張曉藝, 張秀堯, 蔡欣欣, 李瑞芬

(溫州市疾病預(yù)防控制中心, 浙江 溫州 325001)

研究論文

超高效液相色譜-大氣壓化學(xué)電離-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法快速測(cè)定食品中苯并[a]芘

張曉藝, 張秀堯*, 蔡欣欣, 李瑞芬

(溫州市疾病預(yù)防控制中心, 浙江 溫州 325001)

建立了快速檢測(cè)食品中苯并[a]芘的超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS/MS)分析方法。樣品用正己烷提取后,經(jīng)分子印跡固相萃取柱凈化,以甲醇和水作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,在XBridge BEH C18柱上實(shí)現(xiàn)分離,大氣壓化學(xué)電離(APCI)-三重四極桿質(zhì)譜正離子MRM方式檢測(cè),以苯并[a]芘-d12作為內(nèi)標(biāo)的穩(wěn)定同位素稀釋法定量。方法的線性范圍為0.07～50 μg/kg,定量限為0.07 μg/kg。平均加標(biāo)回收率為86%～104%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.3%～14%。該方法靈敏、準(zhǔn)確,適用于食品中苯并[a]芘的測(cè)定,已應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢查。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;大氣壓化學(xué)電離;分子印跡固相萃取;苯并[a]芘;食品

苯并[a]芘(benzo[a]pyrene, BaP)又稱(chēng)3,4-苯并芘,是一種5環(huán)的稠環(huán)芳烴,具有致癌、致畸、致突變性毒性。苯并[a]芘主要存在于生活與工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中的燃燒能源,比如煤、石油以及天然氣等不完全燃燒過(guò)程中所生成的廢氣中,這些廢氣通過(guò)水、大氣和土壤進(jìn)入到糧食、蔬菜、水果、水產(chǎn)品以及肉制品等食品中;同時(shí)食品在煎炸和熏烤等加工過(guò)程中也會(huì)發(fā)生熱裂解形成大量稠環(huán)芳烴,其中苯并[a]芘的含量比較高,特別是在烘烤和煙熏過(guò)程中發(fā)生的糊焦現(xiàn)象時(shí),苯并[a]芘的生成量將會(huì)比普通食品高20倍以上[1-4]。我國(guó)國(guó)標(biāo)GB 2762-2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》規(guī)定谷物及其制品(稻谷、糙米、大米、小麥、小麥粉、玉米、玉米面(渣、片))、肉及肉制品(熏、燒、烤肉類(lèi))和水產(chǎn)動(dòng)物及其制品(熏、烤水產(chǎn)品)中苯并[a]芘的不得超過(guò)5.0 μg/kg,油脂及其制品不得超過(guò)10 μg/kg。歐盟推薦食用油中苯并[a]芘的限量值為2 μg/kg (Regulation 208/2005, EC)。

目前,食品中苯并[a]芘的分析方法主要有高效液相色譜-熒光檢測(cè)法[5,6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7,8]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法等[9,10]。高效液相色譜-熒光檢測(cè)法靈敏、重現(xiàn)性好,是較常用的方法[5,6],但與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法相比定性能力不強(qiáng)、靈敏度不高;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法靈敏度不高,需對(duì)樣品進(jìn)行多倍濃縮,樣品前處理常會(huì)耗費(fèi)較多的有機(jī)溶劑,檢測(cè)周期長(zhǎng)[8]。劉玉蘭等[9]采用液相色譜-光化學(xué)電離-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定食用油脂中的苯并[a]芘,樣品稀釋后直接進(jìn)樣,方法檢出限為1 μg/kg。雖然簡(jiǎn)化了樣品前處理過(guò)程,但容易造成基線漂移,對(duì)色譜柱損害較大,整個(gè)系統(tǒng)易污染,且光化學(xué)電離源非儀器標(biāo)配部件,通用性差,同時(shí)還需1臺(tái)溶劑輸送泵在柱后加入摻雜劑(dopant)甲苯,裝置復(fù)雜。王浩等[10]采用液相色譜-光化學(xué)電離-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定植物油中的苯并[a]芘和4種黃曲霉毒素,樣品經(jīng)凝膠滲透色譜凈化,在去除大分子雜質(zhì)方面效果較好,但有機(jī)溶劑消耗量大、耗時(shí),還存在一定的基質(zhì)抑制效應(yīng),需用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)外標(biāo)法定量。藍(lán)長(zhǎng)波[11]采用液相色譜-電噴霧電離-質(zhì)譜聯(lián)用法,但苯并[a]芘在電噴霧源中難以離子化,靈敏度極低。

分子印跡固相萃取技術(shù)是以分子印跡材料作為固相萃取填料制成分子印跡固相小柱,可選擇性吸附液體樣品中的目標(biāo)化合物,使其與樣品的基體等干擾成分分離,最終達(dá)到凈化和富集的目的;分子印跡固相萃取技術(shù)具有良好的特異性,可以提高分析的準(zhǔn)確度、精密度和靈敏度,已成為近年來(lái)樣品前處理領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)[12]。本研究采用分子印跡固相萃取法進(jìn)行樣品前處理,消除了基質(zhì)效應(yīng),方法選擇性好,使用儀器標(biāo)配的大氣壓化學(xué)電離源,通過(guò)對(duì)色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的高靈敏檢測(cè),以穩(wěn)定同位素稀釋法定量,建立了食品中苯并[a]芘的檢測(cè)方法,檢出限優(yōu)于新國(guó)標(biāo)GB 5009.27-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中苯并[a]芘的測(cè)定》10倍,方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀由ACQUITY UPLC BSM二元溶劑管理系統(tǒng)、ACQUITY UPLC FTN樣品管理系統(tǒng)和ACQUITY UPLC CM-A色譜柱管理系統(tǒng)組成,由Empower 3工作站控制(美國(guó)Waters公司); QTRAP 6500三重四極桿/復(fù)合線性離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)AB SCIEX公司),由Analyst 1.6.2軟件控制;2510超聲波清洗機(jī)(美國(guó)Branson公司); Multi Reax數(shù)顯型多管旋渦混合器(德國(guó)Heidolph公司); 3-30K高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司); N-EVAP氮吹儀(24孔,美國(guó)Organomation公司); Gradient A10 Milli-Q超純水器(法國(guó)Millipore公司)。

甲醇、正己烷、二氯甲烷和乙腈為HPLC級(jí)(德國(guó)Merck公司);分子印跡柱固相萃取柱(500 mg/6 mL,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司);苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(20 μg/mL,農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所)、苯并[a]芘-d12標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(200 μg/mL,北京曼哈格生物科技有限公司),臨用時(shí)稀釋至所需濃度,避光保存。

1份花生油、2份玉米油、1份大豆油、1份茶油、2份烤雞翅、1份烤雞腿、1份烤豬肉、2份烤蝦、1份烤魷魚(yú)絲和3份大米均購(gòu)自當(dāng)?shù)厣虉?chǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 色譜分離條件

分析柱為XBridge BEH C18(75 mm×3.0 mm, 2.5 μm),配套保護(hù)柱VanGuard BEH C18(5 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動(dòng)相A為甲醇,B為水。梯度洗脫程序:0～3.00 min, 68%A～98%A; 3.00～4.50 min, 98%A; 4.50～4.60 min, 98%A～68%A; 4.60～6.00 min, 68%A。流速:1.000 mL/min;柱溫：55 ℃;進(jìn)樣體積：5 μL;乙腈作為清洗溶劑(wash solvent), 50%(v/v)甲醇作為消除溶劑(purge solvent)。

1.2.2 質(zhì)譜條件

大氣壓化學(xué)電離離子源,正離子掃描方式多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。離子化電壓(IS): 5 500 V,離子源溫度(TEM): 600 ℃,放電電流(NC): 3 μA,氣簾氣(CUR): 277 kPa,噴霧氣(GS1): 345 kPa,碰撞氣(CAD): medium。苯并[a]芘定量離子對(duì)為m/z253.2>224.1,定性離子對(duì)為m/z253.2>226.1,去簇電壓(DP)均為120 V,碰撞能量(CE)分別為95和69 eV;苯并[a]芘-d12離子對(duì)為m/z263.2>232.1, DP為120 V, CE為95 eV;峰駐留時(shí)間均為80 ms。

1.3 樣品前處理

樣品前處理在避光條件下進(jìn)行。

1.3.1 提取

油脂及其制品:準(zhǔn)確稱(chēng)取0.500 g試樣,加入25 μL 100 μg/L苯并[a]芘-d12內(nèi)標(biāo)溶液,混勻,再加入5 mL正己烷,旋渦混合溶解,待凈化。

其他食品:取可食部分,均質(zhì)。準(zhǔn)確稱(chēng)取1.00 g,加入50 μL 100 μg/L苯并[a]芘-d12內(nèi)標(biāo)溶液,混勻,再加入5.0 mL正己烷,旋渦混合0.5 min, 40 ℃下超聲提取10 min, 10 000 r/min下離心5 min,移取上清液。殘?jiān)性偌尤?.0 mL正己烷重復(fù)提取一次。合并提取液,待凈化。

1.3.2 凈化

分子印跡柱固相萃取柱依次用5.0 mL二氯甲烷和5.0 mL正己烷活化,上樣,分別各用5.0 mL正己烷淋洗柱子2次,抽干,用5.0 mL二氯甲烷洗脫,洗脫液在40 ℃下氮?dú)獯蹈?油脂及其制品的殘?jiān)屑尤?.25 mL乙腈,其他類(lèi)型食品的殘?jiān)屑尤?.50 mL乙腈,渦旋復(fù)溶0.5 min,過(guò)0.22 μm濾膜,待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

苯并[a]芘屬非極性化合物,易溶于苯、正己烷等非極性有機(jī)溶劑。目前,國(guó)內(nèi)外廣泛采用正己烷作為苯并[a]芘的提取溶劑,我們也選擇正己烷作為提取劑。

食品中苯并[a]芘的樣品預(yù)處理方法主要有固相萃取法[13-16]、QuEChERS法[6]、基質(zhì)分散固相萃取法[17]和凝膠色譜法[8-10,18]等。固相萃取法主要采用弗羅里硅土柱、氧化鋁柱等。國(guó)內(nèi)已有商品化的苯并[a]芘專(zhuān)用固相萃取柱,這些專(zhuān)用柱分為兩類(lèi)。一類(lèi)是按照GB/T 22509-2008 《動(dòng)植物油脂 苯并[a]芘的測(cè)定 反相高效液相色譜法》中規(guī)定的,將適當(dāng)活度的22 g氧化鋁制成固相萃取柱(22 g/60 mL);另一類(lèi)是苯并[a]芘分子印跡固相萃取柱(500 mg/6 mL)。這兩類(lèi)柱都能起到較好的凈化效果,但第一類(lèi)固相萃取柱消耗的溶劑較多,第二類(lèi)固相萃取柱特異性更強(qiáng),溶劑消耗少。戴廷燦等[6]采用QuEChERS法提取,自制乙二胺-N-丙基硅膠(PSA)+中性氧化鋁小柱凈化,測(cè)定蔬菜中的苯并[a]芘,在操作便利和凈化效果上并無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)?；|(zhì)分散固相萃取法需要手工裝柱,煩瑣、耗時(shí),使用C18填料作為吸附分散劑,特異性不強(qiáng),凈化效果不明顯[17]。離線的凝膠色譜法可以去除大分子雜質(zhì),但耗溶劑、耗時(shí);在線的凝膠色譜法多與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀聯(lián)用,需專(zhuān)門(mén)的儀器設(shè)備。所以我們最終選擇苯并[a]芘分子印跡固相萃取法作為樣品凈化方法,10 mL 0.1 μg/L苯并[a]芘的正己烷標(biāo)準(zhǔn)溶液上樣,用10 mL正己烷分2次淋洗,再用5.0 mL二氯甲烷洗脫,苯并[a]芘的絕對(duì)回收率≥95%。選擇玉米油、大米、烤雞腿分別作為油脂及其制品、谷物及其制品、肉及肉制品及水產(chǎn)動(dòng)物及其制品的代表樣品,經(jīng)本法處理后,以苯并[a]芘-d12配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)與溶劑標(biāo)準(zhǔn)比較進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect, ME)評(píng)估。結(jié)果表明以上3種樣品的ME均在90%～100%范圍內(nèi),基質(zhì)效應(yīng)不明顯[19]。為了克服樣品前處理和儀器檢測(cè)過(guò)程中可能存在的誤差,本法采用苯并[a]芘-d12穩(wěn)定同位素作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于苯并[a]芘極性小,在電噴霧離子(ESI)源中不能電離,可在大氣壓化學(xué)電離源中以正離子的方式電離。利用注射泵以7 μL/min的流速分別將2.0 μg/mL的苯并[a]芘和苯并[a]芘-d12標(biāo)準(zhǔn)溶液通過(guò)三通匯合流動(dòng)相(90%(v/v)甲醇水溶液,流速為0.700 mL/min)注入離子源中,在大氣壓化學(xué)電離正離子檢測(cè)方式下對(duì)質(zhì)譜測(cè)定條件進(jìn)行優(yōu)化。Q1掃描時(shí)可見(jiàn)[M+H]+峰,對(duì)準(zhǔn)分子離子峰進(jìn)行子離子掃描,得到碎片離子信息,然后再對(duì)離子源溫度、電暈針?lè)烹婋娏?、去簇電壓、碰撞能量等參?shù)進(jìn)行優(yōu)化,使得分子離子對(duì)信號(hào)達(dá)到最佳。遵循國(guó)際慣例,確證分析需要4個(gè)識(shí)別點(diǎn),故選擇兩對(duì)分子離子對(duì),同時(shí)設(shè)定合適的峰駐留時(shí)間確保色譜峰的采樣點(diǎn)數(shù)為15～20點(diǎn),從而得到較好的定量重復(fù)性。優(yōu)化后的測(cè)定條件見(jiàn)1.2.2節(jié)。

圖 1 3種色譜柱對(duì)苯并[a]芘分離的比較Fig. 1 Comparison of three chromatographic columns on the separation of benzo[a]pyrene (BaP) a. Acquity UPLC BEH C18 (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm); b. Acquity UPLC BEH C8 (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm); c. Acquity UPLC BEH Shield RP (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm).

2.3 超高效液相色譜條件的優(yōu)化

由于采用大氣壓化學(xué)電離法,流動(dòng)相的流速要≥0.6 mL/min,考慮到柱壓的限制,選擇50 mm長(zhǎng)的超高效液相色譜柱。試驗(yàn)了50 mm×2.1 mm規(guī)格的BEH C18(1.7 μm)、Shield RP(1.7 μm)和BEH C8(1.7 μm)超高效液相色譜柱,結(jié)果見(jiàn)圖1。苯并[a]芘在BEH C18柱上的色譜峰形和響應(yīng)值最佳,而在其他色譜柱上嚴(yán)重拖尾,響應(yīng)值低。實(shí)際樣品處理液以乙腈為溶劑,進(jìn)樣5 μL, 50 mm×2.1 mm的BEH C18色譜柱會(huì)有溶劑效應(yīng),導(dǎo)致色譜峰展寬,使苯并[a]芘不能與雜質(zhì)干擾峰達(dá)到基線分離。最終選用75 mm×3.0 mm的BEH C18(2.5 μm)作為分析色譜柱,由于其柱容量較大,不會(huì)出現(xiàn)進(jìn)樣溶劑效應(yīng)。

比較甲醇-水、乙腈-水作為流動(dòng)相的效果,并加入低濃度的甲酸和乙酸銨緩沖鹽等進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示苯并[a]芘在甲醇-水系統(tǒng)中的離子化效果最好,同時(shí)又對(duì)流動(dòng)相梯度洗脫程序和柱溫等條件進(jìn)行優(yōu)化,最終苯并[a]芘的色譜保留時(shí)間適當(dāng),最高柱壓約為55.2 MPa (8 000 psi),適合在超高效液相色譜儀上運(yùn)行,色譜峰形好,能與雜質(zhì)峰達(dá)到基線分離(見(jiàn)圖2)。優(yōu)化的色譜條件見(jiàn)1.2.1節(jié)。

圖 2 玉米油樣品中苯并[a]芘的UPLC-MS/MS MRM色譜圖(0.98 μg/kg)Fig. 2 UPLC-MS/MS MRM chromatograms of benzo[a]pyrene in a corn oil sample (0.98 μg/kg)

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

將苯并[a]芘標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別用乙腈稀釋成0.1、0.5、1.0、5.0、20、100 μg/L(各含有5.0 μg/L苯并[a]芘-d12)的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定,采用MultiQuant定量軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,以定量離子對(duì)與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(y)對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度(x, μg/L)進(jìn)行回歸(權(quán)重取1/x),苯并[a]芘在0.1～100 μg/L范圍內(nèi)的回歸方程為y=0.203 2x+0.000 613,相關(guān)系數(shù)優(yōu)于0.999,呈線性關(guān)系。

在空白樣本中加入低濃度的苯并[a]芘,按本法測(cè)定;倘若無(wú)法找到空白樣品,可加入低濃度的同位素內(nèi)標(biāo)苯并[a]芘-d12。以?xún)蓪?duì)分子離子對(duì)的信噪比均≥3時(shí)對(duì)應(yīng)的樣品濃度作為檢出限(LOD),以信噪比≥10時(shí)的樣品濃度作為定量限(LOQ),測(cè)得檢出限為0.02 μg/kg,定量限為0.07 μg/kg,測(cè)定上限為50 μg/kg。本法測(cè)定范圍涵蓋了大部分樣品中的苯并[a]芘濃度水平,超過(guò)測(cè)定上限的樣品應(yīng)稀釋后再行測(cè)定。

2.5 樣品的加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)

分別取玉米油、烤雞腿和大米樣品進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度試驗(yàn)。樣品中添加不同水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液,混勻,放置過(guò)夜,使待測(cè)成分與樣品基體成分相互作用達(dá)到平衡,再按樣品前處理方法進(jìn)行操作,其回收率和精密度結(jié)果見(jiàn)表1。加標(biāo)回收率在86%～104%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.3%～14%之間,符合痕量分析的要求。

2.6 實(shí)際樣品的分析

檢測(cè)了5份植物油、4份烤肉類(lèi)、2份烤蝦、1份烤魷魚(yú)絲和3份大米共15份市售樣品,均檢出了苯并[a]芘。5份植物油中苯并[a]芘的含量在0.27～1.65 μg/kg之間,3份大米為0.031～0.10 μg/kg,其余均在0.082～0.97 μg/kg范圍內(nèi),均符合國(guó)標(biāo)限量要求。

表 1 食品中苯并[a]芘在不同添加水平下的回收率(n=6)

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3 結(jié)論

本文建立了檢測(cè)食品中苯并[a]芘的超高液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用方法。通過(guò)對(duì)分子印跡固相萃取法的樣品凈化效果和基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)估,證明了樣品凈化方法的有效性。通過(guò)對(duì)色譜分離和質(zhì)譜檢測(cè)等條件的優(yōu)化,得到了較高的檢測(cè)靈敏度。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明本方法靈敏度高、選擇性好、定量準(zhǔn)確和精密度好;應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)取得滿(mǎn)意結(jié)果,適用于食品中苯并[a]芘的檢測(cè)。

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Rapid determination of benzo[a]pyrene in foods by ultra performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry with atmospheric pressure chemical ionization

ZHANG Xiaoyi, ZHANG Xiuyao*, CAI Xinxin, LI Ruifen

(WenzhouMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Wenzhou325001,China)

A method for the determination of benzo[a]pyrene in foods was developed by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) based on isotope dilution and molecularly imprinted solid-phase extraction (MIP-SPE). The target analyte in samples was extracted withn-hexane after spiked with benzo[a]pyrene-d12, and purified using MIP-SPE to eliminate most of the coextracts. The separation of benzo[a]pyrene was carried out on an XBridge BEH C18column with gradient elution of methanol and water. An atmospheric pressure chemical ionization (APCI) interface was used as the ion source and the analysis was performed in the multiple reaction monitoring (MRM) mode. Benzo[a]pyrene levels in the range of 0.07-50 μg/kg were measured accurately by this method, and the limit of quantification (LOQ) was 0.07 μg/kg. The average recoveries were between 86% and 104% with the relative standard deviations within 2.3%-14%. The method was sensitive and accurate, and it has been successfully applied to the measurement of benzo[a]pyrene in food samples.

ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); atmospheric pressure chemical ionization (APCI); molecularly imprinted solid-phase extraction (MIP-SPE); benzo[a]pyrene; food

10.3724/SP.J.1123.2017.02021

2017-02-20

O658

A

1000-8713(2017)06-0608-05

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