATAGATGG; GmCHI3CHIP-1R:CATAAATAGTTTTGTTGCACGTAG;GmCHI3CHIP-2F:GGGTATATGGCTAAAGGATTTGAC;GmCHI3CHIP-2R:GTATTTCACTATTTTGTAGTCTTATTTGC;GmCHI3CHIP-3F:GTTTATAGATGGGTCGGTACAAT;GmCHI3CHIP-3R:GAATAACAATGTAACATTTAAATGGT), 檢測(cè)該復(fù)合物中是否含有GmCHI3啟動(dòng)子區(qū)特異的MYB識(shí)別基序片段.

2 結(jié)果與分析

大豆中MYB轉(zhuǎn)錄因子家族由Du等依照生物信息學(xué)方法進(jìn)行命名[14].其中,大部分GmMYB尚無(wú)功能方面的研究報(bào)道.因而,GmMYB130是否為一個(gè)真實(shí)的轉(zhuǎn)錄因子仍需試驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐.一般而言,轉(zhuǎn)錄因子必須符合以下3個(gè)條件：1)該蛋白質(zhì)在細(xì)胞核中分布；2)該蛋白質(zhì)可以結(jié)合于下游靶基因的啟動(dòng)子區(qū)；3)該蛋白對(duì)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)有直接調(diào)控作用.

2.1 GmMYB130亞細(xì)胞定位

本研究將GmMYB173與RFP編碼序列融合于植物表達(dá)載體pDL28中,以發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)大豆毛根轉(zhuǎn)化.用體式熒光顯微鏡篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因根(圖1A,1B),然后通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)GmMYB130蛋白的亞細(xì)胞定位.結(jié)果顯示,GmMYB130-RFP融合蛋白主要分布于細(xì)胞核內(nèi)(圖1C).

A: 明場(chǎng)觀測(cè)大豆根; B: 紅色熒光下檢測(cè)大豆陽(yáng)性根; C: GmMYB130蛋白亞細(xì)胞定位檢測(cè).圖1 GmMYB130亞細(xì)胞定位Fig. 1 Subcellular localization for GmMYB130

2.2 GmMYB130對(duì)GmCHI3基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控

GmMYB130和GmCHI3蛋白均為課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)的大豆根部耐鹽關(guān)鍵因子[15].課題組通過(guò)生物信息學(xué)方法發(fā)現(xiàn),GmCHI3基因啟動(dòng)子區(qū)含有3個(gè)MYB識(shí)別基序(圖2A).隨后,通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀法發(fā)現(xiàn),GmMYB130轉(zhuǎn)錄因子可與GmCHI3基因啟動(dòng)子區(qū)P2和P3位點(diǎn)特異性結(jié)合(圖2B).

為進(jìn)一步分析GmMYB130蛋白對(duì)GmCHI3基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平的影響,課題組構(gòu)建了pDL28-GmMYB130RNAi沉默和過(guò)表達(dá)載體,并以發(fā)根農(nóng)桿菌K599介導(dǎo)轉(zhuǎn)入大豆根部,分別獲得GmMYB130敲低(GmMYB130-KD)和過(guò)表達(dá)的大豆根(GmMYB130-OE).通過(guò)熒光定量PCR檢測(cè),發(fā)現(xiàn)GmMYB130-KD根中GmCHI3表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照(EV),而GmMYB130-OE根中GmCHI3表達(dá)量顯著高于EV(圖2C).

綜合上述結(jié)果,轉(zhuǎn)錄因子GmMYB130可以直接調(diào)控類(lèi)黃酮合成途徑中關(guān)鍵基因GmCHI3的轉(zhuǎn)錄表達(dá).

B,C中以轉(zhuǎn)入pDL28-HA空載體(empty vector, EV)的大豆根作為陰性對(duì)照.圖2 轉(zhuǎn)錄因子GmMYB130對(duì)GmCHI3基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控Fig. 2 Transcriptional regulation of GmMYB130 on GmCHI3

3 結(jié)論

MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控類(lèi)黃酮物質(zhì)合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)黃酮類(lèi)物質(zhì)的合成途經(jīng)[9].在前期研究的基礎(chǔ)上,本研究驗(yàn)證了大豆耐鹽相應(yīng)蛋白GmMYB130的轉(zhuǎn)錄因子角色,并且探索了其對(duì)耐鹽基因GmCHI3的正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用.基于上述結(jié)果,課題組推測(cè)大豆耐鹽相應(yīng)關(guān)鍵蛋白GmMYB130和GmCHI3可能通過(guò)調(diào)節(jié)類(lèi)黃酮物質(zhì)合成途徑來(lái)改善大豆耐鹽能力,是對(duì)非生物脅迫信號(hào)的一種響應(yīng)[11].后續(xù)可通過(guò)代謝組學(xué)研究手段深入挖掘大豆耐鹽相關(guān)的小分子物質(zhì),找到一些關(guān)鍵的類(lèi)黃酮物質(zhì),進(jìn)而從代謝水平揭示其耐鹽機(jī)制.

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Transcriptional Regulation of GmMYB130 onGmCHI3

LI Yangyang, ZHU Chengmin, HUANG Yingying, ZHAO Qinyi, HUANG Dongping,XU Miaoze, PI Erxu

(College of Life and Environmental Sciences, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036, China)

Salt stress, usually brings osmotic stress to plant cells, is one of the most abiotic stresses limiting crop productivities. Understanding of the intracellular responses to salinity will favor the molecular breeding of salt tolerant soybean cultivars. In this study, subcellular localization, ChIP and qRT-PCR assays are used to explore the transcriptional regulation ofGmCHI3 by the salt responsive GmMYB130 protein. The results show that GmMYB130 localizes in the nucleus of soybean roots. Interestingly, GmMYB130 bounds to the promoter region of theGmCHI3 gene and activates its transcription. Hence, the transcription factor GmMYB130 is supposed to enhance the soybean tolerance via the regulation of flavonoid synthesis.

soybean; salt stress; GmMYB130;GmCHI3; flavonoid synthesis

10.3969/j.issn.1674-232X.2017.03.008

2016-12-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301053)；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY17C020015)；杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20170432B01)；杭州師范大學(xué)科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)(PF14002004014)；杭州師范大學(xué)"三個(gè)五"重點(diǎn)培育工程；杭州師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放立項(xiàng)項(xiàng)目；"星光計(jì)劃"大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目；"本科生創(chuàng)新能力提升工程"項(xiàng)目；杭州師范大學(xué)第17屆"挑戰(zhàn)杯"大學(xué)生課外科學(xué)技術(shù)作品競(jìng)賽項(xiàng)目.

皮二旭(1983—),男,副教授,博士,主要從事植物逆境響應(yīng)機(jī)制研究.E-mail:20130014@hznu.edu.cn

Q344+.14

A

1674-232X(2017)03-0268-05