隨 瑞 瑞, 沈 咪 娜, 李 成, 趙 鈺, 車 明 月, 張 齊, 叢 麗 娜

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

仿刺參溶菌酶在重組釀酒酵母中的表達(dá)

隨 瑞 瑞, 沈 咪 娜, 李 成, 趙 鈺, 車 明 月, 張 齊, 叢 麗 娜

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院, 遼寧 大連 116034 )

采用釀酒酵母MKP-0表達(dá)仿刺參溶菌酶蛋白(AjLys)。以質(zhì)粒pMD18-AjLys為模板，PCR擴(kuò)增將組氨酸標(biāo)簽His-tag克隆到AjLys基因的N末端，構(gòu)建克隆載體pMD18-His6-AjLys。根據(jù)密碼子偏好性，通過(guò)定點(diǎn)突變對(duì)AjLys蛋白第69、77和95位的3個(gè)精氨酸的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，得到克隆載體pMD18-His6-AjLys (Δ69，77，95)。經(jīng)SpeⅠ/BglⅡ酶切，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pESC-LEU-His6-AjLys和pESC-LEU-His6-AjLys (Δ69，77，95)?；蚬こ叹鷓ESC-LEU-His6-AjLys (Δ69，77，95)/MKP-0通過(guò)半乳糖誘導(dǎo)72 h后，Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明其成功表達(dá)了AjLys蛋白。抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AjLys蛋白對(duì)溶壁微球菌具有一定的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了AjLys的釀酒酵母表達(dá)載體，并可在MKP-0細(xì)胞中表達(dá)了具有活性的AjLys蛋白，為AjLys的生產(chǎn)提供了一種具有可行性的新方法。

仿刺參；溶菌酶；釀酒酵母；密碼子優(yōu)化；表達(dá)

0 引 言

海洋無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)的i型溶菌酶是先天免疫系統(tǒng)中的重要防御因子[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，海參溶菌酶是一種具有糖苷酶活性和廣譜、非酶抑菌活性的i型溶菌酶，能有效抑制其水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中的有害細(xì)菌[3-4]。海參溶菌酶作為安全、無(wú)毒可替代抗生素的綠色生物制品，在海洋水產(chǎn)食品行業(yè)已經(jīng)引起了廣泛關(guān)注[5-6]。

通常，外源蛋白的表達(dá)主要采用原核表達(dá)系統(tǒng)，但是其存在的弊端不可忽視。目前，原核E.coli系統(tǒng)表達(dá)的具有抑菌活性的仿刺參溶菌酶[7-8]，常沉淀成不溶性包涵體聚合物形式，純化步驟煩瑣。谷躍峰等[9]采用真核系統(tǒng)畢赤酵母表達(dá)了溶菌酶AjLys，但是，作為必需的誘導(dǎo)劑甲醇也會(huì)造成重要的毒副殘留。

本實(shí)驗(yàn)將選擇被認(rèn)為是GRAS(generally recognized as safe)生物的釀酒酵母MKP-0細(xì)胞作為AjLys的表達(dá)宿主[10-11]。通過(guò)構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD18-His6-AjLys，將帶有組氨酸標(biāo)簽的AjLys序列嵌入釀酒酵母表達(dá)載體得到pESC-LEU-His6-AjLys。同時(shí)，通過(guò)定點(diǎn)突變，對(duì)AjLys序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，構(gòu)建表達(dá)載體pESC-LEU-His6-AjLys (Δ69，77，95)。以期為以后實(shí)際生產(chǎn)在釀酒酵母中充分發(fā)揮仿刺參溶菌酶的活性提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒

大腸桿菌DH5α、溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)，本實(shí)驗(yàn)室保存；釀酒酵母MKP-0菌株及其表達(dá)載體pESC-LEU均由大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院于放教授饋贈(zèng)；克隆載體pMD18-T，寶生物工程(大連)有限公司；全部引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。

1.1.2 試 劑

限制性核酸內(nèi)切酶、DpnⅠ酶、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、DNA Ladder Markers和Premixed Protein Marker (Broad)試劑，寶生物工程(大連)有限公司；PageRuler Prestained Protein Ladder，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；KOD-Plus-Neo酶，東洋紡(上海)生物科技有限公司；質(zhì)粒提取和瓊脂糖凝膠電泳DNA回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；酵母蛋白質(zhì)快速微量提取試劑盒，北京天恩澤基因科技有限公司；His-tag抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)和超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 His6-AjLys基因擴(kuò)增

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)目的基因序列設(shè)計(jì)上下游引物。在上游引物的5′端引入SpeⅠ酶切位點(diǎn)(粗體標(biāo)記)和6個(gè)組氨酸標(biāo)簽序列(His-tag)(粗線標(biāo)記)。在下游引物3′端引入BglⅡ酶切位點(diǎn)(粗體標(biāo)記)。序列如下：

AjLys上游引物P1：

5′-ACTAGTATGCACCATCATCATCATCATCAAGTTCCTTCTGATTGCCTA-3′；

AjLys下游引物P2：

5′-AGATCTTTAGTTGTTGCTCATGTCAAGACA-3′。

以pMD18-AjLys質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，60 ℃，30 s，72 ℃，1 min，30 cycles；72 ℃，10 min。1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物。

1.2.2 構(gòu)建克隆質(zhì)粒pMD18-T-His6-AjLys

將擴(kuò)增純化后的AjLys片段通過(guò)T載體pMD18-T連接。Amp+抗性篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，菌落PCR驗(yàn)證。反應(yīng)條件：94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，60 ℃，30 s，72 ℃，1 min，30 cycles；72 ℃，10 min。提取質(zhì)粒，電泳檢驗(yàn)后測(cè)序(委托北京六合華大基因科技股份有限公司)。

1.2.3 釀酒酵母密碼子偏好性分析

根據(jù)Codon Usage Analyzer在線密碼子分析軟件，解析出仿刺參溶菌酶基因在釀酒酵母宿主中翻譯時(shí)使用頻率較低的密碼子。

1.2.4 AjLys基因序列的密碼子優(yōu)化

對(duì)AjLys的精氨酸進(jìn)行密碼子優(yōu)化(優(yōu)化后的密碼子用粗體表示)，引物見(jiàn)表1。

表1 密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)的引物

以質(zhì)粒pMD18-T-His6-AjLys為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變。PCR反應(yīng)條件：94 ℃，2 min；98 ℃，10 s，60 ℃，30 s，68 ℃，90 s，30 cycles；68 ℃，7 min。DpnⅠ酶切反應(yīng)體系中的質(zhì)粒模板后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。得到密碼子優(yōu)化后的克隆載體pMD18-T-His6-AjLys (Δ69，77，95)。

1.2.5 構(gòu)建釀酒酵母重組表達(dá)質(zhì)粒

將pMD18-T-His6-AjLys，pMD18-T-His6-AjLys (Δ69，77，95)和釀酒酵母的表達(dá)載體pESC-LEU，用限制性內(nèi)切酶SpeⅠ/BglⅡ酶切，回收純化His6-AjLys、His6-AjLys (Δ69，77，95)片段和載體pESC-LEU線性化大片段。分別將這兩個(gè)目的基因片段和載體連接，篩選具有Amp+抗性的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，再進(jìn)行酶切驗(yàn)證。將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行制備，用于釀酒酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

1.2.6 重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母MKP-0菌株

醋酸鋰法制備釀酒酵母MKP-0感受態(tài)細(xì)胞，42 ℃熱擊轉(zhuǎn)化重組表達(dá)質(zhì)粒pESC-LEU-His6-AjLys和pESC-LEU-His6-AjLys (Δ69，77，95)[12-13]。通過(guò)亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型的SD固體選擇培養(yǎng)基(SD-Leu-)篩選轉(zhuǎn)化子。以P1和P2為引物對(duì)進(jìn)行菌落PCR，電泳鑒定結(jié)果[14]。

1.2.7 AjLys蛋白的表達(dá)及Western Blot檢測(cè)

挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，接種于SD-Leu-基本選擇培養(yǎng)基，30 ℃、230 r/min搖床振蕩活化。搖瓶發(fā)酵48 h后，離心收集菌體。菌體用生理鹽水清洗3次后，轉(zhuǎn)入等體積的同樣誘導(dǎo)培養(yǎng)基，以2%半乳糖誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。誘導(dǎo)72 h后，收集菌體提取蛋白進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。其中，釀酒酵母細(xì)胞通過(guò)酵母蛋白快速微量提取試劑盒進(jìn)行操作，制得蛋白樣品。選取未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的MKP-0作為陰性對(duì)照。

將提取的總蛋白進(jìn)行13.5% SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含10%的脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫?fù)u床上振蕩封閉2 h。加入1∶2 000稀釋的His-tag抗體，室溫?fù)u床上振蕩1 h后，4 ℃平放過(guò)夜反應(yīng)。1∶2 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG (H+L)，室溫?fù)u床上振蕩孵育1 h后，再重復(fù)充分洗膜。加入超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑，暗室下膠片顯影5 min后曝光觀察蛋白表達(dá)情況。

1.2.8 AjLys蛋白抑菌活性分析

抑菌試驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)室之前的研究方法類似[7-8]，用牛津杯法測(cè)定抑菌效果。以溶壁微球菌為指示菌，取50 μL的指示菌液(OD600≈0.05)，均勻涂抹在LB固體培養(yǎng)基上，再放入滅菌的牛津杯。將“1.2.7”中培養(yǎng)了72 h、經(jīng)過(guò)酸洗玻璃珠劇烈振蕩破壁的蛋白樣品上清液，取200 μL加到牛津杯中過(guò)夜培養(yǎng)，檢測(cè)抑菌效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 仿刺參AjLys基因的擴(kuò)增及其克隆載體的構(gòu)建

根據(jù)圖1的實(shí)驗(yàn)方案，以pMD18-T-AjLys質(zhì)粒為模板，進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果如圖2所示，在400 bp附近有明顯的條帶，大小與目的基因(411 bp) 一致。

將His6-AjLys片段與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α細(xì)胞。質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果，AjLys片段與仿刺參溶菌酶的核苷酸序列(GeneBank號(hào)：EF036468.2)完全一致；同時(shí)，在AjLys片段N端加上的SpeⅠ酶切位點(diǎn)、起始密碼子和6個(gè)組氨酸標(biāo)簽序列。結(jié)果表明，成功構(gòu)建了仿刺參AjLys的克隆載體pMD18-T-His6-AjLys。

2.2 密碼子優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究釀酒密碼子偏好性，發(fā)現(xiàn)仿刺參溶菌酶中用于編碼精氨酸蛋白的密碼子CGG在釀酒酵母系統(tǒng)中使用頻率極低(<10%)，將會(huì)嚴(yán)重影響釀酒酵母宿主對(duì)AjLys蛋白的表達(dá)。因此，在不改變氨基酸種類及順序的前提下，對(duì)仿刺參溶菌酶基因編碼精氨酸的CGG密碼子進(jìn)行優(yōu)化(CGG→AGA)。

圖1 重組質(zhì)粒pMD18-T-His6-AjLys的構(gòu)建流程

圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pMD18-T-His6-AjLys的構(gòu)建結(jié)果

Fig.2 Agarose gel electrophoretic profile result of pMD18-T-His6-AjLys

以質(zhì)粒pMD18-T-His6-AjLys為模板，依次對(duì)AjLys蛋白的第69、77和95位精氨酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，測(cè)序檢測(cè)。結(jié)果表明，AjLys序列上的3個(gè)密碼子成功突變，得到密碼子優(yōu)化后的克隆載體pMD18-T-His6-AjLys (Δ69，77，95)。

2.3 仿刺參溶菌酶釀酒酵母重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)圖3的實(shí)驗(yàn)方案，將AjLys原序列及密碼子優(yōu)化后的AjLys (Δ69，77，95)序列分別連入釀酒酵母表達(dá)載體pESC-LEU。菌落PCR和雙酶切驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。電泳結(jié)果如圖4所示，PCR產(chǎn)物在約400 bp處出現(xiàn)明顯條帶(lane 1，2)；質(zhì)粒酶切后得到兩條帶，其中400 bp附近與AjLys大小一致，8 kb附近與pESC-LEU載體一致(lane 3，4)。結(jié)果表明，該溶菌酶重組表達(dá)質(zhì)粒pESC-LEU-His6-AjLys及密碼子優(yōu)化后的重組質(zhì)粒pESC-LEU-His6-AjLys (Δ69，77，95)構(gòu)建成功。

2.4 重組表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選

將重組質(zhì)粒pESC-LEU-His6-AjLys和pESC-LEU-His6-AjLys (Δ69，77，95)分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母MKP-0細(xì)胞篩選轉(zhuǎn)化子，結(jié)果如圖5所示。

電泳結(jié)果如圖6所示，在約400 bp處有一條與AjLys片段大小相符的條帶(lane 1，2)，說(shuō)明成功構(gòu)建仿刺參溶菌酶的釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)MKP-0/pESC-LEU-His6-AjLys(圖5(a))及MKP-0/pESC-LEU-His6-AjLys (Δ69，77，95) (圖5(b))。

圖3 重組質(zhì)粒pESC-LEU-His6-AjLys及密碼子優(yōu)化后的重組質(zhì)粒pESC-LEU-His6-AjLys (Δ69，77，95)的構(gòu)建流程

圖4 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)pESC-LEU-His6-AjLys及其密碼子優(yōu)化 (Δ69，77，95)質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果

Fig.4 Agarose gel electrophoretic profile results of pESC-LEU-His6-AjLys and pESC-LEU- His6-AjLys (Δ69，77，95) after codon optimization

圖5 轉(zhuǎn)化子MKP-0/pESC-LEU-His6-AjLys(a)和MKP-0/pESC-LEU-His6-AjLys (Δ69，77，95)(b)在SD-Leu-平板上的篩選結(jié)果

Fig.5 Screening for transformants MKP-0/pESC- LEU-His6-AjLys (a) and MKP-0/pESC- LEU-His6-AjLys (Δ69，77，95) (b) on SD- Leu-plate

圖6 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)MKP-0/pESC-LEU-His6-AjLys and MKP-0/pESC-LEU-His6-AjLys (Δ69，77，95)轉(zhuǎn)化子

Fig.6 Agarose gel electrophoretic profile of MKP-0/pESC-LEU-His6-AjLys and MKP-0/ pESC-LEU-His6-AjLys (Δ69，77，95) transformants

2.5 Western Blot檢測(cè)AjLys蛋白的表達(dá)

Western Blot檢測(cè)結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看出，MKP-0/pESC-LEU-His6-AjLys (Δ69，77，95)誘導(dǎo)72 h后，在15 ku附近看到明顯的蛋白條帶(lane 3)，說(shuō)明釀酒酵母細(xì)胞MKP-0成功表達(dá)了仿刺參溶菌酶蛋白AjLys。與陰性對(duì)照(lane 1)相比，沒(méi)有優(yōu)化的表達(dá)系統(tǒng)(lane 2)沒(méi)有目的蛋白表達(dá)。結(jié)果表明，增加釀酒酵母偏好使用的密碼子，能顯著地提高仿刺參溶菌酶基因的表達(dá)，說(shuō)明異源基因表達(dá)時(shí)，宿主體系中低頻率使用的密碼子明顯限制受體物種對(duì)外源基因表達(dá)，因此，對(duì)外源基因進(jìn)行改造，以適應(yīng)受體物種，是提高外源蛋白表達(dá)的一個(gè)重要途徑。

圖7 Western Blot檢測(cè)AjLys蛋白的表達(dá)

2.6 AjLys抑菌活性分析

采用牛津杯法測(cè)定重組仿刺參溶菌酶的抑菌活性，結(jié)果如圖8所示。與未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的陰性菌株MKP-0和未經(jīng)密碼子優(yōu)化的表達(dá)系統(tǒng)相比，經(jīng)密碼子優(yōu)化的表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌溶壁微球菌具有一定的抑菌作用。

1，陰性對(duì)照MKP-0；2，未經(jīng)密碼子優(yōu)化的表達(dá)系統(tǒng)；3，經(jīng)密碼子優(yōu)化的表達(dá)系統(tǒng)

圖8 牛津杯法檢測(cè)AjLys對(duì)溶壁微球菌的抑菌作用

Fig.8 The antimicrobial effect of AjLys onMicrococcuslysodeikticusdetected by Oxford cup

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行仿刺參溶菌酶AjLys的蛋白表達(dá)。通過(guò)對(duì)釀酒酵母密碼子水平上的優(yōu)化對(duì)AjLys基因進(jìn)行改造，構(gòu)建表達(dá)系統(tǒng)MKP-0/pESC-LEU-His6-AjLys (Δ69，77，95)，成功表達(dá)了具有活性的仿刺參溶菌酶蛋白。

但是，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與天然的AjLys相比，在蛋白產(chǎn)量及抑菌活性上都存在很大差距[15]。影響此情況的因素有很多，如基因劑量、整合位點(diǎn)、mRNA 5′和3′非翻譯區(qū)(UTR)、釀酒酵母菌的蛋白酶、培養(yǎng)的環(huán)境條件及自身胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物的加工和修飾等[10-11]。因此后續(xù)的實(shí)驗(yàn)可以通過(guò)完善培養(yǎng)條件，如半乳糖濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、轉(zhuǎn)數(shù)及溫度等條件不斷提高蛋白產(chǎn)量。今后還可以對(duì)AjLys目的基因整合到pESC-LEU載體的拷貝數(shù)、整合時(shí)AjLys兩端的酶切位點(diǎn)、宿主菌中存在蛋白酶降解的相關(guān)基因的敲除作進(jìn)一步研究。

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Expression ofApostichopusjaponicaslysozyme in recombinantSaccharomycescerevisiae

SUIRuirui,SHENMina,LICheng,ZHAOYu,CHEMingyue,ZHANGQi,CONGLina

(SchoolofBiologicalEngineering,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China)

Apostichopusjaponicuslysozyme (AjLys) was expressed bySaccharomycescerevisiae. The His-tag was inserted into the N terminus of AjLys gene based on pMD18-AjLys vector to construct the new plasmid pMD18-His6-AjLys. According to the analysis by Codon Usage Database inS.cerevisiae, AjLys gene was optimized by point mutation to obtain pMD18-His6-AjLys (Δ69, 77, 95) vector. The recombinant expression vectors pESC-LEU-His6-AjLys and pESC-LEU-His6-AjLys (Δ69, 77, 95) were constructed. AjLys protein was successfully expressed in the recombinant pESC-LEU-His6-AjLys (Δ69, 77, 95)/MKP-0 cell inducted by galactose, which was detected by Western Blot. The expressed AjLys protein displayed inhibitive effect on the growth of theMicrococcuslysodeikticus. The result showed that AjLys expression vector ofS.cerevisiaewas constructed successfully, and the active AjLys protein was expressed in MKP-0 cells, which provided a new method for the production of AjLys.

Apostichopusjaponicus; lysozyme;Saccharomycescerevisiae; codon optimization; expression

2015-12-23.

遼寧省教育廳一般科學(xué)研究項(xiàng)目(L2014217)；遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(LZ2014029)；遼寧省研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(2014-154).

隨瑞瑞(1990-),女,碩士研究生；通信作者：李 成(1985-),女,講師.

TS254.1；Q556.2

A

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